一種用於檢測酪氨酸酶的螢光探針及其製備方法與應用與流程
2023-10-06 06:35:59 1
本發明屬於分子檢測和分子成像領域，涉及一種用於檢測酪氨酸酶的螢光探針及其製備方法與應用。
背景技術：
酪氨酸酶是酪氨酸合成的關鍵酶，可特異性催化生物酚類的羥化以及進一步的醌化反應，在多種生理學過程中都發揮著至關重要的作用。在臨床上，酪氨酸酶是黑色素癌的重要標誌物。另外，酪氨酸酶被認為與白化病以及帕金森疾病有重要關係。由此可見，酪氨酸酶的檢測具有非常重要的意義。由於目前用來檢測酪氨酸酶螢光探針以及試劑盒存在易受活性氧物質幹擾等弊端，因此，發展一種含有新型識別基團且不受活性氧物質幹擾的檢測酪氨酸酶的螢光探針具有非常大的應用價值。
半菁骨架因其具有長的波長和良好的穩定性而被廣泛應用於生物分析中，而基於半菁檢測酪氨酸酶的且不受活性氧物質幹擾的螢光探針尚未見報導。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種用於檢測酪氨酸酶的螢光探針及其製備方法與應用。
本發明提供的螢光探針，其結構式為式Ⅰ。
本發明還提供了上述化合物式Ⅰ的製備方法，包括如下步驟：將式II所示半菁與氫化鈉於有機溶劑中混合後攪拌，再加入3-羥基苄溴進行反應，反應完畢得到所述式I所示化合物，為深藍色固體粉末；
上述方法的攪拌步驟中，攪拌的時間為10-20分鐘，具體為15分鐘；
所述攪拌的步驟在惰性氣氛或氬氣氣氛中進行；
所述有機溶劑為甲醇、乙醇、四氫呋喃、乙腈、二甲基亞碸或N,N-二甲基甲醯胺；
所述反應步驟中，溫度為50～70℃，具體為60℃；時間為12～24h；
式II所示半菁與氫化鈉的投料摩爾比為1：2-3；
式II所示半菁與3-羥基苄溴的投料摩爾比為1：1-4，具體為1：2。
另外，上述本發明提供的式I所示化合物在製備螢光探針或製備用於檢測酪氨酸酶的螢光探針中的應用及在酪氨酸酶檢測和/或酪氨酸酶成像中的應用，也屬於本發明的保護範圍。
所述檢測中，激發波長為670nm；發射波長為708nm。
本發明還要求保護一種酪氨酸酶檢測試劑盒，它包括酪氨酸酶檢測的螢光探針和溶劑組成的螢光探針儲備液；
所述酪氨酸酶檢測的螢光探針為所述式I所示化合物。
所述試劑盒中，所述酪氨酸酶檢測的螢光探針在所述螢光探針儲備液中的摩爾濃度為0.01～10mM，具體為0.2mM；
所述溶劑選自甲醇和二甲基亞碸中的至少一種。
本發明提供的檢測待測樣品中酪氨酸酶含量的方法，包括如下步驟：
1)製作標準曲線：
以670nm為激發波長，測定一系列不同濃度的酪氨酸標準反應液在發射波長為708nm處的螢光強度，記為F；
並測定試劑空白在發射波長為708nm處的螢光強度，記為F0，以酪氨酸酶的濃度C為橫坐標，以螢光強度變化值ΔF＝F-F0為縱坐標，繪製標準曲線；
所述一系列不同濃度的酪氨酸酶標準反應液為將式I所示化合物的溶液、酪氨酸酶的標準儲備溶液和緩衝液混合進行反應3h-7h後而得；
2)檢測待測樣品中酪氨酸酶的含量：
將所述步驟1)中所述酪氨酸酶的標準儲備溶液替換為待測樣品的水溶液，按照所述步驟1)所述方法檢測所述待測樣品在發射波長為708nm處的螢光強度，記為F'；同時測定試劑空白在發射波長為708nm處的螢光強度，記為F0'；
