淋巴管內皮細胞物質及方法
2023-10-25 06:09:22 2
專利名稱：淋巴管內皮細胞物質及方法
技術領域：
本發明主要涉及與內皮細胞分離相關的物質和方法，以及根據本發明而分離的細胞。更具體而言，本發明涉及獲取分離的淋巴管內皮細胞群。
背景技術：
淋巴系統是一種以與循環系統平行的方式組合而成的複合結構。與循環體統不同的是，循環系統是利用心臟將血液泵送至全身，而淋巴系統則是用淋巴管自身伸縮泵送淋巴液。淋巴管沒有象血管一樣交叉相連，而是形成一套輻射狀(coordinated)結構，包括初級淋巴竇[Jeltsch等″Science，2761423-1425(1997)；Castenholz，A.，Olszewski，W.L.(ed.)，Lymph StasisPathophysiology，Diagnosis，and Treatment.CRC PressBoca Raton，Florida(1991)，pp.15-42]，淋巴液由此流入淋巴毛細管，隨後到達匯集淋巴管，然後流入淋巴幹和淋巴導管，最終流入靜脈循環系統。淋巴液所流經管道的組成是不同的[Olszewski，W.L.，Olszewski，W.L.(ed)，Lymph StasisPathophysiology，Diagnosis，and Treatment.CRC PressBoca Raton，Florida(1991)，pp.235-258；Kinmonth，J.B.，Kinmonth，J.B.(ed)，The LymphaticDiseases，Lymphography and Surgery.Edward Arnold PublishersLondon，England(1972)，pp.82-86]，包括初級淋巴管的單內皮層，匯集淋巴管(collecting lymphatic)的複合層，其中包含內皮、肌肉及外膜層，以及淋巴結的複合結構。機體的不同器官如皮膚、肺及GI通道含有具各種獨特特性的淋巴組分。[見Ohkuma，M.，in Olszewski(1991)，出處同上，pp.157-190；Uhley，H.and Leeds，S.，Olszewski(1991)，pp.191-210；Barrowman，J.A.，Olszewski(1991)，pp.221-234).]血管內皮細胞生長因子(VEGF)是內皮細胞增殖、血管生成(angiogenesis)、血管發生(vasculogenesis)及血管通透性的主要調節因子(Ferrara，JMol Med77527-543，1999)。除VEGF之外，生長因子的VEGF家族目前還含有其它5種已知成員，名為胎盤生長因子(P1GF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和orf病毒VEGF同系物(eriksson and alitalo，Curr TopMicrobiol Immunol.，23741-57；1999)。近來還從蛇毒中分離出了其它新的VEGF-樣肝素結合蛋白(Gasmi等，Biochem Biophys Res Commun.268(1)69-72，2000；Gasmi等，Biochem Biophys Acta 1481(1)209-12，2000；Komori等，1999)。編碼VEGF或VEGF家族三受體VEGFR-1/Flt1、VEGFR-1/Flt1/KDR或VEGFR-1/Flt4中任一的基因的斷裂都會由於血管無法發育而導致胚胎的死亡(Dumont等，Science，282946-949，1998；Fong等，Nature，37666-70，1995；Shalaby等，Nature，37662-66，1995)。這些受體及其配體的詳細描述見美國專利5,776,755；美國專利5,607,918；美國專利5,840,693；美國專利5,928,939；美國專利5,776,755；美國專利6,130,071；美國專利6,221,839；美國專利6,235,713；美國專利6,245,530；1999年10月26日提交的申請號為09/427,657美國專利申請；2000年3月24日提交的申請號為09/534,376美國專利申請；2001年1月17日提交的申請號為60/262,476美國專利申請；以及1998年2月2日提交的PCT申請PCT/US98/01973。這些文獻中的每一篇在此都是作為一個整體專門引入作為參考。其它涉及血管內皮細胞生長因子及其受體的文獻還可參見例如，美國專利6,245,512；美國專利6,168,778；美國專利6,100,071；美國專利6,051,698；美國專利6,040,157；美國專利6,020,473；美國專利6,011,003，在此引入作為參考。
VEGFR-2被認為是血管生成和內皮細胞有絲分裂中主要的具信號傳導活性的VEGF受體。VEGF通過VEGFR-2的活化誘導內皮細胞增殖，遷移及存活，隨後的信號傳導途徑包括MAP(有絲分裂原-活化的蛋白)激酶/ERK(細胞外信號調控激酶)和磷脂醯肌醇(PI)-3途徑(有關綜述，參見Petrova等，Exp.Cell.Res.253117-130，1999；Shibuya等，In Clasesson-Welsh，L(ed.)Vasular Growth Factors And Angiogenesis.Springer Verlag，GmbHCo.，KG，Heidelberg，23759-83，1999)。許多細胞中p42/p44 MAPK(ERK1/ERK2)級聯反應的活化與增殖反應聯繫在一起。另外，該途徑還能通過刺激原存活基因(pro-survival gene)轉錄和翻譯後修飾以及細胞死亡機制中成分的滅活導致細胞存活率提高(Bonni等，Science，2861358-1362，1999；Gupta等，Exp.Cell.Res.，247495-504，1999)。起初認為所述PI-3激酶途徑還與有絲分裂相連，但是隨後的幾個試驗表明該途徑通過活化絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt(蛋白激酶B)在調控細胞存活方面發揮著重要作用(Datta等Genes Dev.132905-2927)。最近的試驗還表明MAPK和PI-3激酶信號傳導途徑之間存在一些交叉影響(crosstalk)Raf被Akt磷酸化導致Raf-MEK(MAP激酶的激酶)-ERK途徑被抑制(rommel等，Science，2861738-1741，1999；Zimmermannand Moelling，Science，2861741-1744，1999)。
分子生物學已證實至少有一些基因和蛋白在調節胚胎生長和/或胚胎發育中發揮著作用。所述基因/蛋白其中之一是名為Flt4的受體酪氨酸激酶(fms-樣酪氨酸激酶4；也稱為血管內皮細胞生長因子受體3或VEGFR-3)，克隆自人白血病細胞及胎盤cDNA文庫[參見美國專利5,776,755和美國專利6,107,046；Aprelikova等，Cancer Res.，52746-748(1992)；Galland等，Genomics，13475-478(1992)；Galland等，Oncogene，81233-1240(1993)；Pajusola等，Cancer Res.，525738-5743(1992)，所有文獻在此引入作為參考]。試驗表明，在小鼠胚胎中，VEGFR-3基因的斷裂會導致基本血管網絡無法改型(remodeling)，胚胎9.5天後死亡[Dumont等，Science，282946-949，(1998)]。其它試驗還表明VEGFR-3內的某些突變在遺傳性淋巴水腫中起著因果作用(公開號為WO00/58511的PCT申請)。但是，VEGFR-3並不僅局限於淋巴管。在淋巴管出現之前，VEGFR-3在胚胎血管系統發育中起著至關重要的作用。但是，另外有試驗表明，在進一步發育過程中，VEGFR-3的表達變得主要限於淋巴管[Kaipainen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，923566-3570(1995)]。但是，VEGFR-3的表達還出現在至少一些腫瘤的新生血管中(公開號為WO00/21560的PCT申請)。
在小鼠胚齡8.5天時VEGFR-3在發育的血管中開始表達，VEGFR-3缺陷胚胎會由於基本血管網絡無法改型而死於midgestation(Dumont等，Science，282946-949，1998)。但是，在成人組織中，VEGFR-3的表達主要發生在淋巴內皮(Kaipainen，等，proc.Natl.Acad.Sci.USA，923566-3570，1995；Partanen等，FASEBJ.，142087-2096，2000)，VEGFR-3的配體VEGF-C和VEGF-D能引發淋巴管的生長(Jeltsch等，Science，2761423-1425，1997；Veikkola等，EMBOJ.201223-1231)。相反，用可溶性VEGFR-3蛋白阻斷VEGFR-3信號傳導途徑會因引發內皮細胞凋亡而導致發育中的淋巴管退化(Mkinen等，Nature Med.，7199-205，2001)。但是，通過VEGFR-3活化的生化信號傳導途徑效果不如VEGFR-2的信號傳導途徑，因而使得該途徑難以確證這些淋巴管內皮細胞功能的重要調節因子的活化機制。在此類信息缺乏時，這些相互作用異常的治療和診斷意義還不甚明了。
