一種誘導蓖麻花葯外植體形成愈傷組織的方法與流程
2023-10-06 19:56:34 3
本發明涉及植物細胞工程技術領域，具體地，涉及一種誘導蓖麻花葯外植體形成愈傷組織的方法。
背景技術：
自從guhas首次報導毛蔓陀羅花葯培養獲得單倍體植株以來，關於花葯培養的研究迅速發展，包括中國在內的很多國家相繼進行這方面的研究工作，至今已有約200多種作物通過花葯培育獲得了單倍體植株。
在育種領域，花葯培養育種與常規雜交育種、遠緣雜交育種、誘變育種以及轉基因技術相結合，已經成為生物技術在作物育種中較為廣泛和有效的方法之一，是作物改良和遺傳學及生理、生化研究的重要方法。到目前為止，我國已有40多種植物用花葯培養方法獲得了花粉植株，主要有小麥、玉米、水稻、葡萄、柑桔、蘋果、龍眼、橡膠、楊樹及人參等一些藥用植物。已經培養出80多個水稻花粉新品系和新品種，20多個小麥花粉新品種和新品系。
蓖麻是大戟科蓖麻屬一年生或多年生草本植物，是世界上十大油料作物之一，具有用途廣泛，經濟價值高等特點，是具有特殊工業用途的重要工業油，其籽粒、葉片、莖杆、果殼綜合利用價值高。目前，還缺乏有競爭性的優良品種。
長期以來由於蓖麻主要以雜交、選擇、引種等傳統的方式進行育種，在很大程度上限制了其發展。利用花葯培養可以獲得單倍體植株，再對其進行染色體加倍後，可快速獲得蓖麻育種上廣泛應用的純系品種；並且從中選出的優良純合系的後代不會發生性狀分離，表現整齊一致，可顯著縮短育種年限。但是目前，蓖麻花葯培養還處於起步階段，有關蓖麻花葯培養的報導還很少，還存在蓖麻花葯愈傷組織的誘導率低和愈傷組織質量較差等問題，嚴重製約了蓖麻花葯離體培養的研究進展。因此，建立高效的誘導蓖麻花葯外植體形成愈傷組織的組培體系，對加速蓖麻的單倍體育種及進一步發展我國的蓖麻產業都具有重要意義。
技術實現要素：
本發明的目的是為了克服現有技術的不足，提供一種誘導蓖麻花葯外植體形成愈傷組織的方法。
為了實現上述目的，本發明是通過以下技術方案予以實現的：
一種誘導蓖麻花葯外植體形成愈傷組織的方法，包括如下步驟：
s1.將蓖麻花葯外植體置於15～30mg/l的ba溶液中浸泡10～20min；
s2.將經過s1處理的蓖麻花葯外植體接種到愈傷組織誘導培養基上進行培養，獲得愈傷組織；所述愈傷組織誘導培養基為添加了4～16mg/l的snp的ms培養基，或添加了1～2mg/l銅離子的ms培養基，或添加了3～6mg/l穀氨醯胺的ms培養基。
傳統誘導蓖麻花葯外植體形成愈傷組織的方法都是選擇將花葯外植體接種在含有各種激素的培養基上進行直接誘導，本發明的創造性在於先對花葯外植體進行一個前期的浸泡處理，然後再將外植體接種在含銅離子、snp或穀氨醯胺的培養基上進行誘導愈傷組織。對花葯外植體進行前期浸泡處理的好處在於高濃度的ba可以促使花葯外植體以更高的效率脫分化形成更多的愈傷組織，同時提高了所獲得愈傷組織的質量。
優選地，將蓖麻花葯外植體置於15mg/l的ba溶液中浸泡10min。
雖然相同的外植體在不同的培養基上誘導愈傷組織的發生過程基本都是一致的，但其愈傷組織質量和誘導率則因培養基配方的不同而各異；另外，不同的外植體類型在相同的培養基上誘導的愈傷組織的質量和誘導率也是各不相同。
優選地，所述愈傷組織誘導培養基為添加了8mg/l的snp的ms培養基。
優選地，所述愈傷組織誘導培養基為添加了2mg/l銅離子的ms培養基。
優選地，所述愈傷組織誘導培養基為添加了6mg/l穀氨醯胺的ms培養基。
優選地，所述蓖麻花葯外植體的獲取方法為：獲取無昆蟲食取、飽滿的且花被尚未打開的雄花，利用2%次氯酸鈉對蓖麻雄花進行表面滅菌，並剝離雄花表面的花被，小心獲取其中的蓖麻花葯外植體。
本發明不同濃度的ba溶液的配置方法為：準確稱取一定量的6-苄氨基嘌呤（6-ba，簡稱ba）（sigma，usa）粉末，用1mol/l的naoh溶液充分溶解，再用去離子水定容，配製成濃度分別為0、7.5、15、30、60、120mg/l的ba處理溶液。然後用1mol/l的hcl溶液調整ba處理溶液的ph至5.8～6.0，使用前用0.22微米的水系濾膜（millipore，usa）對已配製好的ba處理溶液進行過濾滅菌。
所述ms培養基：ms培養基配方的無機成分（16.5g/l硝酸銨、19g/l硝酸鉀、1.7g/l磷酸二氫鉀、3.7g/l七水硫酸鎂、4.4g/l二水氯化鈣、16.9mg/l一水硫酸錳、8.6mg/l七水硫酸鋅、6.2mg/l硼酸、0.83mg/l碘化鉀、0.25mg/l二水硫酸鉬二鈉、0.025mg/l五水硫酸銅、0.025mg/l六水氯化鈷、37.3mg/l二水乙二胺四乙酸鈉、27.8mg/l七水硫酸亞鐵）+ms培養基配方的有機成分（2mg/l甘氨酸、0.1mg/l鹽酸硫胺素、0.5mg/l鹽酸吡哆醇、0.5mg/l煙酸）+100mg/l肌醇+30g/l蔗糖+7g/l瓊脂，用1mg/lnaoh溶液調整ph至5.8～6.0。培養基在121℃，0.1mpa的條件下滅菌15分鐘。