將(F'-F0')帶入所述步驟1)所得標準曲線，即得到所述待測樣品中酪氨酸酶的濃度，進而得到所述待測樣品中酪氨酸酶的含量。
上述方法中，所述一系列不同濃度的酪氨酸酶標準反應液中，所述酪氨酸酶的濃度為0～80U/mL，具體濃度依次可為0、10、20、40、60和80U/mL；
所述一系列不同濃度的酪氨酸酶標準反應液的體積均為2mL；
所述式I所示化合物的溶液中，式I所示化合物的摩爾濃度為0.01～10mM，具體可為200μM；
溶劑選自甲醇和二甲基亞碸中的至少一種；
所述式I所示化合物的溶液的體積均為50μL；
所述酪氨酸酶的標準儲備溶液為酪氨酸酶的水溶液；濃度為1000U/mL；
所述緩衝液為pH值為6～9的磷酸鹽緩衝液；所述磷酸鹽選自Na2HPO4、NaH2PO4和KH2PO4中的至少一種；所述磷酸鹽的濃度為0.01～0.5M；
所述步驟1)所得標準曲線對應的線性回歸方程為：ΔF＝3.25C+6.40，R＝0.991，其中，ΔF為螢光強度變化值，ΔF＝F-F0；C為酪氨酸酶的濃度，單位為U/mL。
另外，上述本發明提供的試劑盒在酪氨酸酶檢測或生物樣品分析中的應用，也屬於本發明的保護範圍；
其中，所述生物樣品具體為細胞，更具體可為人宮頸癌細胞HeLa或鼠黑色素瘤細胞B16細胞；
所述酪氨酸酶檢測或生物樣品分析中，所述酪氨酸酶檢測的螢光探針的測試濃度具體為100nM-20μM，如5μM。
本發明製備出了基於半菁的長波長的螢光探針(式Ⅰ)，該探針可選擇性地被酪氨酸酶羥基化從而實現對該酶的測定；而且，本發明探針(式Ⅰ)製備的試劑盒能用於細胞酪氨酸酶的檢測。
本發明具有以下優點：
1、本發明螢光探針是紫色的固體，在溶液中呈淺紫色，與酪氨酸酶反應後，肉眼即可觀察到溶液變為明顯的藍色。
2、本發明具有長的螢光激發波長(670nm)和發射波長(708nm)
3、本發明對酪氨酸酶的響應呈線性關係，可以用於該酶的定量測定。
4、本發明應用時顯色反應僅在酪氨酸酶存在的條件下發生，其它常見的無機鹽、胺基酸、水解酶，特別活性氧物質等均不產生幹擾。
5、本發明化合物溶解性好，其用有機溶劑配成的母液試劑盒可直接用於緩衝體系中酪氨酸酶的檢測。
6、本發明具備好的生物相容性，可用於細胞酪氨酸酶的檢測；因此，該探針是一種優良的可廣泛用於酪氨酸酶檢測的分析試劑。
7、本發明具有操作簡便，成本低，檢測波長等優點，易於推廣和應用。
附圖說明
圖1為本發明式I所示化合物的化學反應方程式與合成路線。
圖2為本發明試劑盒對酪氨酸酶的紫外可見吸收及顏色響應圖，其中圖2a為式Ⅰ所示化合物(5μM)的吸收光譜，圖2b為式Ⅰ所示化合物(5μM)與酪氨酸酶(200U/mL)反應後的吸收光譜。
圖3為本發明試劑盒對不同濃度酪氨酸酶的螢光響應圖，酪氨酸酶的濃度從下到上依次為0,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100和200U/mL。
圖4為本發明試劑盒的螢光增量對酪氨酸酶濃度的標準曲線。
圖5為本發明試劑盒對不同的氧化性物質響應的柱狀圖。
圖6為本發明試劑盒分別用於HeLa和B16細胞的共聚焦成像圖。