此前，已有大量的VEGFR-3抗體被描述，參見例如，美國專利US6107046(在此引入作為參考)。此外，最近podoplanin已被鑑定為淋巴內皮的特異性標誌(Breiteneder-Geleff等，Am.J.Path.，154(2)385-394，1999)，而LYVE-1作為CD-44糖蛋白的一種同系物，則被認定為是hyaluron的淋巴-特異性受體(Banerji等，J.Biol.Chem.，144(4)789-801，1999)。但是，儘管有這些標誌物的存在，目前還沒有適當方法獲得分離的淋巴管內皮細胞。如果不能獲得所述的分離的淋巴細胞滿足分子試驗的需要，各種淋巴細胞病症的治療和診斷試驗大多數都無法進行。進一步而言，這類細胞的獲得能夠提供淋巴管內皮細胞特徵方面的有用信息，從而有助於進一步確定治療幹預的具體區域。
有大量疾病如遺傳性淋巴水腫，癌轉移及術後水腫，都涉及淋巴管內皮細胞及其受體的異常。能夠分離、培養並替代淋巴管內皮細胞有利於此類疾病的緩解幹預、治療或其它改善方案。這類幹預對例如，損傷導致的淋巴水腫特別有效。而且，這類細胞的獲得特別有利於細胞特異性的治療方案從而大大減小非-細胞特異性基因治療或化療方法中出現的不良副反應。
發明概述本發明在操作內皮細胞以及淋巴和血管系統的能力上提供了明顯改進，這些改進在醫藥和分子生物學中具有眾多實際用途。更具體而言，本發明提供了一種從含有淋巴管內皮細胞的生物樣本中分離出淋巴管內皮細胞的方法，該方法包括讓所述生物樣本與一種抗體接觸，該抗體在其可與淋巴管內皮細胞結合的條件下能夠優先於其它內皮細胞識別淋巴管內皮細胞；分離與所述抗體結合的淋巴管內皮細胞。本發明中使用的「抗體」是指能特異性結合靶抗原(例如，淋巴管內皮細胞)的任一抗體試劑或者含有能特異性識別該抗原的抗原結合片段的任一多肽。更具體地說，所述抗體具有針對VEGFR-3胞外區上表位的免疫反應活性，該表位是淋巴管內皮細胞特異性的。在本發明上下文中，「優先的」或「特異性的」是指所述抗體與靶抗原(例如，淋巴管內皮細胞上的VEGFR-3)結合時具有比其結合其它細胞上同類抗原(例如，血管內皮細胞上的VEGFR-3)具有更大的親和力。這種差異結合使得能夠將一種細胞類型同其它細胞類型分離開來。
應該能夠理解的是所述生物樣本可以出自任一種哺乳動物機體，可以是預期含有淋巴管內皮細胞的任一組織或體液樣本。具體優選的是來自人類患者的生物樣本。優選實施方案中，所述抗體被固定在固相支撐物上，所述生物樣本與所述支撐物接觸使得淋巴細胞與所述抗體結合從而結合到所述支撐物上。其它優選實施方案中，所述抗體用螢光標記物標記，通過螢光激活細胞分選方法分離出所述淋巴管內皮細胞。在另一優選實施方案中，所述抗體用磁性標記物標記，通過磁性激活細胞分選方法分離出所述淋巴管內皮細胞。還提供了用免疫組化方法分離生物樣本中的淋巴管內皮細胞。其它實施方案提供了用免疫組化方法分離淋巴管內皮細胞。
應該理解的是所述抗體可以是多克隆抗體也可以是單克隆抗體。在優選實施方案中，所述抗體是一種含有2E11D11的抗原結合片段的結合反應物。其它實施方案中，所述抗體是2E11D11的衍生物。其它實施方案中，所述抗體是一種含有從2E11D11的抗原結合片段衍生的抗原結合片段的結合反應物，所述抗原結合片段經突變或改變具有更強的VEGFR-3表位結合特異性，所述表位是淋巴管內皮細胞特異性的。其它實施方案中，所述抗體能識別VEGFR-3蛋白上的可被2E11D11識別的同一表位。在具體優選的實施方案中，所述抗體是2E11D11。(歐洲細胞培養物保藏中心的保藏號為01083129，Center for Applied Microbiology and Research，Porton Down Salisbury，U.K.)。該抗體的製備見美國專利6,107,046(在此引入作為參考)。其它優選實施方案中，抗體為抗-podoplanin。某些實施方案中，抗體為抗-podoplanin抗體的變體或衍生物，它具有淋巴管內皮細胞的結合特異性。
本發明的一些方面提供了從含微脈管內皮細胞的生物樣本中分離血管內皮細胞的方法，該方法包括讓所述生物樣本與能夠優先於其它內皮細胞識別淋巴管內皮細胞的抗體接觸，其中所述抗體具有針對VEGFR-3胞外區的免疫反應活性；從未與所述抗體結合的微脈管內皮細胞中移取與所述抗體結合的淋巴管內皮細胞，其中未被所述抗體結合的微脈管細胞中含有血管內皮細胞群且基本不含淋巴管內皮細胞。
本發明的另一方面還提供了按照下述方法分離的淋巴管內皮細胞群，該方法包括讓含有淋巴管內皮細胞的生物樣本與能夠優先結合淋巴管內皮細胞而非其它內皮細胞的抗體接觸，其中所述抗體具有針對VEGFR-3胞外區的免疫反應活性；分離被所述抗體結合的淋巴管內皮細胞。優選實施方案中，所述生物樣本含有異源的內皮細胞群。其它優選實施方案中，所述細胞樣本為微脈管內皮細胞群。具體優選的實施方案中，所述淋巴管內皮細胞群基本沒有汙染血管內皮細胞。優選方面，所述分離細胞的方法包括在培養中擴增(expand)淋巴管內皮細胞。
本發明的另一方面還提供了按照下述方法分離的淋巴管內皮細胞群，該方法包括讓微脈管內皮細胞群與能夠優先結合淋巴管內皮細胞而非血管內皮細胞的抗體接觸，其中所述抗體具有針對VEGFR-3胞外區的免疫反應活性；將被所述抗體結合的淋巴管內皮細胞從未被該抗體結合的微脈管細胞中移取出來，其中未被抗體結合的微脈管細胞中含有血管內皮細胞群且基本不含淋巴管內皮細胞。在具體實施方案中，獲得所述血管內皮細胞群的方法還包括擴增該血管內皮細胞群。
本發明的一個優選方面具體提供了一種基本不含其它汙染性內皮細胞的淋巴管內皮細胞群。本發明另一優選方面描述了一種基本不含其它汙染性內皮細胞的血管內皮細胞群。
本發明的一個優選實施方案涉及一種獲得基本富含淋巴管內皮細胞亞群的組合物的方法，該方法包括獲得一種含微脈管內皮細胞的細胞源；讓該細胞與一種能夠優先結合淋巴管內皮細胞而非其它內皮細胞的單克隆抗體在確保該抗體能結合淋巴管內皮細胞的條件下接觸；分離那些被所述單克隆抗體特異性結合的細胞，從而獲得基本富含淋巴管內皮細胞亞群的組合物。在優選方面，抗體是具有針對表達於淋巴管內皮細胞上抗原胞外區的免疫反應活性。另外的優選實施方案中，所述抗原是VEGFR-3。在優選方面，本發明還提供了一種包含通過所述方法得到的基本富集淋巴管內皮細胞亞群的組合物。在優選實施方案中，所述抗體為抗-podoplanin抗體。其它優選實施方案中，所述抗體為2E11D11，該抗體能優先識別表達於淋巴管內皮細胞上的VEGFR-3。
其它實施方案提供了一種改善淋巴管內皮細胞病症的方法，該方法包括將治療藥物靶向淋巴管內皮細胞，其中所述治療藥物是利用能夠優先結合淋巴管內皮細胞而非其它內皮細胞的抗體靶向所述細胞，其中所述抗體是具有針對VEGFR-3胞外區的免疫反應活性的抗體。在具體實施方案中，所述病症選自淋巴瘤、遺傳性淋巴水腫、淋巴水腫、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管肌瘤病、淋巴管擴張及水囊狀淋巴管瘤(cystic hygroma)。
本發明還提供了一種改善淋巴管病症的方法，其中所述方法包括回體(exvivo)治療，包括從需要治療的患者獲得生物樣本，其中所述生物樣本含有微脈管內皮細胞；讓該微脈管內皮細胞與能夠優先結合淋巴管內皮細胞而非其它內皮細胞的抗體接觸，其中所述抗體是具有針對VEGFR-3胞外區的免疫反應活性的抗體；分離出被所述抗體結合的淋巴管內皮細胞；用一表達構建體轉染該淋巴管內皮細胞，該構建體含有有效量的可操作地連接於一啟動子上的蛋白編碼核酸，所述有效量足以使所述蛋白在細胞中表達；將轉染後的細胞返回導入患者體內。所編碼的蛋白可以是本領域技術人員期望表達於淋巴管內皮細胞的任一蛋白(例如，為了治療疾病，減輕疾病症狀，或者為了更好地診斷或成像)。
本發明還提供了一種促進培養物中淋巴管內皮細胞生長的方法，該方法包括根據本發明方法獲得淋巴管內皮細胞；用VEGFR-3配體刺激該細胞；其中用VEGFR-3配體刺激細胞生長，與無刺激情況下生長相比，能夠促進所述細胞在培養中存活。在具體優選實施方案中，所述VEGFR-3配體是VEGF-C、VEGF-C156S或VEGF-D。該方法進一步包括用VEGFR-2配體刺激細胞。在具體實施方案中，提供了刺激細胞防止凋亡的方法。優選實施方案中，所述防止細胞凋亡的方法是通過活化Akt或p42/MAPK信號傳導分子來介導的。在優選實施方案中，刺激細胞使得該細胞保持了分化的內皮細胞的特性。
本發明提供了一種選擇性調控哺乳動物體內淋巴管內皮細胞的方法，該方法包括按照本發明所述方法從哺乳動物機體中分離淋巴管內皮細胞；讓分離的淋巴管內皮細胞與一種能調控淋巴管內皮細胞的物質接觸；將該淋巴管內皮細胞重新導入該機體。在優選方面，所述的接觸步驟包括將外源多核苷酸導入細胞。其它優選實施方案中，所述機體患有特徵為淋巴管內皮細胞表達的基因發生遺傳突變的病症，所述接觸包括將外源多核苷酸導入細胞以克服該基因中遺傳突變的影響。具體實施方案中，所述病症為遺傳性淋巴水腫。例如，所述病症是特徵為VEGFR-3突變的遺傳性淋巴水腫，治療包括導入野生型VEGFR-3等位基因。
