單羽火筒樹抗癌活性部位LA‑D及其藥物組合物和其化學成分分離和鑑定方法與流程

2023-10-22 20:19:02 2

本發明屬於天然產物提取分離技術領域，尤其涉及單羽火筒樹抗癌活性部位LA-D，其藥物組合物，及其化學成分分離和鑑定方法。

背景技術：
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單羽火筒樹[Leea asiatica(Linnaeus)Ridsdale]，又名九節狸，為葡萄科火筒樹屬植物。單羽火筒樹的根具有清熱利但的功能，用於治療黃疸肝炎[朱兆雲,雲南天然藥物圖鑑(第5卷).昆明:雲南科技出版社.2009:285]。本申請人調查發現，在雲南德宏，當地居民稱單羽火筒樹為「九節狸」，用其治療扁桃腺炎、三腺炎、乳房纖維瘤、子宮肌瘤、卵巢囊腫、毛囊炎等疾病。前人曾報導該植物甲醇提取物具有抗腸道寄生蟲和抗氧化的作用[Sen S,De B,Devanna N,Chakraborty R.Anthelmintic and in vitro antioxidant evaluation of fractions of methanol extract of Leea asiatica leaves.Ancient Science of Life 2012,31(3),101-106]。單羽火筒樹的化學成分及其提取物的抗癌活性尚未見報導。因此，闡明單羽火筒樹抗癌活性的化學物質基礎，對進一步的新藥研發和質量控制具有重要的意義。

技術實現要素：
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本發明針對現有技術存在了上述問題，提供單羽火筒樹[Leea asiatica(Linnaeus)Ridsdale]抗癌症活性部位LA-D，以其活性成分的藥物組合物，以及LA-D中的化學成分的提取和鑑定方法。由於單羽火筒樹具有一定的抗癌症活性，但是其活性部位及其化學成分不清楚，不能建立質量控制標準。所以，本發明提供了單羽火筒樹的活性部位乙酸乙酯部位LA-D分離鑑定方法用於解決這個技術問題。

為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案：

單羽火筒樹提取物乙酸乙酯萃取部位LA-D，所述的LA-D由下述方法製備而得：單羽火筒樹幹燥全株粉碎後用甲醇冷浸7天，過濾，濾渣繼續提取，總共提取4次，合併濾液，回收溶劑，得浸膏，將浸膏用水製成混懸液，分別用石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取，回收溶劑獲得石油醚部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分，乙酸乙酯部分為LA-D。

如所述的單羽火筒樹提取物乙酸乙酯萃取部位LA-D，其中所述的LA-D中化學成分山奈酚、山萘酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、槲皮素、異槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、楊梅素、楊梅素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、Europetin、Europetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside、(-)-兒茶素和山楂酸的總含量以重量百分比計，佔LA-D的10-95％。

如所述的單羽火筒樹提取物乙酸乙酯萃取部位LA-D，其中所述的LA-D中化學成分山奈酚、山萘酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、槲皮素、異槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、楊梅素、楊梅素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、Europetin、Europetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside、(-)-兒茶素和山楂酸是從單羽火筒樹乙酸乙酯部位LA-D分離得到，步驟為：

(1)LA-D經矽膠柱層析用20:1，15:1，10:1，5:1，3:1，1:1的氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫劃段，得到Fr.A1、Fr.A2、Fr.B1、Fr.B2、Fr.C、Fr.D、Fr.E、Fr.F、Fr.G、Fr.H等10個部分；

(2)取Fr.A1部分經C18反相矽膠柱層析，10:90→100:0的甲醇-水，得到80％甲醇洗脫部分純化得到化合物山楂酸；

(3)取Fr.B1部分經C18反相矽膠柱層析，10:90→100:0的甲醇-水，得到5％甲醇洗脫部分，過LH-20凝膠柱層析，甲醇洗脫後得到B1-2-3和B1-2-5兩個主要部分。B1-2-3經半製備高效液相色譜純化得到山奈酚、山萘酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、Europetin和Europetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside；B1-2-5經半製備高效液相色譜純化得到(-)-兒茶素；