圖7為本發明試劑盒分別用於正常培養的B16細胞以及預先與抑制劑孵育過的B16細胞的共聚焦成像圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步闡述，但本發明並不限於以下實施例。所述方法如無特別說明均為常規方法。所述原材料如無特別說明均能從公開商業途徑獲得。
實施例1、酪氨酸酶檢測的螢光探針(式Ⅰ)的製備
按照圖1所示的化學反應流程圖進行製備。
步驟1)：將0.78mmol間苯二酚溶於乙腈中，加入0.78mmol的碳酸鉀，在Ar氣保護下，繼續攪拌15分鐘後，加入0.31mmol IR-780，60℃下繼續反應5小時，過濾，然後濾液減壓蒸乾，得到的粗產品。用柱層析分離提純得到半菁，為紫色固體。
步驟2)：將0.5mmol半菁溶於無水乙腈中，然後加入1mmol的氫化鈉，在Ar氣保護下攪拌15分鐘，然後再加入3-羥基苄溴。60℃下反應12小時後，減壓蒸乾，得到的粗產品。用層析分離，得到最終產物(式Ⅰ)，產品為紫色固體。
結構確證結果如下：1H NMR(400MHz,298K,CDCl3):δ8.60(d,J＝14.4Hz,1H),7.88(d,J＝6.8Hz,1H),7.44(s,1H),7.40-7.34(m,2H),7.32(t,J＝7.6Hz,2H),7.20(s,1H),7.10(t,J＝7.6Hz,1H),6.96(d,J＝7.6Hz,1H),6.90(t,J＝3.2Hz,1H),6.79(t,J＝8.0Hz,2H),6.32(d,J＝14.8Hz,1H),4.30(t,J＝6.8Hz,2H),2.69(d,J＝19.2Hz,4H),1.96-1.91(m,4H),1.83(s,6H),1.07(t,J＝7.2Hz,3H).13C-NMR(100MHz,298K,CDCl3):δ177.8,162.5,161.8,158.4,154.3,145.8,142.1,141.2,137.0,134.2,129.6,128.8,128.6,127.5,126.8,123.9,116.8,115.9,115.5,115.4,114.5,114.1,112.0,103.1,101.5,71.1,51.0,47.0,29.0,28.3,24.2,21.2,20.3,11.6.HR-ESI-MS,calcd for C35H36NO3[M]+:m/z 518.26897；found:m/z 518.26860.
由上述譜圖數據，可確認本實施例製備得到的化合物的結構如下：
實施例2、酪氨酸酶檢測試劑盒的製備
稱取1.29mg實施例1所得式I所示化合物作為螢光探針，溶於10mL溶劑二甲基亞碸，配成螢光探針儲備液(又稱母液，0.2mM)，即得到酪氨酸酶檢測試劑盒。
本發明試劑盒檢測酪氨酸酶具體按照以下步驟進行：
1)製作標準曲線：
以670nm為激發波長，測定酪氨酸酶的濃度分別為0、10、20、40、60和80U/mL的酪氨酸酶標準反應液各2mL，在發射波長為708nm處的螢光強度，記為F；
並測定試劑空白在發射波長為708nm處的螢光強度，記為F0；
以酪氨酸酶的濃度C為橫坐標，螢光強度變化值ΔF＝F-F0為縱坐標，繪製標準曲線；
上述一系列不同濃度的酪氨酸酶標準反應液各由0.2mM的酪氨酸酶試劑盒中的螢光探針儲備液50μL、酪氨酸酶標準儲備溶液(溶劑為水，濃度為1000U/mL)和緩衝液混勻而得，所述緩衝液為pH值為7.4的0.01M Na2HPO4緩衝液；