本發明的另一方面描述了一種在取自脊椎動物機體的組織中使淋巴管內皮細胞成像的方法，該方法包括讓疑似含有淋巴管內皮細胞的脊椎動物組織與一種含有能優先結合淋巴管內皮細胞而非其它內皮細胞的抗體的組合物在能確保該抗體可結合淋巴管內皮細胞的條件下接觸；檢測與組織中淋巴管內皮細胞結合的抗體；通過鑑定被抗體結合的淋巴管內皮細胞而使淋巴內皮細胞在組織中成像，其中淋巴管內皮細胞與抗體的結合表明該組織中存在或居留有淋巴管內皮細胞。更具體地說，所述組織包括人體組織。具體實施方案中，所述方法進一步包括在接觸步驟之後成像步驟之前，在能從所述組織中將未與該組織中淋巴管內皮細胞結合的抗體取出的條件下洗滌該組織的步驟。所述抗體可以是具有針對VEGFR-3胞外區的免疫反應活性的抗體。其它實施方案中，所述抗體為抗-podoplanin抗體。優選實施方案中，所述抗體還含有一種與其共價相連的可檢測標記物。
所述方法還包括讓所述組織與第二種化合物接觸，這種化合物能特異性結合基本不出現於血管內皮中的淋巴管內皮標記物；以及，檢測與該組織中的細胞結合了的第二種化合物；其中所述成像步驟包括檢測被抗體和第二種化合物二者都標記了的淋巴管的步驟，其中被抗體和第二種化合物二者都標記了的淋巴管與組織中出現或居留淋巴管內皮細胞相關。優選實施方案中，所述抗體是具有針對VEGFR-3胞外區的免疫反應活性的抗體，所述第二種化合物為抗-podoplanin抗體。
另外，本發明還提供了一種篩查特徵在於淋巴管內皮細胞變化的疾病的方法，該方法包括從疑似患有特徵在於淋巴管內皮細胞變化的疾病的脊椎動物機體獲取組織樣本；將該組織樣本暴露於一種含有能優先結合淋巴管內皮細胞而非其它內皮細胞的抗體的組合物，所用條件允許該抗體結合機體內淋巴管內皮細胞；洗滌組織樣本；以及，通過檢測組織樣本中結合抗體的存在、量或分布篩查所述疾病。
另一實施方案提供了一種特異性檢測哺乳動物淋巴管內皮細胞的方法，該方法包括向哺乳動物施用一種含有能優先結合淋巴管內皮細胞而非其它內皮細胞的抗體的組合物，所用的條件允許該抗體結合淋巴管內皮細胞；以及，檢測結合了淋巴管內皮細胞的抗體，從而檢測機體中的淋巴管內皮細胞。所述方法還包括向哺乳動物施用可特異性結合淋巴管內皮細胞標誌物的第二種化合物；其中所述的檢測步驟包括檢測結合到淋巴管內皮細胞上的所述抗體和第二種化合物。在本發明所有成像方法中，成像方法可用於淋巴管病症，以確定病症是否存在以及監測該病症的治療效果。所述方法可具體用於評定淋巴水腫，例如遺傳性淋巴水腫，或損傷引發的水腫及其它淋巴管病症。
從本申請的全部內容得到本發明的其它特徵及變動對於本領域技術人員來說是顯而易見的，所有這類特徵都應該是本發明的各個方面。類似地，也可將本申請中所述的本發明特徵重組入也作為本發明方面的其它實施方案，而無需考慮這種特徵重組是否已在本發明方面或技術方案中專門提及。另外，只有那些在本申請中描述為對本發明至關重要的限制才應該視為如此；而缺乏未被本申請描述為至關重要的限制的本發明的變動應視為本發明的方面。
本發明的方面可概括歸類，應該理解的是其中每一不同成員都應視為本發明的不同方面。
附圖簡述下列附圖形成了本說明書的一部分，是為了進一步說明本發明的各個方面。參照1個或多個附圖結合本申請出給出的具體實施方案的詳細描述可以更好地理解本發明。
圖1A-圖1C.用Ba/F3生物學測定分析了不同VEGF的受體特異性。測定了所示濃度的不同VEGF的存在下，表達嵌合受體VEGFR-1/EpoR(圖1A)、VEGFR-2/EpoR(圖1B)或VEGFR-3/EpoR(圖1C)的Ba/F3細胞的存活能力。細胞存活力使用MTT測定。數據為三份平行試驗的平均值(平均值±標準差)。圖1D-圖1G為VEGF-C(圖1D，圖1E)和VEGF-C156S(圖IF，圖1G)與VEGFR-3(圖1D、圖IF)和VEGFR-2(圖1E、圖1G)之間相互作用的生物傳感器試驗。將嵌合受體蛋白固定於羧甲基葡聚糖表面。以20ul/分鐘的流速將所示濃度的生長因子注射到該表面。所示傳感器圖形(sensorgram)已經減去了讓同樣樣本通過空白對照通道(channel)時獲得的相應信號。生物傳感器實驗的動力學數據列於表1。
圖2A-圖2B.VEGFR-2和VEGFR-3活化配體能抑制血清-剝奪引發的HMVE細胞凋亡，而VEGFR-1活化配體不能。測量血清飢餓後的HMVE細胞中(圖2A)或者用VEGFR-3抗體經磁性細胞分選後的分離細胞群(圖2B)中的細胞質組氨酸-結合型DNA片段(單核小體及寡核小體)，所述HMVE細胞由血管內皮細胞和淋巴管內皮細胞兩種細胞群組成。把在無血清培養基(BSA)中生長了24小時的凋亡細胞中胞質寡核小體的富集係數選定為100(％)。數據為三個獨立試驗的平均值(平均值±標準差)。所用生長因子的濃度如下bFGF10ng/ml，P1GF500ng/ml，VEGF50ng/ml，VEGF-C100ng/ml，VEGF-C156S500ng/ml，VEGF-D500ng/ml，ORFV2-VEGF500ng/ml以及髓鞘鹼性蛋白(MBP)作為相關對照蛋白500ng/ml。
圖3.血清飢餓72小時後，對podoplanin陽性和陰性細胞群中的膜聯蛋白-V陽性細胞進行定量(佔附著細胞的％)。數據為5個計數區域(x400)的平均值(平均值±標準差)。
圖4.VEGFR-2或VEGFR-3刺激導致PI3-激酶依賴性Akt磷酸化。VEGF(灰色的圓)、VEGF-C(黑色方框)和VEGF-C156S(空心三角)誘導的具有不同動力學特性的Akt磷酸化。數據為三個試驗中磷酸化的Akt蛋白信號與總Akt蛋白信號光密度的相對值(平均值±標準差)。
圖5.VEGFR-3介導的內皮細胞遷移。在Boyden槽測定中，在不同VEGF存在的條件下，HMVE細胞的遷移情況。用10-倍摩爾過量的可溶性VEGFR-3預孵育VEGF-C156S後，VEGF-C156S刺激的遷移被阻斷(淺灰色柱條)，而VEGF刺激的遷移未被阻斷。數據為三個獨立試驗的平均值(平均值±標準差)。所用的生長因子濃度為VEGF10ng/ml，VEGF-C500ng/ml，VEGF-D500ng/ml和VEGF-C156S3μg/ml。
發明詳述在本發明中，為了提供VEGFR-3信號傳導途徑更詳細的特性，本發明已經使用VEGF-C及其VEGFR-3特異性突變體(VEGFC156S)研究了該信號傳導途徑。首次闡明了人皮膚內皮細胞原代培養物是由不同譜系的血管及淋巴管內皮細胞組成的，而且後者可用抗VEGFR-3的抗體分離。
具體而言，VEGFR-3特異地表達於淋巴管內皮細胞，其刺激能夠防止這些細胞出現血清剝奪誘導的凋亡並增加了細胞遷移。而且，本申請中的數據表明VEGFR-3能夠誘導PKC依賴性的p42/p44MAPK活化和Akt的沃特曼寧(wortmannin)-敏感性磷酸化。這兩個重要的信號級聯反應與細胞存活相關(Bonni等，Science，2861358-1362，1999；Datta等，Genes Dev.132905-2927，1999)。
根據本申請提供的細節，本領域技術人員應當能夠利用分子標記物如VEGFR-3分離出淋巴管內皮細胞。而且，本發明教導了在特定生長因子存在下培養這些細胞可以不損失這些細胞的分化特性。另外，還表明特異性的VEGFR-3配體能誘導細胞遷移，並且可以通過活化與細胞存活相關的兩種重要信號傳導分子Akt和p42/p44MAPK防止血清剝奪條件下淋巴管內皮細胞凋亡。現在能夠培養淋巴管內皮細胞就應該能進一步定性VEGFR-3信號傳導途徑以及血管內皮細胞相對於淋巴管內皮細胞的分子特性和基因表達譜(profile)。
A.製備和使用內皮細胞培養物的方法本發明人已發現微脈管內皮細胞由兩種不同的內皮細胞群組成，即，淋巴管內皮細胞和血管內皮細胞。本發明首次提供了一種從混合的微脈管內皮細胞群分離淋巴管內皮細胞的方法。一個相關暗示是能夠提供除盡了淋巴管內皮細胞的血管內皮細胞。本部分提供了本發明的綜述，本發明各個方面的其它細節可發現於本說明書全文的其它各處。
根據本發明的教導，現在能夠培養兩種類型的內皮細胞。所述培養不僅可用於細胞信號傳導和內皮細胞功能的研究而且還能為涉及新血管形成的疾病的治療性幹預提供條件，所述疾病包括例如，血管生成，淋巴管生成、遺傳性淋巴水腫等。
本領域技術人員可通過大量商品化來源獲得微脈管內皮細胞。所述商品化來源包括例如，Promocell(Heidelberg，Germany；Suppliers of HDMEC，增殖的或凍存的微脈管內皮細胞)；Cell Applications Inc.，(San Diego，Ca，USA，Supplier of CADMEC′，分離自正常人新生包皮(或成人皮膚)毛細管的微脈管內皮細胞)。其它的商品化來源也已為本領域技術人員已知。除這些細胞外，這些來源通常還能提供為將這些細胞保持在增殖狀態所需的範例性培養條件。因此這些商品化來源的細胞系和培養物是本發明所述方法特別有用的起始物質。含有微脈管內皮細胞的任一細胞培養物都可用於本發明。這種細胞培養物優選只含有微脈管內皮細胞，但是應該理解的是還含有除淋巴管和血管內皮細胞以外的細胞的細胞培養物也足以充當本發明的起始宿主細胞，只要該培養物中一些細胞是淋巴管內皮細胞即可。
除從商品化來源獲得以外，本領域技術人員也可從各物種，包括人分離微脈管內皮細胞。來自其它物種包括小鼠、大鼠、兔、狗、豬、馬及靈長類動物的細胞也可使用。因此，本發明專門涉及使用原代細胞培養物，特別是原代人微脈管細胞培養物。所述起始原代細胞培養物可以是只含有內皮細胞的細胞培養物，但是當原代細胞首次從受試者分離時，這樣的細胞培養物還可能會含有其它細胞如成纖維細胞、平滑肌細胞周皮細胞及從組織中分離所述內皮細胞時該組織所特有的其它細胞。這些汙染細胞可以用下述方法很容易地除去，例如，密度梯度離心，使用該細胞特異性標誌物進行免疫吸附層析，螢光激活細胞篩選，磁性激活細胞篩選及其它細胞分選技術。