(4)取Fr.B2部分和Fr.C部分合併後經C18反相矽膠柱層析，10:90→100:0的甲醇-水，得到15％和20％甲醇洗脫部分。15％甲醇洗脫部分用半製備高效液相色譜純化得到異槲皮苷；20％甲醇洗脫部分經LH-20凝膠柱層析得到槲皮素、楊梅素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷和一個混合物，後者經半製備高效液相色譜純化得到楊梅素；

(5)取Fr.D部分和Fr.E部分合併後經C18反相矽膠柱層析，10:90→100:0的甲醇-水，得到40％甲醇洗脫部分，40％甲醇洗脫部分經LH-20凝膠層析柱得到槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷；

其中，(3)所述B1-2-3的半製備高效液相色譜是用安捷倫1200液相色譜儀，Ultimate AQ-C18色譜柱，色譜柱大小4.6×300mm，洗脫劑為甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，比例40:60，流速2mL/min；B1-2-5的半製備高效液相色譜是用安捷倫1200液相色譜儀，Ultimate AQ-C18色譜柱，色譜柱大小4.6×300mm，洗脫劑為甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，比例15:85，流速2mL/min；(4)所述15％甲醇洗脫部分的半製備高效液相色譜是用安捷倫1200液相色譜儀，Ultimate AQ-C18色譜柱，色譜柱大小4.6×300mm，洗脫劑為甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，比例15:85，流速2mL/min；20％甲醇洗脫部分的半製備高效液相色譜是用安捷倫1200液相色譜儀，Ultimate AQ-C18色譜柱，色譜柱大小4.6×300mm，洗脫劑為甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，比例30:70，流速2mL/min。

本發明還提供了一種藥物組合物，其中含有治療有效量的所述的單羽火筒樹乙酸乙酯萃取部位LA-D和藥學上可接受的載體。

本發明另外還提供了一種單羽火筒樹乙酸乙酯萃取部位LA-D的化學成分分離鑑定方法，該方法是從單羽火筒樹乙酸乙酯萃取部位LA-D分離得到山奈酚、山萘酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、槲皮素、異槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、楊梅素、楊梅素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、Europetin、Europetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside、(-)-兒茶素和山楂酸，其步驟為：

(1)LA-D經矽膠柱層析用20:1，15:1，10:1，5:1，3:1，1:1的氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫劃段，得到Fr.A1、Fr.A2、Fr.B1、Fr.B2、Fr.C、Fr.D、Fr.E、Fr.F、Fr.G、Fr.H等10個部分；

(2)取Fr.A1部分經C18反相矽膠柱層析，10:90→100:0的甲醇-水，得到80％甲醇洗脫部分純化得到化合物山楂酸(maslinic acid)；

(3)取Fr.B1部分經C18反相矽膠柱層析，10:90→100:0的甲醇-水，得到5％甲醇洗脫部分，過LH-20凝膠柱層析，甲醇洗脫後得到B1-2-3和B1-2-5兩個主要部分。B1-2-3經半製備高效液相色譜純化得到山奈酚、山萘酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、Europetin和Europetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside；B1-2-5經半製備高效液相色譜純化得到(-)-兒茶素；

(4)取Fr.B2部分和Fr.C部分合併後經C18反相矽膠柱層析，10:90→100:0的甲醇-水，得到15％和20％甲醇洗脫部分。15％甲醇洗脫部分用半製備高效液相色譜純化得到異槲皮苷(isoquercitrin)；20％甲醇洗脫部分經LH-20凝膠柱層析得到槲皮素、楊梅素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷和一個混合物，後者經半製備高效液相色譜純化得到楊梅素；

(5)取Fr.D部分和Fr.E部分合併後經C18反相矽膠柱層析，10:90→100:0的甲醇-水，得到40％甲醇洗脫部分。40％甲醇洗脫部分經LH-20凝膠層析柱得到槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷；

其中，(3)所述B1-2-3的半製備高效液相色譜是用安捷倫1200液相色譜儀，Ultimate AQ-C18色譜柱，色譜柱大小4.6×300mm，洗脫劑為甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，比例40:60，流速2mL/min；B1-2-5的半製備高效液相色譜是用安捷倫1200液相色譜儀，Ultimate AQ-C18色譜柱，色譜柱大小4.6×300mm，洗脫劑為甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，比例15:85，流速2mL/min；(4)所述15％甲醇洗脫部分的半製備高效液相色譜是用安捷倫1200液相色譜儀，Ultimate AQ-C18色譜柱，色譜柱大小4.6×300mm，洗脫劑為甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，比例15:85，流速2mL/min；20％甲醇洗脫部分的半製備高效液相色譜是用安捷倫1200液相色譜儀，Ultimate AQ-C18色譜柱，色譜柱大小4.6×300mm，洗脫劑為甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，比例30:70，流速2mL/min。

