一種人角質細胞生長因子-1結構類似物及其製備方法和應用的製作方法

2023-10-09 11:45:39 3

專利名稱：一種人角質細胞生長因子-1結構類似物及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程技術領域，涉及一種人角質細胞生長因子-1結構類似 物，特別涉及一種人角質細胞生長因子-1結構類似物的及其製備方法和應用。
背景技術：
角質細胞生長因子-l(KeratinocyteGrowthFacfor-l. KGF-1)也叫成纖維細胞生
長因子-7 (FGF-7)，因為其具有顯著的促進上皮細胞增殖的作用而受到科學家的
關注。現已證明，它對多種上皮細胞包括II型肺泡上皮細胞、肝實質細胞、胃腸
細胞、尿道上皮細胞和各種鱗狀上皮的角化細胞等都有作用。由於KGF對許多組
織的上皮細胞都具有促增殖作用，因此對皮膚、角膜、膀胱、腎、肺、腸、肝等
部位上皮組織的損傷具有重要的修復作用。
KGF-1具有刺激胃腸系統的上皮細胞的增殖和分化的功能，對保持胃腸系統牯
膜的完整性和促進損傷修復有很重要的作用。研究表明，KGF-1能夠誘導胃上皮
細胞的增殖，同時，KGF-1還能降低胃酸的分泌。因此，KGF-1具有治療胃腸系
統潰瘍的功能。和傳統的治療藥物相比，KGF-1在起到傳統藥物抑制胃酸作用的
同時，還能從根本上促進胃腸系統上皮細胞的增殖和分化，從而使潰瘍面重新上
皮化而得到完全的恢復。Farrell等證明，在小鼠的放療和化療模型中，給小鼠預
先滴注重組KGF-1，可以降低小鼠的胃腸道損傷，顯著改善小鼠的生存狀態。放
療和化療在殺死腫瘤細胞的同時，使胃腸系統的細胞同樣受到損傷，影響患者的
生存狀態，在放化療的同時使用KGF可使胃腸系統的細胞存活率增加55 %或更多。在化療模型和放化療結合模型中，應用KGF-1能夠加速恢復期的體重增加。其對 胃腸黏膜的保護機制是KGF的預處理增加了小腸絨毛的高度和隱窩的深度，同時， KGF-1對小腸隱窩千細胞也有直接作用，加強隱窩細胞在放化療中的存活率。因 此，KGF-1在治療胃腸系統的損傷和降低癌症放化療的毒副作用方面具有十分重 要的意義。
已有充分證據表明，KGF-1蛋白分子極不穩定，KGF-1的5個半胱氨酸分別位 於l、 15、 40、 102、 106位，其中1位與15位以及102位與106位之間分別形成二對 二石危鍵，而40位的半胱氨酸以自由的形式存在的，全長的KGF-1由於二硫4泉之間 的錯配容易造成蛋白的不穩定和聚集。研究發現，缺失第1位與15位的半胱氨酸， KGF-1的穩定性不但提高，活性也比原來提高了5 10倍。通過對其N端進行改造和 對活性位點(第122 133位胺基酸殘基)的點突變則使蛋白活性出現了不同程度的 改變。
目前使用哺乳動物細胞表達KGF-1產量極低且造價昂貴，而使用大腸桿菌進 行表達雖然具有表達量高和成本較低的特點，但是由於KGF-1本身具有的5個半 胱氨酸，造成在表達過程中主要形成包涵體，而且這種包涵體往往難於復性。因 此，使用弱啟動子降低其表達的速率，同時使用分子伴侶幫助其正確摺疊，從而 獲得大量可溶的人KGF-l,有望獲得令人滿意的KGF-1產量。
到目前為止，還沒有報導在將N末端缺失22個胺基酸(即A22KGF-1)的基 礎上，將第23位胺基酸殘基由精氨酸突變為甘氨酸，第128位胺基酸殘基突變由 天冬醯胺突變為非極性胺基酸的報導。

發明內容
為了克服上述技術缺陷，本發明的第一個目的在於，提供一種人角質細胞生 長因子的類似物，與人角質細胞生長因子的蛋白質結構相比較，該類似物的蛋白序列的N末端缺失22個胺基酸(即A22KGF-1),將第23位胺基酸殘基由精氨 酸突變為甘氨酸，第128位胺基酸殘基突變由天冬醯胺突變為非極性胺基酸，如 絲氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸，優選為絲氨酸。將此類似物命名 為KGF-1/GLYS。
本發明的結構類似物KGF- 1/GLYS具有序列4所示的氨基S菱序列,其基因具有 序列3所示的核苷S臾序列。
本發明的第二個目的在於公開KGF-1/GLYS蛋白的製備方法通過PCR擴增得 到含突變位點的人角質細胞生長因子-l的cDNA，將所述cDNA片段與表達載體連 接，連接產物轉化感受態細胞，篩選陽性克隆，表達純化。
所述的突變位點包括R23G和N128S。
所述的表達載體具有trp啟動子，並與編碼具有輔助表達摺疊功能的TRX蛋 白的基因可操作的連接。