通常，在這些事件中，微脈管內皮細胞有著明顯的器官特異性，所以原代微脈管內皮細胞培養物應該取自所要研究或調節的疾病所涉及的組織。通常，分離這些細胞的方法也為本領域技術人員已知，包括用胰蛋白酶和膠原酶消化給定組織；通過例如暴露於人血漿，密度離心，例如Percoll密度離心誘導微脈管內皮細胞聚集；最後用胰蛋白酶/EDTA定位消化後在光學顯微鏡下選取細胞並培養。
本發明的細胞培養於適合內皮細胞生長的培養基中，例如Ham′sF12培養基-10％胎牛血清(FCS)。這樣的培養物一旦製成，本領域技術人員就能通過觀察微脈管內皮細胞相關特性確定是否存在微脈管內皮細胞，例如，出現接觸抑制(即，生長為細胞單層)，典型內皮標誌物的表達，包括vonWillebrand因子(vWF)，血小板內皮細胞粘附分子1(PECAM-1，CD31)，以及血管緊張肽轉化酶(ACE)的轉錄，生成毛細管-樣的結構，等等。在本說明書其它地方，已經提供了範例性微脈管內皮細胞功能試驗的細節。
如上所述，本領域技術人員一般都知道微脈管內皮細胞的培養條件。在本發明中，細胞培養基可以添加多種生長因子及刺激物。在優選方面，所述細胞培養在有VEGFR-3的刺激物和/或VEGFR-2的刺激物存在的條件下，所述刺激物包括但不限於包括VEGF，VEGF-C，VEGF-C156S，VEGF-D和ORFV2-VEGF。這些及其它相關物質已為本領域技術人員熟知，見本說明書其它地方的進一步描述。
在本發明的優選用途中，延長分離的內皮細胞在培養基中的生長時間是有益的。通常，這類細胞在培養基中的生長往往是通過細胞凋亡終止的。本發明闡明細胞凋亡可通過用VEGFR-3和/或VEGFR-2的刺激物刺激來抑制、減緩和/或甚至阻止細胞凋亡。在具體優選的實施方案中，淋巴管內皮細胞在微脈管內皮細胞混合群體中的存活或者基本不含其它內皮細胞汙染物的真正的淋巴管內皮細胞分離培養物的存活可通過向培養基中添加VEGF-C或VEGF-C156S來提高。
在內皮細胞長成後，本發明方法提供了一種用能夠優先於其它內皮細胞識別淋巴管內皮細胞的抗體從微脈管內皮細胞混合細胞群中分離淋巴管內皮細胞的方法。更具體地說，所述抗體為具有針對VEGFR-3胞外區免疫反應活性的抗體。在一具體優選方面，證明抗-VEGFR-3抗體2E11D11是特異性針對淋巴管內皮細胞的。特異於淋巴管內皮細胞的另一範例抗體為抗-podoplanin抗體。儘管本發明多數實施例中使用了這些抗體，應該理解的是由於有本發明的教導，也可鑑定滿足本發明的分離目的的其它抗體。例如，如下文所述，其它這類抗體可用生產單克隆抗體的常規方法製備，這些常規方法可使用由這些範例抗體識別的相同表位。替代地，其它抗體也可用本領域熟知的噬菌體-展示技術製備和分離。另一種方法是生產2E11D11或抗-podoplanin抗體的相關抗體，在抗體的特定位點進行定點誘變製備出特異性針對淋巴管內皮細胞的第二代抗體。製備這類抗體的方法在本申請下文有更詳細的描述。
″特異性針對淋巴管內皮細胞″，是指該抗體能夠識別內皮細胞混合群中的淋巴管內皮細胞且不識別或較差程度識別內皮細胞中的血管內皮細胞譜系。這種結合差異使得能夠將一種細胞類型從混合群中分離出來。
由於本發明表明微脈管內皮細胞通常由血管內皮細胞和淋巴管內皮細胞混合群組成，而且本發明首次詳細提供了如何從微脈管內皮細胞培養物分離淋巴管內皮細胞，從而使內皮細胞基本不含其它汙染的內皮細胞，例如血管內皮細胞，所以，應當理解的是本發明也應該包括分離基本不含其它汙染內皮細胞如淋巴管內皮細胞的血管內皮細胞的方法。
當提到細胞群「基本不含」汙染細胞時，本發明並不是指要求所述細胞培養絕對不含汙染細胞。而是意味著，培養物中的大部分細胞都是指定細胞類型。例如，在基本不含其它汙染細胞的淋巴管內皮細胞培養物中，希望至少51％的細胞是淋巴管內皮細胞。較優選，至少60％的細胞是淋巴管內皮細胞。另外更優選包含至少70％的淋巴管內皮細胞，甚至更優選75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％的淋巴管內皮細胞。本發明的一特別優選方法分離淋巴管內皮細胞，使得培養物中包含多於90％的淋巴管內皮細胞。顯然，培養物越純，培養物中淋巴管內皮細胞百分比就越高，最優選細胞培養物含有95％，96％，97％，98％99％甚至100％的淋巴管內皮細胞。當然，應該理解的是這些數字不僅限於淋巴管內皮細胞，也適用於基本純化的血管內皮細胞群。為了測定細胞類型，本領域技術人員可測定任一給定細胞的特異性標誌物的存在與否。例如，可以通過VEGFR-3的存在，podoplanin以及其它淋巴細胞標誌物如LYVE-1的存在，鑑定淋巴管內皮細胞。可與上述標誌物結合使用的其它VEGFR-3特異性抗體包括9D9F9和7B3F9以及美國專利6,107,046中所述的那些抗體。當然，應該理解的是標誌物的組合是特別有益的。其它用於測定細胞功能的試驗也已在本申請中描述並已為本領域技術人員已知。
在替代性實施方案中，本發明方法製備的細胞培養物，無論是基本純化的淋巴管內皮細胞培養物還是基本純化的內皮細胞培養物，都可認為其含有最少量的汙染細胞。就汙染細胞而言，它可以指不是培養物組成主體的細胞類型的任一細胞。例如，淋巴管內皮細胞培養物中的汙染細胞為非淋巴管內皮細胞的任一細胞。類似地，血管內皮細胞培養物中的汙染細胞為非血管內皮細胞的任一細胞。淋巴管內皮細胞培養物的汙染細胞的實例為血管內皮細胞，反之亦然，當然，其它細胞類型如成纖維細胞也落在汙染細胞範疇之內。鑑定汙染細胞相對容易，例如可篩選具有特異性標誌物的細胞。因此，在優選實施方案中，本發明方法製備的細胞培養物含有小於49％的汙染細胞，更優選這些培養物含有小於45％，小於40％，小於35％，小於30％，小於25％，小於20％小於15％，小於14％的汙染細胞，小於13％的汙染細胞，小於12％的汙染細胞，小於11％的汙染細胞或小於10％的汙染細胞.。顯然，培養物越純，培養物細胞中汙染細胞所佔百分比越小，最優選的細胞培養物含有小於9％的汙染細胞，小於8％的汙染細胞，小於7％的汙染細胞，小於6％的汙染細胞，小於5％的汙染細胞，小於4％的汙染細胞，小於3％的汙染細胞，小於2％的汙染細胞，甚至小於1％的汙染細胞。
在本發明的一些方面，本發明提供了使用本發明所述分離細胞群進行的治療和診斷方法。例如，本發明所述方法可用於從疑似患有淋巴管內皮細胞相關或者血管內皮細胞實際相關病症的個體分離細胞。在診斷用途中，可以對來自患者個體的細胞進行分析，確定特定細胞或生化標誌物或者作為疾病狀態指徵的細胞特性是否存在、缺乏或變化。類似測定也可用於治療目的，其中包括在施用具體治療之前及之後分離細胞，該治療目標在於治療所述細胞相關病症，然後測定治療幹預是否達到預期效果。在另外的實施方案中，本發明所述的分離的細胞可用於促進與細胞的物理、生化或分子特性異常相關的病症的有效治療。在範例性實施方案中，可以通過體外測試潛在治療對患者細胞的效果，來測定該患者細胞是否應答所述幹預，以此促進治療。替代地，所述細胞也可用於回體基因治療，其中包括用基因表達構建體體外轉導從患者分離的細胞，擴增然後輸送回個體以從分子水平上校正患者病症。在另一替代性實施方案中，可用經過分離、擴增的本發明所述細胞將治療物遞送到指定區域。例如，在將細胞送回患者體內之前，在細胞上連接一僅特異性靶向患者淋巴管內皮細胞的細胞毒性治療藥物。本發明的這些及其它方面將在下文作更詳細的討論。
B.VEGFR-3信號傳導途徑作用的闡釋由於本發明首次能夠分離出基本不含汙染細胞的淋巴管內皮細胞群，所以現在有可能確定，VEGFR-3信號傳導在淋巴管內皮細胞中令人費解的作用以及這些細胞在淋巴管生成及淋巴管病症等現象中的作用。
儘管VEGFR-2的刺激能促進細胞活力，但是撤回VEGF會導致體內內皮細胞凋亡，抑制血管生成以及引發血管退化(Aiello等，Proc.Nat′l Acad.Sci.，9210457-10461，1995；Ferrara等，Nature Med.，4336-340，1998；Gerber等，Development，1261149-1159，1999)。類似地，抑制VEGFR-3信號傳導會導致發育中淋巴管退化(Makinen等，Nature Med.，7199-205，2001)。與以前公開的研究一致，VEGFR-2刺激強效防止血清-剝奪條件下原代內皮細胞的凋亡。這種作用通過VEGFR-2單個(經ORFV2-VEGF)以及與VEGFR-1刺激(經VEGF)聯合或與VEGFR-3刺激(經VEGF-C)聯合產生。但是，VEGFR-1(經P1GF刺激)只傳導非常弱的，如果有的話，細胞存活信號。另外，VEGFR-3信號傳導單獨足以抑制血清剝奪導致的凋亡。值得注意的是，儘管VEGF-C對於血管內皮細胞來說是一種比VEGF更弱的存活信號，但是它卻能強效促進表達VEGFR-3的淋巴管內皮細胞的存活。