根據所述的一種單羽火筒樹乙酸乙酯萃取部位LA-D的化學成分分離鑑定方法，該方法從LA-D中分離得到11個化合物，通過質譜MS及核磁共振波普NMR對其進行化學結構的確定。

根據所述的一種單羽火筒樹乙酸乙酯萃取部位LA-D的化學成分分離鑑定方法，該方法從LA-D中分離提取得到化學成分山奈酚、山萘酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、槲皮素、異槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、楊梅素、楊梅素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、Europetin、Europetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside、(-)-兒茶素和山楂酸，用於建立LA-D的質量控制標準。

本發明同時還提供了所述的單羽火筒樹乙酸乙酯萃取部位LA-D在製備治療或預防癌症疾病的藥物中的應用。

根據所述的單羽火筒樹乙酸乙酯萃取部位LA-D在製備治療或預防癌症疾病的藥物中的應用，其所述的癌症為白血病、肝癌、肺癌。

本發明的乙酸乙酯萃取部位用作藥物時，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。也可以與其他藥物組成複方的形式使用，該藥物組合物含有10～99％，優選為30～90％的本發明的乙酸乙酯萃取部位，其餘為藥物學上可接受的，對人和動物無毒和惰性的藥物製劑常用的藥用載體和/或賦形劑。將本發明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。可以使用不同的藥用輔料，製成固體製劑(片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑等)或液體製劑(注射劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、糖漿劑等)。本發明的藥物可經口服和注射(靜脈注射、靜脈滴注、肌肉注射、皮下注射等)形式給藥。

與現有技術相比，本發明具有下述的優異效果：單羽火筒樹提取物，特別是乙酸乙酯部位(LA-D)對白血病HL-60細胞、肝癌SMMC-7721細胞、肺癌A-549細胞有抑制活性。本發明首次闡明了單羽火筒樹抗癌活性部位LA-D的主要化學成分，這些成分可以用於制定LA-D的質量控制標準。

具體實施方式：

下面用本發明的實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但並不以此來限定本發明。

實施例1：

本發明的LA-D的製備及其所含化學成分的分離：

LA-D的製備：單羽火筒樹的乾燥全株(1.3kg)粉碎後用甲醇(4L)浸泡7天，過濾，濾渣繼續提取。總共提取4次，合併濾液，回收溶劑，得浸膏(編號LA)167g。將LA用水(500mL)製成混懸液，分別用石油醚(0.5L×3)、氯仿(0.5L×3)萃取，萃取後的母液繼續用乙酸乙酯(0.5L×3)萃取，回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯萃取部位(編號LA-D)18g。

LA-D所含化學成分的分離：

取重量為18g的LA-D經矽膠柱層析用氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫劃段(20:1，15:1，10:1，5:1，3:1，1:1)的，得到Fr.A1(1.34g)、Fr.A2(1.54g)、Fr.B1(1.40g)、Fr.B2(0.67g)、Fr.C(2.38g)、Fr.D(4.77g)、Fr.E(0.47g)、Fr.F(0.83g)、Fr.G(0.68g)、Fr.H(0.51g)等10個部分；