該方法是使用本實驗自己構建的ptrpTRX載體表達目的蛋白。該載體具有啟動 能力較弱的trp啟動子及幫助摺疊的硫氧還蛋白TRX,可以有效地控制蛋白表達的 速率和摺疊效果。
本發明的第三個目的在於，特別提出一種重組表達載體，所述重組表達載體 含有上述人角質細胞生長因子-1結構類似物的基因序列。
所述的重組表達載體具有trp啟動子，並與編碼具有輔助表達摺疊功能的TRX 蛋白的基因可操作的連接。
本發明的目的還在於提供人角質細胞生長因子-1結構類似物在製備放、化療 損傷預防藥物、長效藥物、促進創傷癒合藥物或潰瘍治療藥物中的應用，同時也 可應用於化妝品中。
本發明的人角質細胞生長因子-l結構類似物能促進創口的癒合，修復各種皮膚損傷，減少疤痕形成，對臨床上治療燒傷及其他皮膚損傷有重要價值；能促進 正常上皮細胞增殖，具有輻射防護作用，能預防和治療放、化療造成的損傷；而 對肺瘤細胞既不促進其增殖，也不降低其對輻射的敏感性，同時還有增加癌症治 療中放療指標的潛力。可用於潰瘍和胃腸炎的治療，因此該類似物可以作為潛在 的新型多功能藥物製劑。另外，由於它能促進角質細胞的增殖，加速皮膚角質層 和基底層的修復，所以具有延緩皮膚細胞衰老，促進皮膚細胞修復，使皮膚光滑 豐潤的作用，因此可用於美容和化妝品行業。因此，具有非常重要的商業價值和 十分廣闊的市場開發和應用前景。


圖l為表達載體ptrpTRX的質粒圖2為BL21的超聲破碎和肝素親和層析純化結果；
圖3為凝血酶切割目的蛋白的電泳結果圖4為SP陽離子親和層析純化結果；
圖5為KGF-1/GLYS蛋白對IEC-6細胞促增殖實驗結果；
圖6為使用兩種不同載體表達KGF-1/GLYS的產量比較圖。
具體實施例方式
實施例一人KGF-l的cDNA^列的獲得
根據GENBANK和文獻報導的人KGF氨基醋列(由163個胺基酸組成)，設 計合成針對KGF-1基因的特異引物(見序列表中序列5和6),利用PCR方法從人 胎肝cDNA文庫中擴增出KGF-lcDNA。酶切後與測序載體連接，製備重組質粒， 轉化感受態細胞，篩選陽性克隆並測序。測序結果與序列表中序列l完全一致，其編碼的序列見序列表中序列2。
實施例二 KGF-l/GLYScDNA^列的獲得
以上面製備的含有KGF-1基因序列的重組質粒為模板，分別用兩對引物(見序 列表中序列7和9，序列8和10)擴增，引入N128S的突變點，獲得含KGF-1/GLYS N128S全長基因的兩個重疊片段。然後，將兩個片段混合作為模板，利用兩端引 物(見序列表中序列7和8)進行PCR^應(此時引物已將第23位R突變為G),這時 獲得R23G和N128S同時突變成功的cDNA片段。將該cDNA片段回收酶切後與相 同酶切的載體連接，連接產物轉化感受態細胞，篩選陽性克隆並送測序。
實施例三ptrpTRX/KGF-l/GLYS重組質粒的構建
以KGF-1/GLYS基因為模板，設計合成針對KGF-1/GLYS的特異引物(見序列 表中序列5和6)，通過PCR擴增出長度約為435bp,兩端分別含有5aw/71 (GGATCC )和五coi I酶切位點的KGF-1/GLYSPCR產物，將該PCR產物用5am/f I和五coi I雙酶切，然後連接到用這兩種酶相同處理過的表達載體ptrpTRX中，構 建表達質粒ptrpTRX/KGF-l/GLYS。圖l為表達載體ptrpTRX的質粒圖。將該質粒轉 化至感受態細胞topolO中。培養增殖後從轉化抹中抽提重組質粒，按已知的方法 並使用通用引物(T7promoter)測序。經測序，證明獲得正確的KGF-1/GLYS cDNA 序列，見序列表中序列3，其編碼的氨基S交序列見序列表中序列4，該質粒記為 ptrpTRX/KGF- 1/GLYS。將質粒轉化大腸桿菌BL21中。 實施例四發酵培養
分別從ptrpTRXZKGF- 1/GLYS轉化大腸桿菌BL21的平板上挑取單克隆菌落，接 入50ml的氨千抗性LB培養基中，30°。培養至00600=0.6 ~ 1.0。收菌，並轉接入氨 千抗性的18升LB培養基中，30。C培養至OD6。cr0.6-1.0，添加0.5mM誘導劑IPTG， 繼續培養8小時，發酵結束。從含有KGF-1/GLYS轉化的大腸桿菌的平板上挑取單克隆菌落，接入培養基中培養，並誘導表達，離心收M。菌體沉澱進行超聲破碎，
離心取上清分別過肝素親和層析柱和SP陽離子柱，圖2為BL21超聲破和肝素親和 層析純化結果，其中欄1-IO分別表示低分子量標準、ptrpTRX轉化的BL21、 ptrpTRX/KGF-l/GLYS轉化的BL21、全菌上清、全菌沉澱、肝素親和層析流穿、 O.lMNaCl洗脫峰、1MNaCl洗脫峰l、 1MNaCl洗脫峰2和lMNaCl洗脫峰3。由 圖2的結果可知，融合蛋白表達分子量正確，而且其表達產物以可溶表達為主。而 且其能與肝素親和層析填料上肝素基團特異結合，是FGF家族蛋白的共同特點。 實施例五KGF-1突變體蛋白的分離純化