VEGFR-3誘導兩種重要存活信號傳導分子p42/p44MAPK和Akt的磷酸化。PKC抑制劑大大減少VEGFR-3介導的p42/p44MAPK磷酸化，表明這種途徑主要是通過PKC傳送，而不是通過Ras，這與以前研究VEGFR-2的結果類似(Doanes等，Biochem.Biophys.Res.Commun.255545-548，1999；Takahashi等，Oncogene，182221-2230，1999；Yoshiji等，Cancer Res.，594413-4418，1999)。該途徑是受體酪氨酸激酶中獨一無二的，因為典型的PKC-依賴性MAPK活化被認為主要是通過某種七跨膜區，G蛋白-偶聯受體執行的。PKC調控血管生成中涉及的許多內皮細胞過程，包括內皮細胞增殖及遷移(Harrington等，Biochem，Biophys.Res.Commun.，271499-508，2000；Harrington等，J.Biol.Chem.，2727390-7397，1997；Ilan等，J.Cell Sci.，1113621-3631，1998)，抑制PKC能夠阻斷腫瘤新血管生成(Yoshiji等，Cancer Res.，594413-4418，1999)。
儘管p42/p44MAPK活化的動力學與VEGF或VEGF-C刺激的HMVE細胞類似，但是後者誘導反應更加持久。已報導p42/p44MAPK的活化持續時間和亞細胞分布上的差異導致不同的細胞應答(Kaiser等，Exp.Cell Res.，249349-358，1999；Marshall，Cell80179-185，1995；Pang等，J.Biol.Chem.，27013585-13588，1995)。所述差異可能是由於只有VEGF-C能夠同時通過VEGFR-2和VEGFR-3傳導信號。但是，儘管已查明VEGF-誘導的VEGFR-1和VEGFR-2的同源-或異源二聚複合體能有差異地調節有絲分裂發生(Rahimi等，J.Biol.Chem.，27516986-16992，2000)，但是我們還沒有在VEGF-C刺激的細胞中檢測到由VEGFR-2和VEGFR-3形成的異源二聚體。
VEGF-C的VEGFR-3特異性突變形式VEGF-C156S被證實是研究VEGFR-3介導的信號傳導的很有價值的工具(Joukov等，EMBO J.，15290-298，1998；Veikkola等，FMBO J.，201223-1231，2001；美國專利6,130,071)。在生物傳感器試驗中，與野生型VEGF-C相比，VEGF-C156S對VEGFR-3的親和力減小了。而且，VEGF-C156S誘導的最大限度的VEGFR-3磷酸化或p42/p44MAPK活化，其強度不及VEGF-C。儘管其中原因不清楚，但是VEGF-C156S可能比野生型VEGF-C更不穩定，因為形成胱氨酸結生長因子結構域的8個保守半胱氨酸殘基中的1個已經變成為絲氨酸殘基。但是，在一轉基因模型中，VEGF-C156S與野生型VEGF-C在促進淋巴管生成方面卻有著同等效果(Veikkola等，EMBO J.，201223-1231，2001)。另外，本申請所述試驗中使用濃度應該要使VEGFR-3飽和。因此，由於甚至最大濃度VEGF-C156S防止細胞凋亡的效果都不如VEGF-C，所以要使淋巴管內皮細胞達到VEGF-C誘導的最大限度存活可能要將VEGFR-2和VEGFR-3二者同時活化。
C.淋巴管內皮細胞特異性抗體本發明已經表明用抗VEGFR-3胞外區的特定抗體可以將培養的人原代微脈管內皮細胞分離為明顯區別的穩定的血管內皮細胞系和淋巴管內皮細胞，而且這兩種細胞系都可擴增培養。本部分描述了這些分離技術所用的抗體，而且進一步描述了製備其它可用於本發明的抗體的方法。
本發明具體優選的抗體包括例如2E11D11(Jussila等，Cancer Res.581599-1604，1998；美國專利6,107,046)和抗-人podoplanin(Breiteneder-Geleff等，等，Am.J.Path.，154(2)385-394，1999)。這些抗體已為本領域技術人員已知。VEGFR-3特異性抗體(也稱為Flt4)製備的詳細描述見美國專利6,107,046，在此專門引入作為參考。
由於本發明教導2E11D11和抗-podoplanin抗體可特異性識別淋巴管內皮細胞，所以本領域技術人員應該能夠製備出其它能識別這些抗體所識別的特異性表位的抗體。因此，用VEGFR-3中被2E11D11識別的部分，本領域技術人員應該能製備出其它可識別淋巴管內皮細胞的抗體。所以，所述抗體優選具有針對下述部分的免疫反應活性VEGFR-3中被2E11D11識別部分，或者VEGFR-3中可使抗體能優先特異性識別淋巴管內皮細胞而非任一其它細胞類型的任一其它部分。優先於其它任一細胞類型，那麼就意味所述抗體與淋巴管內皮細胞間的反應活性強於與任一其它細胞的反應，包括與其它內皮細胞如血管內皮細胞的反應。
另外，2E11D11抗體優先識別表達於淋巴管內皮細胞的VEGFR-3，次而識別表達於血管內皮細胞的VEGFR-3，這一發現表明可以用常規免疫及篩選技術分離所述抗體(參見，例如，Harlow and Lane，ANTIBODIESALABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1988)。可以根據與本申請所述不同細胞群的結合特異性或交叉-反應性篩選出VEGFR-3抗體群。
可用於本發明的抗體包括但不限於多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和由Fab表達文庫製得的片段、雙功能/雙特異性抗體、人源化抗體、CDR-移植抗體，人抗體和含有特異於VEGFR-3的CDR序列的部分的抗體。中和抗體，即能抑制VEGFR-3活性的那些抗體也可使用。優選實施方案中，抗體為單克隆抗體。製備及定性這些抗體的方法已為本領域熟知(參見，例如，Harlow and Lane，ANTIBODIESA LABORATORYMANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1988)。
簡而言之，製備多克隆抗體包括，用含本發明多肽的免疫原免疫動物，然後從免疫後的動物收集抗血清。很多種動物都可以用來製備抗血清。通常用於製備抗血清的動物為非人的動物包括兔、小鼠、大鼠、倉鼠、山羊、綿羊、豬或馬。由於兔有相對大的血液容量，所以兔是優選用於製備多克隆抗體的選擇。
根據宿主種類的不同，可使用不同的佐劑增強免疫應答。包括但不限於Freund′s，礦物膠如氫氧化鋁，表面活性劑如溶血卵磷脂，pluronic polyols，聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔血藍蛋白，及二硝基苯酚。BCG(卡介菌)和短小棒狀桿菌是潛在有用的人用佐劑。
特異性針對抗原同工型的抗體，包括多克隆抗體和單克隆抗體都可用本領域技術人員通常所知的常規免疫技術製備。本申請中使用的「特異性針對」意指抗體的可變區能識別和結合可確保該抗體特異地和優先地識別淋巴管內皮細胞的表位，而且能將所述表位與其它抗原區分開來，例如其它的VEGF受體或表達於非-淋巴管細胞的相同受體。含有抗原性表位如2E11D11或抗-podoplanin識別表位的組合物可用於免疫一種或多種試驗動物，例如兔或小鼠，然後這些動物產生抗本發明所述化合物的抗體。在經過足夠抗體生成的時間後，僅通過動物採血以及從全血製備出血清樣品就可以得到多克隆抗體。
本發明使用的單克隆抗體可以用連續細胞系培養物生產抗體分子的任一技術來製備。這些技術包括但不限於最初描述於Koehler and Milstein(Nature 256495-497，1975)的雜交瘤技術，人B-細胞雜交瘤技術(Kosbor等，Imniunol Today472，1983；Cote等，Proc Natl Acad Sci802026-2030，1983)以及EBV-雜交瘤技術(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R Liss Inc，New York N.Y.，pp77-96，(1985)。
當使用雜交瘤技術時，可使用骨髓瘤細胞系。適於製備雜交瘤的融合方法的這類細胞系優選是非產抗體的，具有高融合效率，酶缺陷使得它們在僅支持所需融合細胞(雜交瘤)的特定選擇性培養基中無法生長。例如，當所免疫動物是小鼠時，可以使用P3-X63/Ag8，P3-X63-Ag8.653，NS1/1.Ag 41，Sp210-Ag14，FO，NSO/U，MPC-11，MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XXOBul；而所免疫動物是大鼠時，可以使用R210.RCY3，Y3-Ag 1.2.3，IR983F和4B210；U-266，GM1500-GRG2，LICR-LON-HMy2和UC729-6都可以用於細胞融合。值得注意的是，用製備單克隆抗體的這類技術製備的雜交瘤和細胞系都是本發明的新組合物。
在製備與所選VEGFR-3表位發生免疫反應的多克隆抗血清的範例性方法中，將50μgVEGFR-3抗原用Freund′s完全佐劑乳化後免疫兔。以例如21天的間隔，將50μg表位用Freund′s不完全佐劑乳化後加強免疫。
為了製備單克隆抗體，用重組VEGFR-3周期性注射小鼠，以製備抗重組VEGFR-3的抗體(例如，10-20μg用Freund’s完全佐劑乳化)。用含可特異性識別PBS中淋巴管內皮細胞的表位的VEGFR-3多肽對小鼠作融合前最後一次加強免疫，4天後宰殺小鼠，取脾。將脾置於10ml無血清RPMI1640中，用浸沒於無血清RPMI1640中的兩塊玻璃顯微鏡載片的磨砂端之間研磨脾形成單細胞懸液，添加2mML-穀氨醯胺，1mM丙酮酸鈉，100單位/ml青黴素，和100μg/ml鏈黴素(RPMI)(Gibco，Canada)。將該細胞懸液用無菌70-目Nitex細胞濾網(Becton Dickinson，Parsippany，New Jersey)過濾，然後通過200g離心5分鐘洗滌兩次，將沉澱重懸於20ml無血清RPMI。用相同的方法從三個未處理的(naive)Balb/c小鼠製備脾細胞，用作對照。將融合前在添加有11％胎牛血清(FBS)(Hyclone Laboratories，Inc.，Logan，Utah)的RPMI中以對數期維持了3天的NS-1骨髓瘤細胞以200g離心5分鐘，按照上文中描述方式洗滌兩次。