2)檢測待測樣品中酪氨酸酶的含量：
將上述步驟1)中酪氨酸酶標準儲備溶液替換為待測樣品，按照上述步驟1)所述方法檢測所述待測樣品在發射波長為670nm處的螢光強度，記為F'；
同時測定試劑空白在發射波長為708nm處的螢光強度，記為F0'；
將所述F'-F0'帶入所述步驟1)所得標準曲線，即可得到待測樣品中酪氨酸酶的含量。
光譜性質的檢測：將125μL的上述母液滴加到一定量的0.01M磷酸鹽緩衝溶液中，然後加入不同量的酪氨酸酶溶液，再用0.01M的磷酸鹽緩衝溶液定容到5mL。37℃反應3小時後，測量其螢光發射光譜。螢光發射光譜測定時以670nm激發；激發和發射狹縫寬度均為10nm；電壓700V。
如圖2所示為本發明試劑盒對酪氨酸酶的紫外可見吸收及顏色響應圖。圖2a為式Ⅰ所示化合物(5μM)的吸收光譜，b為式Ⅰ所示化合物(5μM)與酪氨酸酶(200U/mL)反應後的吸收光譜。
如圖3所示為本發明試劑盒對酪氨酸酶的螢光響應圖，酪氨酸酶濃度範圍為0-200U/mL。圖3中酪氨酸酶的濃度從下到上依次為0,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100和200U/mL。
如圖4所示為本發明試劑盒對酪氨酸酶濃度的標準曲線，酪氨酸酶濃度範圍為0-80U/mL。
如圖5所示為本發明試劑盒對氧化性物質的響應柱狀圖，氧化性物質的濃度為100μM，式Ⅰ所示化合物的濃度為5μM。
以上實驗說明本試劑盒具有如下特點：
1、由圖2可知，探針在溶液中呈現淺紫色，但隨著酪氨酸酶的加入，溶液變為藍色，在708nm處產生螢光；
2、由圖3可知，螢光強度隨酪氨酸酶濃度的增加而增強；
3、由圖4可知，使用5μM的螢光探針時，螢光增量與酪氨酸酶的濃度在0～80U/mL範圍內呈線性關係，可用於酪氨酸酶的定量測定。將螢光探針的濃度由5μM替換為100nM-20μM時，螢光增量與酪氨酸酶的濃度在0～80U/mL範圍內同樣呈線性關係，可知，該螢光探針的測試濃度為100nM-20μM。
4、由圖5可知，氧化性物質與5μM螢光探針幾乎無響應。
實施例3、酪氨酸酶檢測試劑盒的應用
一、檢測細胞中的酪氨酸酶
1)在37℃和5％CO2條件下，用含有10％(v/v)胎牛或小牛血清、100U/mL青黴素、100μg/mL的鏈黴素的DMEM培養基培養細胞(培養的細胞為人宮頸癌細胞HeLa和鼠的黑色素瘤細胞B16細胞)。細胞使用之前用DMEM清洗。
2)在細胞中加入1mL DMEM，再加入螢光探針(5μM)孵育2h後進行共聚焦螢光成像，激發波長為635nm，收集波段為650-750nm。
如圖6所示為本發明試劑盒分別用於人宮頸癌細胞HeLa(酪氨酸酶低表達)和鼠的黑色素瘤細胞B16(酪氨酸酶高表達)的共聚焦成像圖。
如圖7所示為本發明試劑盒用於預先與酪氨酸酶抑制劑曲酸孵育過的B16細胞的共聚焦成像圖。由上述結果表明本發明試劑盒可以測定細胞中的酪氨酸酶。
最後應說明的是：上述實施例僅舉出以式Ⅰ為螢光試劑，反應體系中含探針為5μM，緩衝溶液為0.01M磷酸鹽且反應時間為3h的情況。其餘螢光試劑濃度和反應時間的結果不一一列出，然而並非用於限定本發明。任何本領域的技術人員，在不脫離本發明的精神和範圍的情況下，應當可以作出各種修改與變更。