發酵結束後，6000rpm離心收集菌體，加入20mMTris-CL重懸菌體，利用超 聲波破碎儀破碎細胞，12000rpm離心20分鐘，收集上清。將該上清首先通過已用 20mMTris-CL平衡過的肝素凝膠柱.用含O. lmol/L NaCl的Tris-CL(pH7.0)溶液洗柱 後，加入含lmol/LNaCl的Tris-CL(pH7.0)溶液洗脫目的蛋白。將目的蛋白使用凝 血酶切割，圓3為凝血酶切割目的蛋白的電泳結果圖，其中1 _ 3欄分別為肝素親和 層析洗脫峰、凝血酶切割後蛋白、低分子量標準。由圖3結果可知，經過凝血酶切 割後原來的蛋白消失，產生新的條帶(由於TRX和KGF/GLYS大小都約為16KD， 因此電泳沒有分開)。再通過已用含0.5mol/LNaCl的PB平衡過的SP陽離子交換 柱，用lmol/LNaCl的PB(PH7.4)洗脫目的蛋白。將收集的洗脫峰超濾濃縮後，通 過分子篩S-200凝膠柱進行分離。純化後的蛋白經12%的聚丙烯醯胺凝膠電泳分離 後，考馬斯亮藍染色顯示分子量為約16kD的單一條帶，通過胺基酸N端測序以及 胺基酸組成分析證實按本發明方法製備的蛋白的真實性(圖4)。圖4為SP陽離子 親和層析純化結果，其中l - 3欄分別為低分子量標準、1MNaCl洗脫峰l、 1MNaCl 洗脫峰2。經15。/。的SDS-PAGE電泳鑑定純化產物僅為一條目的條帶，大小約為 16kD。實施例六MTT法測定KGF-1/GLYS的活性
正C-6細胞為正常小鼠空腸上皮細胞，用含10。/。胎牛血清的DMEM培養液培 養至80%融合時，收集細胞，以3xlS個/孔接種於96孔板細月包培養板中，lOOpL/ 孔；然後分別在每孔加入10pL按倍比稀釋的KGF-l/GLYS突變體蛋白樣品，終濃 度分別為3.75 , 6.25 , 12.5 , 25和50ng/mL,設不加因子的陰性對照即Ong/mL, 每個濃度重複做3個復孔，培養24h後每孔加入5mg/ml的MTT20pL，繼續培養5h 後，每孔加入100pL 10% SDS(溶於0.01NNaCl中)，待紫色結晶溶解後，測定570nm 的吸光值。對重組人的KGF-l/GLYS和商品化的rhKGF-l的增殖作用的測定結果進 行比較，表明KGF-l/GLYS的促上皮細胞增殖活性較rhKGF-l明顯增強，而且差異 顯著，結果見圖5，圖5為KGF-l/GLYS蛋白對正C-6細胞促增殖實驗結果。本發明 通過實驗證明了KGF-l/GLYS促細胞增殖活性較rhKGF-l顯著增強，因此具有 rhKGF-l的各種功能和用途。
實施例七不同載體蛋白收率的比較
使用兩種不同載體pET22b和ptrp-TRX構建KGF-l/GLYS的表達菌抹，構建成 功後，同時使用1L的培養基進行放大培養、收菌和純化，使用lowey檢測蛋白濃度， 做三次重複後計算均數和標準差，比較兩者差別。圖6為使用兩種不同載體表達 KGF-1/GLYS的產量比較圖。由圖6可知，使用pET22b載體表達從l升培養基獲得 0.83mg蛋白，而使用ptrp-TRX載體表達可以獲得16.1mg蛋白。兩種方法收率相差 將近20倍，差別具有統計學差異。序列表
中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院
—種人角質細胞生長因子-1結構類似物及其製備方法和應用
10
1
498
DNA
1
tcgcatatgt gcaacgatat gactccagaa cagatggcaa ctaacgtgaa ctgcagcagc 60 ccagaacgtc atactcgtag ctatgattac atggaaggtg gtgatattcg tgtgcgtcgt 120 ctgttctgtc gtacccagtg gtatctgcgt atcgataaac gtggcaaagt aaaaggcacc 180 caagaaatga agaataatta caatatcatg gaaatccgta ccgtggcagt tggtattgtg 240 gcaatcaaag gcgtggaaag cgagttctat ctggcaatga acaaggaagg taaactgtat 300 gcaaagaaag aatgcaatga agattgtaac ttcaaagaac tgattctgga aaaccattac 360 aacacctacg catctgctaa atggacccac aacggtggcg aaatgtttgt tgccctgaat 420 caaaagggca ttccggtgcg tggtaaaaaa accaagaaag aacaaaaaac cgcccacttt 480 ctgcctatgg caatcact