將1×108脾細胞和2.0×107NS-1細胞合併後離心，吸除上清。輕輕擊打試管使細胞沉澱鬆動，1分鐘過程中振蕩加入1ml37℃PEG1500(50％的75mMHepes溶液，pH8.0)(Boehringer Mannheim)，然後7分鐘過程中加入7ml無血清RPMI。再另加入8mlRPMI，200g離心細胞10分鐘。棄去上清後，將沉澱重懸於含15％FBS，100μM次黃嘌呤酸鈉(sodiumhypoxanthine)，0.4uM氨基喋呤，16μM胸苷(HAT)(Gibco)，25單位/mlIL-6(Boehringer Mannheim)和1.5×106脾細胞/ml的200mlRPMI中，鋪板於10Corning平底96-孔組織培養平板(Corning，Coming New York)。
在融合後的第2、4和6天時，從融合平板的孔取出100μl培養基，代之以新鮮培養基。第8天時，用ELISA篩選融合細胞，按照下述方法測試有無可結合VEGFR-3的小鼠IgG。在37℃下將Immulon4平板(Dynatech，Cambridge，MA)用稀釋於25mM Tris，pH7.5中的VEGFR-3以100ng/孔的量包被2小時。吸除包被液，加入200μl/孔封閉液(0.5％魚皮凝膠(Sigma)稀釋於CMFPBS)，37℃孵育30分鐘。用加有0.05％Tween20的PBS(PBST)洗滌平板3次，加入50μl培養物上清。37℃孵育30分鐘後，照上述方法洗滌，加入50μl以1∶3500稀釋於PBST的辣根過氧化物酶偶聯的山羊抗-小鼠IgG(fc)(Jackson ImmunoResearch，West Grove，Pennsylvania)。按照上述方法孵育平板，用PBST洗滌4次，加入底物100μl，該底物由含1mg/ml鄰苯二胺(Sigma)和0.1μl/ml30％H2O2的100mM檸檬酸組成，pH4.5。5分鐘後加入50μl15％H2SO4終止反應。用平板閱讀儀(Dynatech)讀取A490值。
通過下述方法對選擇的融合孔進行兩次克隆稀釋入96-孔平板，5天後目測計數克隆數目/孔。用Isostrip系統(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)對雜交瘤生產的單克隆抗體進行同工型分析。
除製備單克隆抗體外，還發展了製備″嵌合抗體″的技術，可以將小鼠抗體基因拼接到人抗體基因上，得到具有合適抗原特異性和生物活性的分子(Morrison等，Proc Natl Acad Sci816851-6855，1984；Neuberger等，Nature312604-608，1984；Takeda等，Nature314452-454；1985)。替代地，也可對已述用於製備單鏈抗體的技術(美國專利4,946,778)調整後用於製備VEGFR-3-特異性單鏈抗體。
本領域技術人員可以從已證實能結合VEGFR-3或其它淋巴管內皮細胞抗原的抗體群中，用血管內皮細胞″扣除(sbutract)″那些與VEGFR-3或所述細胞上其它表位交叉反應的抗體。餘下的抗體群便富含優先識別淋巴管內皮細胞表位的抗體。
還可以通過誘導淋巴細胞群體內生成或者通過對重組免疫球蛋白文庫或一系列高特異性結合反應物進行篩選來製備抗體，這些方法描述見Orlandi等，(Proc Natl Acad Sci863833-3837；1989)，和Winter G and MilsteinC(Nature349293-299，1991)。
要指出的是本發明所述抗體，除可用於本發明所述分離方法外，還可用於常規免疫化學方法例如ELISA和Western印跡方法，免疫組織化學方法例如組織染色，以及其它可以利用抗VEGFR-3-相關抗原表位的特異性抗體的方法。
通常，本發明製備的多克隆抗體和單克隆抗體都可用於多種其它實施方案中，某些方面，可以將所述抗體用於治療目的，以期達到對VEGFR-3活性的抑制。抗體可用於阻斷VEGF-C作用和VEGFR-3受體功能從而治療與淋巴管生成相關的過度增生病症。本發明抗體還可用於診斷目的，例如檢測組織樣本(包括疑似疾病狀態位點的樣本)中VEGFR-3蛋白的增加或減少。其它方面使用本發明抗體通過抗體克隆方法獲得編碼其它VEGFR-3蛋白的cDNAs或基因。它們還可用於抑制試驗來分析細胞或動物中VEGFR-3相關肽的作用。本發明製備的抗體還可用於免疫定位研究，以便分析VEGFR-3在不同細胞事件中的分布，例如，測定VEGFR-3多肽在細胞周期不同點的細胞或組織特異性分布。所述抗體特別有用的用途是用於純化天然或重組VEGFR-3，例如用抗體親和柱。根據本說明書的教導，所有這些免疫學技術的操作應為本領域技術人員已知。
除上述「常規」方法製備本發明所用抗體外，還可用噬菌體展示方法篩選本發明所用抗體。現已知2E11D11和抗-podoplanin抗體可特異性識別淋巴管內皮細胞。用這兩種抗體分離的細胞可作為用噬菌體展示2E11D11或抗-podoplanin相關分子的所有可能突變體時出現的其它相關抗體的read-out。替代地，所展示的抗體也可根據其與由2E11D11或抗-podoplanin所識別的給定表位結合的能力進行篩選。這種用於分離新抗體的方法已為本領域熟知，具體描述見例如美國專利5,223,409，在此引入作為參考，其中描述了結合蛋白的直系進化。相關方法描述還可見美國專利5,403,484；美國專利5,571,698；美國專利No.5,837,500；美國專利5,702,892；.美國專利5,780,279；美國專利5,821,047；美國專利No.5,824,520；美國專利5,855,885；美國專利5,858,657；美國專利5,871,907；美國專利5,969,108；美國專利6,057,098；美國專利6,225,447中描述的技術也用於製備本發明所述抗體。
另外，另一種可用於製備本發明所用抗體的技術是推理性設計模型方法(rational design type approach)。推理性設計的目標是製備生物活性多肽或化合物的能夠與其相互作用的結構類似物(激動劑、拮抗劑、抑制劑、肽模擬物(peptidomimetics)、結合伴侶，等)。這種情況下，所述活性多肽是本申請全文討論的2E11D11和抗-podoplanin抗體。通過製備所述類似物，有可能製備出其它比天然2E11D11或抗-podoplanin分子具有更強免疫反應活性的抗體。一方法中，可以生成該抗體或其表位結合片段的三維結構。這可通過x-射線晶體學，電腦模型或者通過二者結合實現。另一方法是「丙氨酸掃描」，包括用丙氨酸隨機取代整個分子中的殘基，和測定最終對功能所產生的影響。
另外還可解析出特異性抗體的晶體結構。原則上，這種方法生產出藥核(pharmacore)，後續的藥物設計可以以此為基礎。也可以通過製備功能性藥物活性抗體的抗獨特型抗體來完全迴避蛋白質晶體學。作為鏡像的鏡像，抗獨特型的結合位點有望作為原始抗原的類似物。然後可以用抗-獨特型從化學-或生物-製備的肽庫中鑑定和分離其它抗體。
D.分離細胞的方法本發明提供了一種從混合細胞培養物中分離淋巴管內皮細胞的方法。從根本上說，這種分離方法使用的是能夠優先識別淋巴管內皮細胞的抗體。上文已經討論了這種製備及這類抗體的實例。本部分描述的是與抗體結合使用而分離細胞的技術。這些僅僅是例舉性技術，本領域技術人員應該知道其它用於分離細胞的方法也可與本申請所述方法結合使用。
不同技術都可以用於分離本發明細胞。可以將抗體吸附到固相載體上進行粗分離。使用的分離技術應能最大限度保持收集級分的存活能力。各種不同功效的技術都可以用於獲得「相對粗」的分離。這種分離為不帶標誌物的總細胞的最多10％，通常不超過5％，優選不超過1％，可根據要保有的細胞群來定。所使用的具體技術取決於分離效率、相關毒性、操作(performance)難易程度及速度，以及精密設備和/或工藝技術的必要性。
分離用的方法可包括但不限於磁性分離(使用抗體-包被的磁珠)，親和層析，連接有單克隆抗體或與單克隆抗體聯用的細胞毒性試劑，包括但不限於補體和細胞毒素，以及用吸附在固相基質例如平板上的抗體進行″淘選″，洗脫(elutriation)或任一其它常規技術。
分離技術的使用包括但不限於那些根據物理特性(密度梯度離心和反流動離心洗脫(counter-flow centrifugal elutriation))，細胞表面特性(凝集素和抗體親和力)以及，重要染色特性(線粒體-結合顏料rho123及DNA-結合顏料Hoechst33342)上的差異為基礎的技術。
提供精確分離的技術包括但不限於螢光激活細胞分選(FACS)FACS，該技術複雜程度不同，例如多個顏色通道、低角度且鈍光散射檢測通道，阻抗通道，等。
