一種柳枝稷突變體的創製方法

2023-10-06 20:11:19 1

一種柳枝稷突變體的創製方法
【專利摘要】本發明公開了一種柳枝稷突變體的創製方法，用組織培養的方式培養出大量柳枝稷叢生芽後，剝離出單個叢生芽，在自然條件下煉苗後切除上部葉鞘，用甲基磺酸乙酯(EMS)溶液對剩餘的基部以上1.5～2cm部分進行浸泡處理3h，完成後直接將切除葉鞘的叢生芽移栽到培養基質中進行培養，生根完成後移栽至溫室或者大田，根據柳枝稷表型篩選出突變體。該方法能規模化處理突變的原始受體材料，增加了變異株的基數，同時能獲得與原始受體材料僅目標性狀差異的近等基因系材料，而且誘變過程簡單易行，處理成本相對比較低廉，能有效縮短育種周期，適合為柳枝稷現代生物技術研究創製新材料。
【專利說明】一種柳枝稷突變體的創製方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬於植物育種【技術領域】，涉及一種柳枝稷突變體的創製方法。

【背景技術】
[0002] 柳枝稷（英文名Switchgrass，拉丁名Panicum virgatum Linn)為禾本科多年生 草本C4植物，起源於北美大草原，植株高大，栽培簡單，抗逆性強，具有很高的年生物量產 量。柳枝稷最初主要被用來作為飼料作物以及園林植物，同時也被用於水土流失防治等方 面，均表現出了優良的利用前景。20世紀末，美國率先將其選為模式生物能源植物，此後，各 國均加大了對柳枝稷的開發研究。而採用現代生物技術對柳枝稷進行遺傳改良和開發利用 已成為目前國內外在生物能源領域的研究熱點之一。
[0003] 創製和利用優良突變體是現代生物技術研究的重要方面。作為一種模式生物能源 植物，柳枝稷具有耐旱、耐貧瘠、抗病蟲害、生物產量高等很多優良性狀。然而柳枝稷又是一 種異花授粉植物，具有較強的自交不親和性，通過有性繁殖獲得的後代通常具有不同的基 因型，且性狀分離周期長，因此柳枝稷在現代生物技術特別是突變體的利用研究方面存在 較大障礙。探索在初始基因型一致情況下創製不同突變體將可能對推動柳枝稷現代生物技 術研究具有重大意義。
[0004] 化學誘變劑EMS(甲基磺酸乙酯）在突變體創製中應用十分廣泛，當前也被認為是 最有效的化學誘變劑，已經利用EMS成功創製出多種植物的突變體。目前已有研究者利用 EMS對柳枝稷種子進行化學誘變，但因柳枝稷種子間為異質基因型，使其應用前景受到較大 限制。
[0005] 與其他植物類似，柳枝稷通過無性繁殖方法可以獲得與原始材料初始基因型一致 的植株或材料（即無性系），而無性系不同植株和材料間具有與初始基因型一致的特點 (即為同質基因型）。但迄今在柳枝稷研究方面尚未有過利用無性系作為誘變材料的報導。
[0006] 中國專利文獻CN101081005A(申請號200710018261. 6)公開了一種柳枝稷的體外 繁殖即無性系創製方法。具體為在柳枝稷生長發育至有5?6個節時，切取中間3?4個 莖節，在MBP培養基上人工誘導叢生芽，對從生芽生長點人工重複切除處4?5次至塊莖直 徑為0. 5cm左右，在新的MBP培養基上可以獲得大規模叢生芽。


【發明內容】

[0007] 本發明解決的問題在於提供一種柳枝稷突變體的創製方法，利用柳枝稷進行無性 系培育，在初始基因型一致的基礎上獲得柳枝稷的不同突變體植株，推進柳枝稷的現代生 物技術育種進程。
[0008] 本發明是通過以下技術方案來實現：
[0009] -種柳枝稷突變體的創製方法，包括以下操作：
[0010] 1)大田情況下，當柳枝稷植株生長發育達到5?6個節、幼穗開始形成時，取長度 1?1. 5cm的穗下莖節組織；對穗下莖節組織消毒處理後衝洗，然後接種至MBP培養基，擴 充叢生芽群體；
[0011] 2)挑選生長健壯的叢生芽，在不損傷基部的生長點的情況下剝離叢生芽，獲取待 誘變的叢生芽群體；
[0012] 將叢生芽群體在25°C室溫條件下煉苗24?36h，然後切除上部葉鞘，預留基部以 上1. 5?2cm,並噴水保持其溼潤；
[0013] 3)以磷酸緩衝液配置的質量濃度為0.5?1.0%的甲基磺酸乙酯溶液作為誘變 液，將誘變液與待誘變的叢生芽群體充分混合後，在真空環境下靜置1?3h進行誘變；
[0014] 4)將誘變後的叢生芽群體用水充分衝洗後，插入培養基質中栽植，栽植深度為 0. 5?lcm，栽植完成後溫室培養；