取Fr.A1部分1.34g過C18反相矽膠柱層析甲醇-水(10:90→100:0)洗脫，得到80％甲醇洗脫部分，純化得到化合物山楂酸(3.0mg)。取Fr.B1部分1.40g經C18反相矽膠柱層析甲醇-水(10:90→100:0)洗脫，得到5％甲醇洗脫部分690.4mg，過LH-20凝膠柱層析，甲醇洗脫後得到B1-2-3(157.0mg)和B1-2-5(222.4mg)兩個主要部分。B1-2-3經半製備高效液相色譜[安捷倫1200，Ultimate AQ-C18色譜柱，4.6×300mm；甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，40:60，流速2mL/min]純化得到山奈酚(3.1mg，保留時間11.368min)、山萘酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(5.1mg，保留時間4.980min)、Europetin(3.0mg，保留時間16.187min)和Europetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside(3.0mg，保留時間33.208min)；B1-2-5經半製備高效液相色譜[安捷倫1200，Ultimate AQ-C18色譜柱，4.6×300mm；甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，15:85，流速2mL/min]純化得到(-)-兒茶素(3.3mg，保留時間8.284min)。取Fr.B2部分0.67g和Fr.C部分2.38g合併後為3.05g經C18反相矽膠柱層析甲醇-水(10:90→100:0)得到15％(362.1mg)和20％(368mg)甲醇洗脫部分。15％甲醇洗脫部分用半製備高效液相色譜[安捷倫1200，Ultimate AQ-C18色譜柱，4.6×300mm；甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，15:85，流速2mL/min]純化得到異槲皮苷(isoquercitrin，3.0mg，保留時間37.685min)；20％甲醇洗脫部分經LH-20凝膠柱層析得到槲皮素(1.9mg)、楊梅素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(5.1mg)和一個混合物(48.6mg)，後者經半製備高效液相色譜[安捷倫1200，Ultimate AQ-C18色譜柱，4.6×300mm；甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，30:70，流速2mL/min]純化得到楊梅素(5.3mg，保留時間12.082min)。取Fr.D部分4.77g和Fr.E部分0.47g合併後為4.91g經C18反相矽膠柱層析甲醇-水(10:90→100:0)得到40％(599.8mg)甲醇洗脫部分。40％甲醇洗脫部分經LH-20凝膠層析柱得到槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(quercitrin，18.3mg)。

實施例2

本發明的LA-D化學成分的結構鑑定：

山奈酚(kaempferol)，黃色針狀晶體，分子式C15H10O6，CAS登記號520-18-3。1H NMR(CD3OD,400MHz)δ:6.19(1H,s),6.41(1H,s),6.91(2H,d,J＝8.6Hz),8.10(2H,d,J＝8.6Hz)。13C NMR(CD3OD,125MHz)δ:179.4,165.6,162.5,160.6,158.3,148.1,136.5,130.7,130.7,123.7,116.3,116.3,104.5,99.2,99.4。ESI-MS m/z 285[M-H]-。其1H NMR跟文獻[Chang Y C,Chang F R,Wu Y C.The constituents of Lindera glauca.Journal of the Chinese Chemical Society,2000,47(2),373-380.]中有報導的一致。

山萘酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷，黃色粉末，分子式C21H20O10，CAS登記號5041-73-6。1H NMR(CD3OD,400MHz)δ:6.21(1H,d,J＝2.0Hz),6.39(1H,d,J＝2.0Hz),7.77(2H,d,J＝8.8Hz),6.93(2H,d,J＝8.8Hz),5.38(1H,d,J＝1.6Hz),0.92(1H,d,J＝5.7Hz)。13C NMR(CD3OD,125MHz)δ:179.6,165.8,162.2,161.6,159.3,158.6,136.2,131.8,131.8,122.6,123.7,116.5,116.5,105.9,103.5,99.8,94.7,73.2,72.1,72.0,71.9,17.7。ESI-MS m/z 430[M-H]-。其NMR數據跟文獻[汪瓊,王易芬,鞠鵬,羅士德.錐序蜜心果中酚性成分的研究(英文).天然產物研究與開發,2008,4:641-643]中的數據基本一致。

槲皮素(quercetin)，黃色顆粒狀結晶，分子式C15H10O7，CAS登記號117-39-5。1H NMR(CD3OD,400MHz)δ:6.18(1H,d,J＝2.1Hz),6.37(1H,d,J＝2.1Hz),7.63(1H,dd,J＝8.8Hz),7.78(1H,d,J＝2.0Hz)。13C NMR(CD3OD,125MHz)δ:177.4,165.6,162.5,158.2,148.8,147.9,146.2,136.8,124.1,121.6,116.2,115.9,104.5,99.2,94.4。ESI-MS m/z 301[M-H]-。其NMR數據跟文獻[Chang Y C,Chang F R,Wu Y C.The constituents of Lindera glauca.Journal of the Chinese Chemical Society,2000,47(2),373-380.]中的數據基本一致。