FACS是一種細胞分選方法，可根據細胞表面標誌的差異分離懸液中的細胞。在本發明上下文中，FACS可用於從混合細胞群中特異性移取淋巴管內皮細胞。FACS可通過物理學方式從雜合群體中分離出目的細胞或顆粒。用該技術，可在無菌環境下分選細胞，這樣就可使回收的細胞能夠被培養。淋巴管內皮細胞根據本發明抗體所識別抗原的存在與否進行分選。另外，FACS還可通過識別汙染細胞的抗原表達，GFP表達，DNA含量或細胞功能(例如，鈣流動或凋亡)，除去細胞培養物中的汙染細胞。汙染細胞的去除可在分離淋巴管內皮細胞之前，之後或者之前和之後都進行。
FACS以流式細胞計數術為基礎，流式細胞計數術是一種當懸液中的細胞或顆粒一個個順次通過感應點時測量它們特定物理及化學性質的方法。因此，流式細胞計數器可以認為是一種特殊的螢光顯微鏡。現代的流式細胞計數器由光源、集光器(collection optics)、電子設備(electronics)和將信號翻譯為數據的電腦組成。在大多數現代細胞計數器中選擇的光源為發出特定波長的一致光線的雷射。離散的或者放射的螢光通過兩個透鏡(一個裝在光源前面，一個設定為右傾角度)以及通過一系列光學鏡片，光束分隔器及濾光器來收集，特定波段的螢光可以被測量。流式細胞計數技術測量的物理特性包括細胞大小、形狀及內部組成等特性，當然可被螢光化合物檢測的任一細胞組分或功能都可以拿來測試。
通常，流式細胞計數器使用的原理包括帶電小滴的靜電偏轉。從樣本中吸出的細胞從噴嘴逐個噴射出去形成一股鞘液(sheath fluid)流，通常為PBS但是也可以是任一電離液。由於細胞被雷射束中途截取，因而產生了散射光和螢光信號，然後由分選邏輯板(sort logic boards)決定細胞應否被揀選(根據使用者的特定標準)。在本發明情況下，使用者設定的標準是分選的淋巴管內皮細胞是否被被淋巴管內皮細胞特異性抗體結合或識別，例如2E11D11、抗-podoplanin等。
雷射截取和break-off點之間的距離稱之為滴落延遲(drop delay)。如果一種目的細胞，即要揀選的細胞已經被檢測，那麼細胞計數器一直等到細胞從截取點運行到break-off點，然後再讓細胞流帶電。只要。只要含目的細胞的小滴脫離一致的液流(solid fluid stream)那麼它就將帶電，要麼是正電要麼是負電。帶電小滴向下再流動一段距離進入兩個高壓偏轉板，然後被吸向極性相反的板。所以能夠從同一樣本中分揀出兩個分離的群體。
首次分離中，通常用約1×108-9個細胞開始，優選約5×108-9個細胞，淋巴管細胞特異性抗體可用一種螢光素標記，而其它不同細胞的抗體，或抗-gp80抗體，可偶聯至少1種不同的螢光素。儘管每一種細胞譜系可在不同的步驟中分離，但是當決定要選出被2E11D11識別的表位和/或其它淋巴管內皮標誌時還是期望同時將細胞系分離開來。可以從死細胞中選擇出所需細胞，方法如利用與死細胞結合的顏料(包括但不限於，碘化丙錠(PI))。優選地，將細胞收集在適於細胞培養或存儲的培養基中。細胞的選擇可以根據光-散射特性以及其不同細胞表面抗原的表達情況來進行。本領域技術人員已經熟知可用於本發明細胞的FACS分選的具體方案。
在一範例性FACS操作方案中，微脈管內皮細胞在懸液中的標記通過與識別淋巴管內皮細胞的一種或多種抗體在4℃下孵育40分鐘完成。細胞分選之前和之後都要在4℃的適宜培養基中維持。抗體標記完成後，向各個樣品管加入終濃度為10μg/ml的碘化丙錠(用於檢測死細胞)。螢光激活細胞分選是在使用帶60mW功率100μm噴嘴的4W氬雷射器的Becton DickinsonFACSTARPplus(San Jose，Calif.)上進行的。FACS還可通過測定細胞的FSC和SSC散射來測定物理特性。
除FACS之外，MACS也是一種分選細胞的有用技術。它不再使用免疫螢光作為分離細胞的方法，而是將細胞用免疫磁性標記，然後用磁場分離。也可用吸附到磁珠上的抗體從混合群體培養物中分離出淋巴管內皮細胞。呈遞抗體的磁珠被固定到設置在磁場中的柱體上。然後讓微脈管細胞群通過上述柱體，淋巴管內皮細胞就被抗體結合而剩餘細胞被收集在柱體流通池中。
常規的免疫吸附親和層析也可用於分離淋巴管細胞。該技術中，抗體被固定在惰性柱體層析珠子上，而這些珠子裝填到柱體中。當微脈管細胞群經過柱體時，淋巴管內皮細胞與抗體結合而非-淋巴管內皮細胞流經柱體進入柱體流通池。
也可用淘選技術分離本發明的淋巴管內皮細胞。淘選細胞是本領域熟知技術，該技術利用抗體將細胞固定到固相載體如皮氏(petri)培養皿。大體說來，就是將特異於待淘選細胞的抗體，例如特異於淋巴管內皮細胞的2E11D11，包被在貼壁細胞培養平板上。然後將混合細胞群加到該平板上，讓平板漩渦振動以使細胞與固定在平板上的抗體充分接觸。從平板上除去剩餘未被抗體識別的細胞培養物，留下了與抗體粘附且基本不含汙染細胞的淋巴管內皮細胞。收穫這些細胞並將其轉移入新鮮培養基擴大培養，或者也可以向粘附抗體的細胞添加新鮮培養基。就微脈管細胞群而言，應該理解的是剩餘在懸液中並與吸附的淋巴管細胞脫離的細胞是基本不含淋巴管內皮細胞的血管內皮細胞群。
在一範例性淘選方法中，將稀釋於9ml合適緩衝液內的抗體灌注100mm2細菌學用聚苯乙烯皮氏培養皿(Falcon，Lincoln Park，N.J.)上(0.5mg/平皿)。漩渦振動平皿以便均勻包被表面，室溫下孵育40分鐘。使用前用緩衝液洗滌包被後的平皿除去未粘附到皮氏平皿上的任一殘餘抗體。將一定體積，例如含最多3×107個細胞的10毫升微脈管細胞懸液在包被有抗體的平皿中4℃孵育10分鐘。抽吸除去未-吸附細胞，然後用適於細胞的緩衝液或培養基洗滌平板。可以離心沉澱未-吸附細胞，然後再培養。
E.VEGFR-3活性測定試驗通過VEGF-C/D與VEGFR-3受體家族結合介導的許多生物活性(包括但不限於影響血管內皮細胞和血管的生長及遷移；促進淋巴管內皮細胞和淋巴管的生長；增加血管的通透性；影響髓細胞生成)支持了本發明分離細胞的大量體外及體內臨床應用。首次，可以在基本無非-淋巴管內皮細胞汙染影響的淋巴管內皮細胞培養物中特異性監測這類活性。可以監測這些細胞中VEGF-C/D的VEGFR-3結合和活性以及調控這種結合的化合物。因此，本發明細胞可有效鑑定VEGF-C/D介導的生物應答的調控劑及優選實施方案中的相應抑制劑。本發明描述了用於測定VEGFR-3結合和/或活性存在的各種測定方法。本發明分離的細胞中這類活性的出現表明這類細胞是淋巴管內皮細胞。
可根據細胞能否顯示VEGFR-3結合活性來監測淋巴管內皮細胞的出現。範例性結合試驗已有描述見Achen等，Proc Natl Acad Sci USA 95548-53(1998)，整體引入作為參考。這些試驗通常包括將應該表達有VEGFR-3受體的本發明所述細胞與該受體的配體(例如，VEGF-C)混合，測定該受體的結合情況。
所述細胞可以用於下述情況即在將藥物施用給個體之前就希望測定該藥物在抑制VEGFR-3受體方面的治療效果。作為活性的指徵，也可以測定該治療藥物改變細胞上VEGFR-3受體自身磷酸化的能力。將一候選治療藥物加到細胞上，然後裂解該細胞，用抗-VEGF受體抗血清免疫沉澱，用抗-磷酸酪氨酸抗體通過Western印跡試驗分析測定VEGF受體的磷酸化。
這些試驗中的細胞用本領域技術人員熟知的技術培養。例如，將細胞培養在Ham′s F12培養基-10％胎牛血清(FCS)中。在添加有0.2％牛血清白蛋白(BSA)的DMEM培養基或Ham′s F12中過夜使這些細胞飢餓，然後單獨用VEGF-C或聯用治療藥物和VEGF-C孵育5分鐘。
加入VEGF-C後，細胞用含100mM正釩酸鈉的冰冷Tris-緩衝鹽溶液(TBS)洗滌2次，然後在含1mM苯甲基磺醯氟(PMSF)，0.1U/ml抑蛋白酶肽和1mM正釩酸鈉的RIPA緩衝液中裂解。裂解物超聲波處理，然後16,000xg離心20分鐘澄清，然後用3-5μl VEGFR-3或VEGFR-2特異性抗血清冰上孵育3-6小時。用蛋白A-Sepharose結合免疫沉澱物，用含1mMPMSF，1mM正釩酸鈉的RIPA緩衝液洗滌3次，用10mM Tris-HCl(pH7.4)洗滌2次，用7％凝膠SDS-PAGE電泳分離。通過Western印跡將多肽轉移到硝酸纖維素膜然後用PY20磷酸酪氨酸-特異性單克隆抗體(Transduction Laboratories)或受體-特異性抗血清和ECL檢測法(AmershamCorp.)進行分析。
候選藥物影響自身磷酸化(用抗-磷酸酪氨酸抗體檢測)的能力可以評為調節受體的等級。不同濃度治療藥物相對於已知濃度的VEGF-C的水平變化，提供了受體調節能力的指示。已經表明可結合受體但不能刺激受體磷酸化的治療藥物，可以視為抑制劑。抑制活性可用下述方法進一步分析將已知的受體激動劑如重組VEGF-C與單純的培養基或與經濃縮的使用後的培養基混合，測定經濃縮的使用後的培養基能否抑制VEGF-C-介導的受體磷酸化。
淋巴管內皮細胞的出現也可以用與VEGFR-3天然或重組配體的結合試驗來監測。為了測定所選配體的結合親和力，可使用ELISA-型的方法。例如，為了測定與VEGFR-3的結合親和力，將競爭性VEGFR-3-IgG融合蛋白和亞飽和濃度的加myc表位標籤的候選配體系列稀釋後，加入包被有VEGFR-3的微量滴定板，孵育直至建立平衡。然後洗滌滴定板除去未結合蛋白。與VEGFR-3包被滴定板結合的配體用抗-myc抗體檢測，該抗體偶聯有易檢測的標記物例如辣根過氧化物酶。結合親和力(EC50)可以計算為導致半數-最大結合(half-maximal binding)的競爭性VEGFR-IgG融合蛋白濃度。