步驟s2所述的培養條件為：室溫為25℃、光照強度為2000lx、光照時間為每天12小時。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
本發明的創新性在於改變了傳統誘導蓖麻花葯外植體形成愈傷組織的方法，即利用高濃度ba溶液對花葯外植體進行短期浸泡處理，由此促使花葯外植體以更高的效率脫分化形成更多的愈傷組織。同時提高了所獲得愈傷組織的質量，為蓖麻相關生物技術育種工作奠定了良好的基礎。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明作出進一步地詳細闡述，所述實施例只用於解釋本發明，並非用於限定本發明的範圍。下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業途徑得到的試劑和材料。
實施例1
一種誘導蓖麻花葯外植體形成愈傷組織的方法，包括如下步驟：
(1)獲取花葯外植體：選取無昆蟲食取、飽滿且花被尚未打開呈球狀的蓖麻雄花。採取時間應選在溫度低，光照弱的晴天上午10時左右，此時蓖麻上的花蕾無霧水可減少汙染，光照較弱又可防止花葯水分的喪失。將採集的雄花花蕾用紙巾包裹住，先用蒸餾水潤溼，再輕輕擠掉多餘的水分，然後裝進玻璃瓶中，在4℃的冰箱中處理3天。在超淨工作檯上先用75%乙醇溶液對蓖麻雄花先消毒1min，再用2%的naclo溶液消毒20min，無菌水漂洗蓖麻雄花5次。之後用滅過菌的解剖針小心將雄花外層的花被去除，再將其中的花葯小心分離，即可獲得蓖麻花葯外植體。
(2)將蓖麻花葯外植體接種在添加不同濃度ba的ms基本培養基上，在室溫為25℃、光照強度為2000lx、光照時間為每天12小時的條件下誘導愈傷組織。結果如表1所示，添加適量的ba對蓖麻花葯愈傷組織的形成具有促進作用，當ba的濃度為1mg/l時，蓖麻花葯愈傷組織的誘導率達最大值，為10.67%；而隨著ba的濃度的繼續增加，蓖麻花葯愈傷組織的誘導率逐漸降低。同時，實驗結果還表明，採用傳統方法誘導蓖麻花葯外植體形成愈傷組織的過程中，所獲得愈傷組織的誘導效率較低且質量較差，體積較小。
表1為ba對蓖麻花葯愈傷組織誘導效率的影響
註：數據採用spssstatistics17.0統計分析軟體進行方差分析和鄧肯多重比較（p≦0.05），數據後字母不同表示處理間差異顯著。
實施例2
一種誘導蓖麻花葯外植體形成愈傷組織的方法，包括如下步驟：
(1)獲取花葯外植體：同實施例1。
(2)將蓖麻花葯外植體置於15mg/l的ba溶液中浸泡不同時間（0～80min）；
(3)然後將蓖麻花葯外植體放置在無菌吸水紙上吸去多餘液體後，小心的接種至無激素ms培養基上培養30天。
實驗結果表明，浸泡處理外植體的時間為10min時，外植體愈傷組織誘導效率效果最佳，達41.25%（表2）。繼續延長處理時間，蓖麻花葯外植愈傷組織誘導率將逐漸降低。
表2為處理時間對蓖麻花葯愈傷組織誘導效率的影響
註：數據採用spssstatistics17.0統計分析軟體進行方差分析和鄧肯多重比較（p≦0.05），數據後字母不同表示處理間差異顯著。
實施例3
一種誘導蓖麻花葯外植體形成愈傷組織的方法，包括如下步驟：
(1)獲取花葯外植體：同實施例1。
(2)將蓖麻花葯外植體置於不同濃度(0～120mg/l)的ba溶液中浸泡10min。
(3)然後將蓖麻花葯外植體放置在無菌吸水紙上吸去多餘液體後，小心的接種至無激素ms培養基上培養30天。
實驗結果表明，隨著ba溶液濃度的增加，蓖麻花葯外植體愈傷組織誘導效率將逐步提高，當浸泡處理外植體的濃度為15mg/l時，外植體愈傷組織誘導效果最佳，愈傷組織誘導率達最大值，為41.25%（表3）。而繼續提高ba處理液濃度，蓖麻花葯外植體愈傷組織誘導效率將逐步降低。同時，在採用短期高濃度ba溶液浸泡處理的方法來誘導蓖麻花葯外植體形成愈傷組織的過程中，還發現所獲得愈傷組織質量較好，體積較大。
表3為ba溶液濃度對蓖麻花葯愈傷組織誘導效率的影響
註：數據採用spssstatistics17.0統計分析軟體進行方差分析和鄧肯多重比較（p≦0.05），數據後字母不同表示處理間差異顯著。
由上述實驗結果可知，與採用傳統方法誘導蓖麻花葯外植體形成愈傷組織相比，採用高濃度ba溶液浸泡處理蓖麻花葯外植體所誘導形成的愈傷組織誘導率顯著提高（愈傷組織誘導率提高了30.58%），並且所獲得的愈傷組織的質量更好，體積更大。因此，採用15mg/lba溶液對蓖麻花葯外植體進行10min的浸泡處理，可以用來達到獲得數量更多、質量更好的愈傷組織的目的。