[0015] 5)溫室培養三個月後，將長成的單株移栽至花盆或者大田中；
[0016] 6)在大田環境中，以初始基因型性狀作為對照，根據誘變後植株表型性狀和生理 性狀變化，鑑定出柳枝稷突變體。
[0017] 所述的莖節組織包含莖節上下各0. 5?0. 7cm的長度。
[0018] 所述對莖節組織消毒處理為：
[0019] 採用70%的酒精對對莖節組織進行表面消毒1?3min，再用質量濃度20%的次氯 酸鈉溶液滅菌5?8min，無菌水衝洗3-4次。
[0020] 所述的MBP培養基，其成分為：MS基本培養基4. 43g/L，蔗糖30g/L，6-BA(6-苄基 腺嘌呤）3mg/L，瓊脂 7. 5g/L，pH = 5. 8。
[0021] 所述在挑選叢生芽時，挑選出長度3. 5cm以上的叢生芽作為待誘變的材料，每次 誘變的叢生芽群體總數為500?1000個。
[0022] 所述的誘變液是使用pH = 6. 98的磷酸緩衝液進行配製的。
[0023] 所述將誘變液與待誘變的叢生芽群體充分混合後放置於容器中，然後放入真空泵 中，抽10?20min真空後靜置浸泡3h。
[0024] 所述的栽培基質為腐殖土與河沙按照1?1. 2:1的質量比混合，栽植前一天在基 質中加水，直到吸水飽和。
[0025] 所述的栽培基質中栽植密度為800?1000個/m2。
[0026] 所述的溫室培養，其培養溫度為20?25°C，每天光照14h，光強1500?20001ux， 每天澆水1?2次，保持基質表面溼潤。
[0027] 與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果：
[0028] 1、誘變過程簡單易行
[0029] 傳統的無性系誘變主要是基於愈傷組織，而對愈傷組織的處理過程必須在無菌條 件下進行，對EMS溶液的滅菌要求嚴格，而且後續組織培養過程涉及到在不同的培養基上 進行誘導生根等過程，往往會導致材料汙染、白化等常見問題。而本發明在真空環境下、利 用EMS誘變結束後採用直接種植的方式，免去了愈傷組織培養再生等繁瑣步驟，在經過溫 室培養後可以直接移栽到大田進行檢測，縮短了實驗周期。
[0030] 本發明巧妙的實現了利用EMS誘變與初始基因型一致的柳枝稷無性系植株，創製 出在同質基因型基礎上的不同柳枝稷突變體植株，推進柳枝稷的現代生物技術育種進程。
[0031] 2、成活率高，栽植容易
[0032] 柳枝稷單個叢生芽切除上部葉鞘後在栽植條件控制良好的情況下成活率相對比 較高，而且在誘變結束後不需要在培養基中誘導生根，可直接插入培養基質中栽培，容易成 活。
[0033] 3、誘變群體基數大，利於實驗結果分析
[0034] 本發明通過組織培養可以在短時間內得到大量的基因型一致的叢生芽，有效的解 決了材料不足的問題，而且利用單個叢生芽做誘變群體基數大，有利於對誘變結果進行統 計學分析。
[0035] 4、成本低廉
[0036] 柳枝稷叢生芽切除葉鞘後基部僅僅剩餘1. 5?2cm，選擇合適的容器使用少量的 EMS溶液就可以對大量的材料進行處理，有效地節約了藥品，降低了誘變成本。
[0037] 5、可獲得在同質基因型基礎上的不同突變體類型，利於現代生物技術研究應用
[0038] 本發明在同質基因型基礎上獲得的不同突變體類型，與初始基因型比較，類似不 同突變性狀的近等基因系材料，為柳枝稷現代生物技術特別是分子生物學研究提供基礎材 料，對其他異花授粉植物研究也具有借鑑價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0039] 圖1為未經EMS處理的對照柳枝稷單株；
[0040] 圖2為經過EMS處理的寡分櫱柳枝稷突變體單株。

【具體實施方式】
[0041] 下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而 不是限定。
[0042] 本發明以柳枝稷的叢生芽為誘變材料，在初始基因型一致的情況下創製其突變體 植株。具體按照如下步驟進行：
[0043] 步驟一：取材並繁殖擴充叢生芽群體
[0044] a.大田情況下，當柳枝稷植株生長發育達到5- 6個節時幼穗開始形成。取 1-1. 5cm左右穗下莖節組織，每個莖節組織包含莖節上下各0. 5?0. 7cm的長度。