異槲皮苷(isoquercitrin)，黃色粉末，分子式C21H20O12，CAS登記號21637-25-2。1H NMR(CD3OD,500MHz)δ7.84(1H,d,J＝2.1Hz),7.59(1H,dd,J＝8.5,2.1Hz),6.86(1H,d,J＝8.5Hz),6.41(1H,s),6.21(1H,d,J＝1.8Hz),5.17(1H,d,J＝7.8Hz),3.87–3.43(7H,m)。13C NMR(CD3OD,125MHz)δ:179.5,166.1,163.0,158.8,158.5,149.9,145.8,135.7,122.9,122.8,117.7,116.1,105.6,105.3,99.8,94.6,77.2,75.1,73.1,69.3,61.9。ESI-MS m/z 463[M-H]-。其NMR數據與文獻[王志偉,譚曉傑,馬婷婷,陳曉輝,畢開順.茵陳化學成分的分離與鑑定.瀋陽藥科大學學報,2008,25(10):781-783]中的數據基本一致。

槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(quercitrin)，黃色針晶，分子式C21H20O11，CAS登記號522-12-3。1H NMR(500MHz,CD3OD)δ7.39–7.23(m,2H),6.97–6.80(m,1H),6.43–6.11(m,2H),5.35(d,J＝1.6Hz,1H),4.46–4.09(m,1H),3.95–3.66(m,1H),3.65–3.11(m,5H),0.94(d,J＝6.2Hz,3H)。13C NMR(CD3OD,125MHz)δ:179.6,165.8,163.2,159.3,158.5,149.8,146.4,136.2,122.9,122.8,116.9,116.4,105.8,103.5,99.8,94.6,77.2,75.1,73.1,69.3,61.9。ESI-MS m/z 447[M-H]-。其NMR數據與文獻[楊秀嶺,袁志芳,許慧君,範麗芳,霍長虹,張蘭桐.照山白黃酮類化學成分的研究.藥物分析雜誌,2010,30(9):1750-1752]中的數據基本一致。

楊梅素(myricetin)，黃色針狀晶體，分子式C15H10O8，CAS登記號529-44-2。1H NMR(CD3OD,500MHz)δ7.33(1H,s),6.37(1H,d,J＝2.1Hz),6.17(1H,d,J＝2.1Hz)。13C NMR(CD3OD,125MHz)δ177.3,165.6,162.5,158.2,147.9,146.7,137.4,136.9,123.1,108.5,104.5,99.2,94.3。ESI-MS m/z 316[M-H]-。其NMR數據與文獻[周志宏,楊崇仁.矮楊梅鮮葉的酚性化學成分.雲南植物研究,2000,22(2):6219-224]中的數據基本一致。

楊梅素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷，黃色片狀晶體，分子式C21H20O12，CAS登記號17912-87-7。1H NMR(CD3OD,500MHz)δ6.94(2H,s),6.36(1H,d,J＝2.1Hz),6.20(1H,d,J＝2.1Hz),5.31(1H,d,J＝1.5Hz),4.21(1H,dd,J＝3.3,1.7Hz),3.78(1H,dd,J＝9.5,3.4Hz),3.51(1H,m),3.30(1H,t,J＝9.2Hz),0.96(3H,d,J＝6.2Hz)。13C NMR(CD3OD,125MHz)δ179.7,165.8,163.2,159.4,158.5,146.8,137.8,136.3,121.8,105.8,103.6,99.7,94.6,73.3,72.1,72.0,71.8,17.6。ESI-MS m/z 463[M-H]-。其NMR數據與文獻[Chung S K,Kim Y C,Takaya Y,Terashima,K.,&Niwa,M.Novel flavonol glycoside,7-O-methyl mearnsitrin,from Sageretia theezans and its antioxidant effect.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2004,52(15),4664-4668]中的數據基本一致。

Europetin，分子式C16H12O8，CAS登記號16280-27-6。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ7.30(2H,s),6.36(1H,s),3.85(3H,s)。13C NMR(CDCl3,100MHz)δ175.5,164.6,160.1,155.7,147.1,145.5,135.9,135.8,120.5,107.2,103.6,97.2,91.5,55.8。ESI-MS m/z 331[M-H]-。其13C NMR數據與文獻[Matsuda H,Morikawa T,Toguchida I,Yoshikawa,M.Structural requirements of flavonoids and related compounds for aldose reductase inhibitory activity.Chemical and Pharmaceutical Bulletin,2002,50(6),788-795]中的數據基本一致。

Europetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside，分子式C22H22O12。1H NMR(CD3OD,500MHz)δ6.86(2H,s),6.35(1H,d,J＝1.8Hz),6.19(1H,d,J＝2.0Hz),5.29(1H,d,J＝1.6Hz),4.20(1H,dd,J＝3.3,1.7Hz),3.85(s,4H),0.92(3H,t,J＝5.6Hz)。13C NMR(CD3OD,125MHz)δ179.5,165.9,163.1,158.9,158.4,151.8,149.4,139.4,136.6,126.8,109.6,105.8,103.5,99.7,94.6,73.0,71.9,71.7,60.7,17.6。ESI-MS m/z 477[M-H]-。其NMR數據與文獻[Chung S K,Kim Y C,Takaya Y,Terashima,K.,&Niwa,M.Novel flavonol glycoside,7-O-methyl mearnsitrin,from Sageretia theezans and its antioxidant effect.Journal of agricultural and food chemistry,2004,52(15),4664-4668]中的數據基本一致。

(-)-兒茶素(ent-catechin)，白色粉末，分子式C15H14O6，CAS登記號18829-70-4。[α]D26-11.9°(c＝0.33,MeOH)。1H NMR(CD3OD,500MHz)δ6.84(1H,d,J＝2.0Hz),6.78–6.74(1H,m),6.72(1H,dd,J＝8.3,2.0Hz),5.93(1H,d,J＝2.0Hz),5.85(1H,d,J＝2.3Hz),4.56(1H,d,J＝7.5Hz),3.97(1H,td,J＝8.0,5.5Hz),2.85(1H,dd,J＝16.1,5.4Hz),2.50(1H,dd,J＝16.1,8.2Hz)。13C NMR(CD3OD,125MHz)δ157.8,157.6,156.9,146.3,146.3,132.2,120.0,116.1,115.2,100.8,96.3,95.5,82.9,68.1,28.53。ESI-MS m/z 289[M-H]-。其NMR數據與文獻[李勇軍,何迅,劉麗娜,蘭燕宇,王愛民,王永林.葒草化學成分的研究.中國中藥雜誌,2005,30(6):444-446]中的數據基本一致。

山楂酸(maslinic acid)，白色粉末，分子式C30H48O4，CAS登記號4373-41-5。1H NMR(CD3OD,500MHz)δ5.24(1H,m),3.64(1H,m),3.30(1H,m),1.32(3H,m),1.12(3H,s),1.01(3H,s),0.96(3H,s),0.87(3H,s),0.84(3H,s),0.84(3H,s)。13C NMR(CD3OD,125MHz)δ181.6,139.7,126.7,84.4,69.5,56.6,48.9,48.8,48.6,48.5,43.3,40.8,40.5,40.4,39.2,38.1,34.2,31.7,30.8,29.3,29.1,25.3,24.4,24.1,21.6,19.5,17.8,17.6,17.5,17.2。ESI-MS m/z 471[M-H]-。其NMR數據與文獻[王東,崔徵,董炎,付明耀,宋德蘭.榆樹根皮的化學成分.瀋陽藥科大學學報,2004,21(6):426-429]中的數據基本一致。

實施例3：

單羽火筒樹提取物乙酸乙酯部位(LA-D)對腫瘤細胞生長抑制作用：

1.將LA-D進行分段。

取重量為18g的LA-D經矽膠柱層析用氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫劃段(20:1，15:1，10:1，5:1，3:1，1:1)的，得到Fr.A1(1.34g)、Fr.A2(1.54g)、Fr.B1(1.40g)、Fr.B2(0.67g)、Fr.C(2.38g)、Fr.D(4.77g)、Fr.E(0.47g)、Fr.F(0.83g)、Fr.G(0.68g)、Fr.H(0.51g)等10個部分；

2.從重量大的部分中取少量樣品，利用柱層析及半製備高效液相色譜技術快速獲取化學成分。

取Fr.A1部分1.34g，過C18反相矽膠柱層析(甲醇-水洗脫)，得到80％甲醇洗脫部分，過LH-20凝膠柱層析(甲醇洗脫)純化得到化合物山楂酸(3.0mg)。取Fr.B1部分1.40g經C18反相矽膠柱層析(甲醇-水洗脫)，得到5％甲醇洗脫部分690.4mg，過LH-20凝膠柱層析(甲醇洗脫)，後得到B1-2-3(157.0mg)和B1-2-5(222.4mg)兩個主要部分。