實施例4
一種誘導蓖麻花葯外植體形成愈傷組織的方法，包括如下步驟：
(1)獲取花葯外植體：同實施例1。
(2)將蓖麻花葯外植體置於15mg/l的ba溶液中浸泡10min。
(3)然後將蓖麻花葯外植體放置在無菌吸水紙上吸去多餘液體後，小心的接種至添加了不同濃度的硝普鈉（snp）（0、2、4、8、16和32mg/l）的ms培養基上培養30天。
實驗結果表明，隨著snp濃度的提高，蓖麻花葯愈傷組織誘導率也隨著提高，當snp濃度為8mg/l時，愈傷組織誘導率達最大值，為60.37%，比傳統方法提高了49.70%，比經過高濃度ba溶液處理後接種至無激素ms培養基上提高了19.12%；但是繼續提高snp的濃度時，愈傷組織誘導將會被抑制，誘導效率將逐步降低。
表4為snp對蓖麻花葯愈傷組織誘導效率的影響
註：數據採用spssstatistics17.0統計分析軟體進行方差分析和鄧肯多重比較（p≦0.05），數據後字母不同表示處理間差異顯著。
實施例5
一種誘導蓖麻花葯外植體形成愈傷組織的方法，包括如下步驟：
(1)獲取花葯外植體：同實施例1。
(2)將蓖麻花葯外植體置於15mg/l的ba溶液中浸泡10min。
(3)然後將蓖麻花葯外植體放置在無菌吸水紙上吸去多餘液體後，小心的接種至添加了不同濃度的銅離子（無水硫酸銅）（0、0.5、1、2、4和8mg/l）的ms培養基上培養30天。
實驗結果表明，隨著銅離子濃度的提高，蓖麻花葯愈傷組織誘導率也隨著提高，當銅離子濃度為2mg/l時，愈傷組織誘導率達最大值，為68.36%，比傳統方法提高了57.69%，比經過高濃度ba溶液處理後接種至無激素ms培養基上提高了27.11%；；但是繼續提高銅離子的濃度時，愈傷組織誘導將會被抑制，誘導效率將逐步降低。
表5為銅離子對蓖麻花葯愈傷組織誘導效率的影響
註：數據採用spssstatistics17.0統計分析軟體進行方差分析和鄧肯多重比較（p≦0.05），數據後字母不同表示處理間差異顯著。
實施例6
一種誘導蓖麻花葯外植體形成愈傷組織的方法，包括如下步驟：
(1)獲取花葯外植體：同實施例1。
(2)將蓖麻花葯外植體置於15mg/l的ba溶液中浸泡10min。
(3)然後將蓖麻花葯外植體放置在無菌吸水紙上吸去多餘液體後，小心的接種至添加了不同濃度的穀氨醯胺（0、1.5、3、6、12和24mg/l）的ms培養基上培養30天。
實驗結果表明，隨著gln濃度的提高，蓖麻花葯愈傷組織誘導率也隨著提高，當穀氨醯胺濃度為6mg/l時，愈傷組織誘導率達最大值，為54.63%，比傳統方法提高了43.96%，比經過高濃度ba溶液處理後接種至無激素ms培養基上提高了13.38%；但是繼續提高穀氨醯胺的濃度時，愈傷組織誘導將會被抑制，誘導效率將逐步降低。
表6為穀氨醯胺對蓖麻花葯愈傷組織誘導效率的影響
註：數據採用spssstatistics17.0統計分析軟體進行方差分析和鄧肯多重比較（p≦0.05），數據後字母不同表示處理間差異顯著。
實施例7
一種誘導蓖麻花葯外植體形成愈傷組織的方法，步驟(1)和(3)同實施例2，與實施例2唯一不同的地方在於步驟(2)採用不同的激素進行浸泡，本實施例包括如下4個不同的並列處理：處理1為使用15mg/l的tdz溶液浸泡花葯外植體10min；處理2為使用15mg/l的naa溶液浸泡花葯外植體10min；處理3為使用15mg/l的iba溶液浸泡花葯外植體10min；處理4為使用15mg/l的iaa溶液浸泡花葯外植體10min。四種不同處理後的愈傷組織誘導結果見表7。
表7為不同激素浸泡對蓖麻花葯愈傷組織誘導效率的影響
實施例8
一種誘導蓖麻花葯外植體形成愈傷組織的方法，包括如下步驟：
(1)獲取花葯外植體：同實施例1。
(2)將蓖麻花葯外植體接種在添加不同激素的ms基本培養基上，在室溫為25℃、光照強度為2000lx、光照時間為每天12小時的條件下誘導愈傷組織。本實施例包括如下2個不同的並列處理：處理1使用添加3mg/l的ba+0.2mg/l的naa的ms培養基作為愈傷組織誘導培養基；處理2使用添加2mg/l的ba+2mg/l的2,4-d的ms培養基作為愈傷組織誘導培養基；結果見表8。
表8為不同愈傷組織誘導培養基對蓖麻花葯愈傷組織誘導效率的影響
實施例9
(1)獲取花葯外植體：同實施例1。
(2)將蓖麻花葯外植體置於15mg/l的ba溶液中浸泡10min。