[0045] b.採用70 %的酒精對對莖節組織進行表面消毒lmin，再用20 %的次氯酸鈉溶液 滅菌5?8min，無菌水衝洗3-4次，接種至MBP培養基，其中MBP培養基成分為：MS基本培 養基（Murashige and Skoog Basal Medium，美國 Sigma 公司生產）4.43g/L，鹿糖 30g/L， 6-BA (6-苄基腺嘌呤）3mg/L，瓊脂 7. 5g/L，pH = 5· 8
[0046] c.叢生芽群體的擴充按照中國專利文獻CN101081005A(申請號200710018261. 6) 所述的技術方案進行。
[0047] 步驟二：誘變前期處理
[0048] a.挑選生長健壯的叢生芽作為誘變材料，沿著叢生芽塊基部用鑷子小心剝離出每 個叢生芽（注意不能損傷叢生芽基部的生長點），挑選出3. 5cm以上的叢生芽作為誘變材 料。每次誘變的叢生芽群體總數為500?1000個。
[0049] b.將叢生芽群體在自然條件下煉苗或者在25°C室溫條件下煉苗24?36h後切除 上部葉鞘，預留基部以上1. 5?2cm，噴適量的水保持材料溼潤。
[0050] c.預先配製好栽培基質（腐殖土 ：河沙=1:1)，提前一天在基質中加水，直到吸水 飽和。
[0051] 步驟三：誘變處理，
[0052] a.用 pH = 6. 98 的磷酸緩衝液（Na2HP04:KH2P04 = 3:2)配製濃度為 0· 5% 的 EMS 溶液。
[0053] b.選擇合適的容器（口徑小高度大）進行誘變處理，將EMS溶液與切除葉鞘後 的叢生芽材料充分混合後放入真空泵中，抽20min真空後靜置浸泡3h(真空泵壓力值為 0· 08 ?0· IMPa)。
[0054] 步驟四：誘變後栽植
[0055] a.將誘變處理後的材料用紗布包裹後固定，放入流水中衝洗，並調節水流大小避 免材料被衝走，衝洗40?60min後取出材料。
[0056] b.種植材料前預先在培養盆中規劃好種植密度，將材料直接插入培養基質中栽 植，栽植深度為0. 5?lcm，種植完成後將材料轉移到溫度20°C，光照14h，光強1500? 20001ux的溫室培養，每天澆水1?2次，保持基質表面溼潤。
[0057] 步驟五：移栽
[0058] 三個月後，將長成的單株移栽至直徑25cm的花盆或者大田中。
[0059] 步驟六：突變體鑑定
[0060] 與初始基因型進行比較，根據誘變後植株表型性狀和生理性狀變化，鑑定出目標 突變體。
[0061] 下面是給出的具體實施實例，以柳枝稷品種Alamo為例。
[0062] 步驟一：取材並繁殖擴充叢生芽群體
[0063] a.大田情況下，當柳枝稷植株生長發育達到5- 6個節時幼穗開始形成。取 1-1. 5cm左右穗下莖節組織，每個莖節組織包含莖節上下各0. 5?0. 7cm的長度。
[0064] b.採用70 %的酒精對對莖節組織進行表面消毒lmin，再用20 %的次氯酸鈉溶液 滅菌5?8min，無菌水衝洗3-4次，接種至MBP培養基，其中MBP培養基成分為：MS基本培 養基（Murashige and Skoog Basal Medium，美國 Sigma 公司生產）4.43g/L，鹿糖 30g/L， 6-BA (6-苄基腺嘌呤）3mg/L，瓊脂 7. 5g/L，pH = 5· 8
[0065] c.叢生芽群體的擴充按照中國專利文獻CN101081005A(申請號200710018261. 6) 所述的技術方案進行。
[0066] 步驟二：誘變前期處理
[0067] a.挑選生長健壯的叢生芽作為誘變材料，沿著叢生芽塊基部用鑷子小心剝離出每 個叢生芽（注意不能損傷叢生芽基部的生長點），挑選出3. 5cm以上的叢生芽作為誘變材 料。每次誘變的叢生芽群體總數為500?1000個。
[0068] b.在自然條件下煉苗24_36h後切除上部葉鞘，預留基部以上1. 5?2cm，噴適量 的水保持材料溼潤。
[0069] c.預先配製好栽培基質（腐殖土 ：河沙=1:1)，提前一天在基質中加水，直到吸水 飽和。
[0070] 步驟三：誘變處理，
[0071] a.用 pH = 6. 98 的磷酸緩衝液（Na2HP04:KH2P04 = 3:2)配製濃度為 0· 5% 的 EMS 溶液。