取B1-2-3經半製備高效液相色譜(安捷倫1200，Ultimate AQ-C18色譜柱，4.6×300mm；甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，40:60，流速2mL/min)純化得到山奈酚(3.1mg，保留時間11.368min)、山萘酚-3-O-α-l-吡喃鼠李糖苷(5.1mg，保留時間4.980min)、Europetin(3.0mg，保留時間16.187min)和Europetin 3-O-α-l-rhamnopyranoside(3.0mg，保留時間33.208min)。

取B1-2-5經半製備高效液相色譜(安捷倫1200，Ultimate AQ-C18色譜柱，4.6×300mm；甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，15:85，流速2mL/min)純化得到(-)-兒茶素(3.3mg，保留時間8.284min)。

取Fr.B2部分0.67g和Fr.C部分2.38g合併後為3.05g經C18反相矽膠柱層析(甲醇-水洗脫)得到15％(362.1mg)和20％(368mg)甲醇洗脫部分

取15％甲醇洗脫部分用半製備高效液相色譜(安捷倫1200，Ultimate AQ-C18色譜柱，4.6×300mm；甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，15:85，流速2mL/min)純化得到異槲皮苷(isoquercitrin)(3.0mg，保留時間37.685min)。

取20％甲醇洗脫部分經LH-20凝膠柱層析(甲醇洗脫)得到槲皮素(1.9mg)、楊梅素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(5.1mg)和一個混合物(48.6mg)，後者經半製備高效液相色譜(安捷倫1200，Ultimate AQ-C18色譜柱，4.6×300mm；甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，30:70，流速2mL/min)純化得到楊梅素(5.3mg，保留時間12.082min)。

取Fr.D部分4.77g和Fr.E部分0.47g合併後為4.91g經C18反相矽膠柱層析(甲醇-水洗脫)得到40％(599.8mg)甲醇洗脫部分。40％甲醇洗脫部分經LH-20凝膠層析柱(甲醇洗脫)得到槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(quercitrin)(18.3mg)。

本次發明首闡明了單羽火筒樹抗癌活性部位LA-D的主要化學成分，這些成分可以用於制定LA-D的質量控制標準。

將單羽火筒樹及經過處理的各部位進行細胞毒活性測試，結果見表1，結果表明，乙酸乙酯萃取部位(LA-D)對白血病HL-60細胞、肝癌SMMC-7721細胞、肺癌A-549細胞有抑制活性。

表1單羽火筒樹提取物乙酸乙酯萃取部位(LA-D)對腫瘤細胞生長抑制作用

實施例4：

注射液製劑的製備：

按實施例1的方法先製得本發明的單羽火筒樹提取物乙酸乙酯萃取部位(LA-D)，按常規加注射用水，精濾，灌封滅菌製成注射液。

實施例5：

粉針劑的製備：

按實施例1的方法先製得本發明的單羽火筒樹提取物乙酸乙酯萃取部位(LA-D)，將其溶於無菌注射用水中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏鬥過濾，再無菌精濾，分裝於2安瓿中，低溫冷凍乾燥後無菌熔封得粉針劑。

實施例6：

粉劑的製備：

按實施例1的方法先製得本發明的單羽火筒樹提取物乙酸乙酯萃取部位(LA-D)，與賦形劑重量比為9:1的比例加入賦形劑，製成粉劑。

實施例7：

片劑的製備：

按實施例1的方法先製得本發明的單羽火筒樹提取物乙酸乙酯萃取部位(LA-D)，按其與賦形劑重量比為1:5‐1:10的比例加入賦形劑，制粒壓片。

實施例8：

口服液製劑的製備：

按實施例1的方法先製得本發明的單羽火筒樹提取物乙酸乙酯萃取部位(LA-D)，按常規口服液製法製成口服液。

實施例9：

膠囊劑、顆粒劑、或衝劑的製備：

按實施例1的方法先製得本發明的單羽火筒樹提取物乙酸乙酯萃取部位(LA-D)，按其與賦形劑重量比為5:1的比例加入賦形劑，製成膠囊或顆粒劑或衝劑。