(3)然後將蓖麻花葯外植體放置在無菌吸水紙上吸去多餘液體後，小心的接種至添加不同激素的ms基本培養基上，在室溫為25℃、光照強度為2000lx、光照時間為每天12小時的條件下誘導愈傷組織。本實施例包括如下4個不同的並列處理：處理1為使用添加8mg/l的snp+2mg/l銅離子的ms培養基作為愈傷組織誘導培養基；處理2為使用添加2mg/l銅離子+6mg/l穀氨醯胺的ms培養基作為愈傷組織誘導培養基；處理3為使用添加8mg/l的snp+6mg/l穀氨醯胺的ms培養基作為愈傷組織誘導培養基；處理4為使用添加8mg/l的snp+加2mg/l銅離子+6mg/l穀氨醯胺的ms培養基作為愈傷組織誘導培養基；結果見表9。
表9為不同愈傷組織誘導培養基對蓖麻花葯愈傷組織誘導效率的影響
以上實施例只用於解釋本發明，並非用於限定本發明的範圍。
sequencelisting
廣東傑士農業科技有限公司
一株植物固氮細菌djg211及其在提高土壤和植物活力中的應用
1
patentinversion3.3
1
1345
dna
16srdna序列
1
ggtagcacagggagcttgctctcgggtgacgagtgggggacgggtgagtaatgtctggga60
aactgcccgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataatgtggca120
agaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcggatgtgcccagatgggattagct180
tgttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacaatccctagctggtctgagaggatgacca240
gccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattg300
cacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgt360
aaagcactttcagcggggaggaaggtgttaaggttaataaccttgtcgattgacgttacc420
cgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagc480
gttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaa540
tccccgggctcaacctgggaactgcattcgaaactggcaggcttgagtcttgtagagggg600
ggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtaaagatctggaggaataccggtggcgaa660
ggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggatt720
agataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcg780
tggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaa840
ctcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaa900
cgcgaagaaccttacctggtcttgacatccacggaatttggcagagatgccttagtgcct960
tcgggaaccgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttggg1020
ttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggtccggccgggaactc1080
aaaggasactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcc1140
cttacgactagggctacacacgtgctacaatggcatatacaaagagaagcgacctcgcga1200
gagcaagcggacctcataaagtatgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactcca1260
tgaagtcggaatcgctagtaatcgtggatcagaatgccacggtgaatacgttcccgggcc1320
ttgtacacaccgcccgtcacaccat1345