[0072] b.選擇合適的容器（口徑小高度大）進行誘變處理，將EMS溶液與切除葉鞘後的 叢生芽材料充分混合後放入真空泵中，抽20min真空後靜置浸泡3h。
[0073] 步驟四：誘變後栽植
[0074] a.將誘變處理後的材料用紗布包裹後固定，放入流水中衝洗，並調節水流大小避 免材料被衝走，衝洗40?60min後取出材料。
[0075] b.種植材料前預先在培養盆中規劃好種植密度，將材料直接插入培養基質中栽 植，栽植深度為0. 5?lcm，種植完成後將材料轉移到溫度20°C，光照14h，光強1500? 20001ux的溫室中培養，每天澆水1?2次，保持基質表面溼潤。
[0076] 步驟五：移栽
[0077] 三個月後，將長成的單株移栽至直徑25cm的花盆或者大田中。
[0078] 步驟六：突變體鑑定
[0079] 與初始基因型進行比較，根據誘變後植株表型性狀和生理性狀變化，鑑定出目標 突變體。
[0080] 經過EMS處理的幼苗與空白對照相比，誘變處理過的部分植株在形態等方面會出 現明顯差異，具體表現為：如植株分櫱相對較少，植株較矮，開花期延遲等。經過田間選育後 有望育成新的品種（系）或種質材料。
【權利要求】
1. 一種柳枝稷突變體的創製方法，其特徵在於，包括以下操作： 1) 大田情況下，當柳枝稷植株生長發育達到5?6個節、幼穗開始形成時，取長度1? 1. 5cm的穗下莖節組織；對穗下莖節組織消毒處理後衝洗，然後接種至MBP培養基，擴充叢 生芽群體； 2) 挑選生長健壯的叢生芽，在不損傷基部的生長點的情況下剝離叢生芽，獲取待誘變 的叢生芽群體； 將叢生芽群體在25°C室溫條件下煉苗24?36h，然後切除上部葉鞘，預留基部以上 1. 5?2cm,並噴水保持其溼潤； 3) 以磷酸緩衝液配置的質量濃度為0. 5?1. 0 %的甲基磺酸乙酯溶液作為誘變液，將 誘變液與待誘變的叢生芽群體充分混合後，在真空環境下靜置1?3h進行誘變； 4) 將誘變後的叢生芽群體用水充分衝洗後，插入培養基質中栽植，栽植深度為0. 5? lcm，栽植完成後溫室培養； 5) 溫室培養三個月後，將長成的單株移栽至花盆或者大田中； 6) 在大田環境中，以初始基因型性狀作為對照，根據誘變後植株表型性狀和生理性狀 變化，鑑定出柳枝稷突變體。
2. 如權利要求1所述的柳枝稷突變體的創製方法，其特徵在於，所述的莖節組織包含 莖節上下各〇. 5?0. 7cm的長度。
3. 如權利要求1所述的柳枝稷突變體的創製方法，其特徵在於，所述對莖節組織消毒 處理為： 採用70 %的酒精對對莖節組織進行表面消毒1?3min，再用質量濃度20 %的次氯酸鈉 溶液滅菌5?8min，無菌水衝洗3-4次。
4. 如權利要求1所述的柳枝稷突變體的創製方法，其特徵在於，所述的MBP培養基，其 成分為：MS基本培養基4. 43g/L，蔗糖30g/L，6-BA (6-苄基腺嘌呤）3mg/L，瓊脂7. 5g/L，pH =5· 8〇
5. 如權利要求1所述的柳枝稷突變體的創製方法，其特徵在於，在挑選叢生芽時，挑選 出長度3. 5cm以上的叢生芽作為待誘變的材料，每次誘變的叢生芽群體總數為500?1000 個。
6. 如權利要求1所述的柳枝稷突變體的創製方法，其特徵在於，所述的誘變液是使用 pH = 6. 98的磷酸緩衝液進行配製的。
7. 如權利要求1所述的柳枝稷突變體的創製方法，其特徵在於，將誘變液與待誘變的 叢生芽群體充分混合後放置於容器中，然後放入真空泵中，抽10?20min真空後靜置浸泡 3h〇
8. 如權利要求1所述的柳枝稷突變體的創製方法，其特徵在於，所述的栽培基質為腐 殖土與河沙按照1?1. 2:1的質量比混合，栽植前一天在基質中加水，直到吸水飽和。
9. 如權利要求1所述的柳枝稷突變體的創製方法，其特徵在於，所述的栽培基質中栽 植密度為800?1000個/ m2。
10. 如權利要求1所述的柳枝稷突變體的創製方法，其特徵在於，所述的溫室培養，其 培養溫度為20?25°C，每天光照14h，光強1500?20001ux，每天澆水1?2次，保持基質 表面溼潤。
【文檔編號】A01H4/00GK104137773SQ201410249822
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年6月6日 優先權日:2014年6月6日
【發明者】奚亞軍, 李毛, 王勇鋒 申請人:西北農林科技大學