2 163 PRT 2
Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Val Asn Cys Ser
5 10 15
Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp
20 25 30
lie Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Tip Tyr Leu Arg lie
35 40 45
Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr50 55 60
Asn lie Met Glu lie Arg Thr Val Ala Val Gly lie Val Ala lie Lys 65 70 75 80
Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu
85 90 95
Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu lie
100 105 110
Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Tip Thr His Asn
115 120 125
Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gin Lys Gly lie Pro Val Arg
130 135 140
Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met 145 150 155 160
Ala lie Thr
3 423 DNA 3
ggtagctatg attacatgga aggtggtgat attcgtgtgc gtcgtctgtt ctgtcgtacc 60
cagtggtatc tgcgtatcga taaacgtggc aaagtaaaag gcacccgtga aatgaagaat 120
aattacaata tcatggaaat ccgtaccgtg gcagttggta ttgtggcaat caaaggcgtg 180
gaaagcgagt tctatctggc aatgaacaag gaaggtaaac tgtatgcaaa gaaagaatgc 240
aatgaagatt gtaacttcaa agaactgatt ctggaaaacc attacaacac ctacgcatct 300
gctaaatgga cccactctgg tggcgaaatg tttgttgccc tgaatcaaaa gggcattccg 360
gtgcgtggta aaaaaaccaa gaaagaacaa aaaaccgccc actttctgcc tatggcaatc 420 acttaagaattcctg
<210〉4 141PRT 4
Gly Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp lie Arg Val Arg Arg Leu Phe
5 10 15
Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg lie Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys
20 25 30
Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn lie Met Glu lie Arg Thr
35 40 45
Val Ala Val Gly lie Val Ala lie Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr
50 55 60 65
Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn
70 75 80
Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu lie Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr
85 90 95
Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Ser Gly Gly Glu Met Phe Val Ala
100 105 110
Leu Asn Gin Lys Gly lie Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu
115 120 125
Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala lie Thr 130 135 140
5 23 DNA 5
tcgcatatgtgcaacgatatg 21
6
23
DNA6
agtgattgccataggcagaaa 21
7 23 DNA 7
gatgatggatccggtagctatgattacatggaaggtg 3 7
8 23 DNA 8
gatgatgaattcttaagtgattgccataggcaga 3 4
9 23 DNA 9
caccagagtgggtccatttagc 22
10 23 DNA 10
gctaaatggacccactctggtg 2權利要求
1、一種人角質細胞生長因子-1結構類似物，其特徵在於，與人角質細胞生長因子-1的蛋白質結構相比較，所述結構類似物的蛋白序列的N末端缺失22個胺基酸，將第23位胺基酸殘基由精氨酸突變為甘氨酸，第128位胺基酸殘基突變由天冬醯胺突變為非極性胺基酸。
2、 如權利要求1所述的人角質細胞生長因子-1結構類似物，其特徵在於， 所述的非極性胺基酸為絲氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸。
3、 如權利要求1所述的人角質細胞生長因子-1結構類似物，其特徵在於， 所述的非極性胺基酸為絲氨酸。
4、 一種重組表達載體，其特徵在於，所述重組表達載體含有權利要求1 - 3 之一所述的人角質細胞生長因子-1結構類似物的基因序列。
5、 如權利要求4所述的重組表達載體，其特徵在於，所述的重組表達載體 具有trp啟動子，並與編碼具有輔助表達摺疊功能的TRX蛋白的基因可操作的 連接。
6、 一種如權利要求l - 3之一所述的人角質細胞生長因子-l結構類似物的制 備方法，其特徵在於，通過PCR擴增得到含突變位點的人角質細胞生長因子-1的 cDNA，將所述cDNA片段與表達載體連接，連接產物轉化感受態細胞，篩選陽 性克隆，表達純化。
7、 如權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，所述的突變位點包括R23G 和N128S。
8、 如權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，所述的表達載體具有trp 啟動子，並與編碼具有輔助表達摺疊功能的TRX蛋白的基因可操作的連接。
9、 權利要求1 - 3之一所述的人角質細胞生長因子-1結構類似物在製備放、 化療損傷預防藥物、長效藥物、促進創傷癒合藥物或潰瘍治療藥物中的應用。
10、 權利要求1 - 3之一所述的人角質細胞生長因子-1結構類似物在化妝品 中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種人角質細胞生長因子的類似物，與人角質細胞生長因子的蛋白質結構相比較，該類似物的蛋白序列的N末端缺失22個胺基酸，將第23位胺基酸殘基由精氨酸突變為甘氨酸，第128位胺基酸殘基突變由天冬醯胺突變為非極性胺基酸。製備該蛋白時，通過PCR擴增得到含突變位點的人角質細胞生長因子-1的cDNA，將所述cDNA片段與表達載體連接，連接產物轉化感受態細胞，篩選陽性克隆，表達純化。特別提出一種重組表達載體，其含有上述人角質細胞生長因子-1結構類似物的基因序列。本發明的人角質細胞生長因子-1結構類似物可製備放、化療損傷預防藥物、長效藥物、促進創傷癒合藥物或潰瘍治療藥物，同時也可應用於化妝品中。
文檔編號A61P17/16GK101575372SQ20091004010
公開日2009年11月11日 申請日期2009年6月9日 優先權日2009年6月9日
發明者佘妙琴, 盛國慶, 蔡祥勝 申請人:中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院