VEGF-C可以刺激內皮細胞在膠原凝膠上的遷移。可以使用本發明細胞測定膠原凝膠中VEGF-C介導的內皮細胞遷移，從而獲得關於分離的細胞確實是淋巴管內皮細胞的另一指徵。範例性細胞遷移試驗已有描述見國際專利公開號為WO98/33917的專利申請，在此引入作為參考。簡而言之，將本發明中分離的淋巴管內皮細胞種植於組織培養板膠原層的頂部。將VEGF-C置於膠原凝膠內在距吸附的淋巴管內皮細胞位置約4mm處製備的孔中。然後計算從膠原凝膠中吸附原始區域遷移至VEGF-C孔的內皮細胞數目，以評估VEGF-C誘導的細胞遷移。
這些試驗的膠原凝膠可用下述方法製備將I型膠原原液(5mg/ml於1mM HCl中)與等體積2xMEM及2倍體積的含10％新生小牛血清的MEM混合，得到膠原終濃度為1.25mg/ml。組織培養平板(5cm直徑)用約1mm厚的溶液層覆蓋，使該溶液在37℃聚合。將本發明淋巴管內皮細胞種植於該層的頂部。
遷移試驗中，讓細胞吸附在置於第一膠原層頂部的塑膠圓環(1cm直徑)內。30分鐘後，除去圓環，漂洗除去未結合的細胞。加上第二層膠原及培養基層(5％新生小牛血清(NCS))，用0.75％低熔點瓊脂糖(FMCBioProducts，Rockland，ME)凝固。在該細胞斑點兩側距離4mm處製備穿透所有層的孔(3mm直徑)，每天向孔內滴入含VEGF-C多肽的培養基。在例如，6天後，用裝有相差鏡片的OlympusCK2倒置顯微鏡獲得遷移出斑點邊緣的細胞的顯微照片。用螢光染料bisbenzimide(1mg/ml，Hoechst33258，Sigma)對遷移細胞進行核染色，然後計數。
加入培養基的6天後，測定從最初附著區向含有VEGF-C的孔的方向遷移了不同距離的細胞的數目。用顯微鏡目鏡鏡頭格柵和10X放大倍數的螢光顯微鏡，計數5個鄰接的0.5mm×0.5mm正方形區域中遷移離開原始圓環的細胞數目。遷移超出0.5mm範圍的細胞通過以0.5mm的步幅移動格柵、然後以相同方式計數。本發明細胞進行VEGF-C介導的遷移的能力，表明該分離的細胞是表達有VEGFR-3的淋巴管內皮細胞。
此外，VEGF-C的促有絲分裂活性可用內皮細胞增殖試驗測定，例如Breier等，Dev 114521-532(1992)中所述的試驗，全文引入作為參考。可以通過向細胞添加VEGF-C測定細胞的這種效應。3天後，用胰蛋白酶解離細胞，然後用細胞計數器計數以測定所述肽對淋巴管內皮細胞增殖活性的影響。
F.VEGFR-3的刺激物如本說明書所述，可以將分離的淋巴管內皮細胞以能促進其在培養中存活的方式培養在培養基中。具體的技術方案中，可以將細胞培養於有VEGFR-3刺激物和/或VEGFR-2刺激物存在的條件下，所述刺激物包括但不限於VEGF，VEGF-C，VEGF-C156S，VEGF-D和ORFV2-VEGF。這些刺激物及其對VEGF受體的作用將在本章節進一步詳細討論。應該理解的是，這些物質可以製備成任一能夠使得其與本發明細胞結合使用的配製劑。此外，這些刺激物可以單獨或聯合施用給本發明細胞，以抑制、抑壓、減輕或者阻止培養物中淋巴管內皮細胞的凋亡。
上述刺激物屬於生長因子的PDGF/VEGF家族，該家族至少包括下列成員PDGF-A(參見，例如，GenBank等記號為X06374)，PDGF-B(參見，例如，GenBank等記號為M12783)，VEGF(參見，例如，GenBank等記號為Q16889，本申請為清楚起見稱為VEGF-A或具體的同工型)，PIGF(參見，例如，GenBank等記號為X54936胎盤生長因子)，VEGF-B(參見，例如，GenBank等記號為U48801；又稱為VEGF-相關因子(VRF))，VEGF-C(參見，例如，GenBank等記號為X94216；又稱為VEGF相關蛋白(VRP))，VEGF-D(又稱為c-fos-誘導生長因子(FIGF)；參見，例如，GenBank等記號為AJ000185)，VEGF-E(又稱為NZ7VEGF或OVNZ7；參見，例如，GenBank等記號為S67522)，NZ2 VEGF(又稱為OVNZ2；參見，例如，GenBank等記號為S67520)，D1701 VEGF-樣蛋白(參見，例如，GenBank等記號為AF106020；Meyer等，EMBOJ18363-374)，和NZ10VEGF-樣蛋白(描述見國際專利申請PCT/US99/25869)[Stacker and Achen，Growth Factors171-11(1999)；Neufeld等，FASEB J 139-22(1999)；Ferrara，J Mol Med 77527-543(1999)]。
VEGF-C含有一VHD，在氨基水平與VEGF-A具有至少30％的同一性。VEGF-C最初表達為一較大的前體蛋白，前原(prepro)-VEGF-C，在VHD兩側具有延伸的氨基-及羧基-末端肽序列，C-末端肽在巴爾比亞尼(Balbiani)環3蛋白的典型基序中包含串聯重複半胱氨酸殘基。前原-VEGF-C經歷深度(extensive)蛋白水解性成熟，其中包括信號肽、C-末端原-肽、N-末端原-肽的連續性切割。分泌的VEGF-C蛋白由非-共價鍵-連接的同源二聚體組成，其中每一單體都含有VHD。部分蛋白水解處理產生的VEGF-C中間形式表現出與VEGFR-3受體的親和力增加，而成熟蛋白還能結合VEGFR-2受體。[Joikov等，EMBO J，16(13)3898-3911(1997).]另外還證實一種突變體VEGF-C，其中第156位的單半胱氨酸被另一胺基酸取代或缺失，該突變體失去了與VEGFR-2結合的能力但仍能結合併活化VEGFR-3[國際專利公開文本WO98/33917]。小鼠胚胎中，VEGF-C mRNA起初表達於尿囊、喉部區域及後腎。[Joukov et aZ.，J Cell Physiol 173211-215(1997)]。VEGF-C參與淋巴管生成的調節當VEGF-C過表達於轉基因小鼠的皮膚中時，會觀察到增生的淋巴管網絡，這表明VEGF-C能誘導淋巴管發育[Jeltsch等，Science，2761423-1425(1997)]。VEGF-C在成人的連續表達(Continued expression)表明其在維持分化的淋巴管內皮細胞中發揮作用[Ferrara，J Mol Med 77527-543(1999)]。VEGF-C還表現血管生成特性(angiogenic properties)它能刺激牛毛細管內皮細胞(BCE)在膠原中遷移，並能促進人內皮細胞生長[參見，例如，國際專利公開文本WO98/33917，在此引入作為參考]。VEGF-C156S是一種VEGF-C半胱氨酸缺失變體，能夠結合VEGFR-3但顯示與VEGFR-2結合減弱(相對於VEGF-C)。VEGF-C156S及相關的可用於本發明的VEGFR-3特異性配體的描述見美國專利6,130,071，在此專門整體引入作為參考。VEGF-C物質及方法描述見美國專利US6,245530和6,221,839，在此引入作為參考。
VEGF-D在結構和功能上與VEGF-C最密切相關[見國際專利公開文本。WO98/07832和美國專利6,235,713，在此引入作為參考]。與VEGF-C一樣，VEGF-D初始也表達為一前原-肽，經過N-末端和C-末端蛋白水解處理，形成非-共價連接的二聚體。VEGF-D能夠體外刺激內皮細胞的促有絲分裂應答。在胚胎形成過程中，VEGF-D表達為一複雜的時空模式，其表達在成人的心、肺及骨骼肌中持續。命名為VEGF-DΔNΔC的VEGF-D生物活性片段的分離見國際專利公開文本WO98/07832，在此引入作為參考。VEGF-DΔNΔC由VEGF-D中第93-201位殘基與親和標籤肽FLAG連接組成。
VEGF-A最初是根據其對內皮細胞的促有絲分裂活性而從幾種來源中純化，也可以根據其誘導微脈管通透性的能力來純化，因此它也稱為微脈管通透因子(VPF)。隨後證實VEGF-A誘導多種生物過程，包括細胞內鈣轉移，誘導血纖蛋白溶酶原激活物和血纖蛋白溶酶原激活物抑制劑-1的合成，促進單核細胞體外遷移，誘導抗凋亡蛋白(antiapoptotic protein)在人內皮細胞中的表達，誘導內皮細胞穿孔，促進細胞粘附分子在內皮細胞中的表達，以及誘導一氧化氮介導的血管擴張和低血壓[Ferrara，J Mol Med 77527-543(1999)；Neufeld等，FASEB J 139-22(1999)；Zachary，Intl JBiochena Cell Bio301169-1174(1998)]。
VEGF-A是一種分泌型、二硫鍵連接23kD亞單位組成的同源二聚體糖蛋白。已有描述，人VEGF-A的五種同工型長度為121，145，165，189或206個胺基酸(VEGF121-206)，由不同的mRNA剪接變體編碼，所有這些形式都能刺激內皮細胞中有絲分裂的發生。但是，每一同工型在生物活性、受體特異性及對細胞表面-相連及胞外基質-相連的硫酸乙醯肝素蛋白多糖的親和力各不相同，這些蛋白多糖是VEGF-A的低親和力受體。VEGF121不結合肝素或硫酸乙醯肝素；VEGF145和VEGF165(GenBank等記號為M32977)二者都能結合肝素；VEGF189和VEGF206表現出與肝素和乙醯肝素的親和力最強。VEGF121、VEGF145和VEGF165以可溶形式分泌，儘管VEGF165大部分固定於細胞表面及胞外基質蛋白多糖，而VEGF189和VEGF206仍然與胞外基質相連。VEGF189和VEGF206都能通過用肝素或肝素酶處理釋放出來，這表明這些同工型都是通過蛋白多糖結合於胞外基質。與細胞結合的VEGF189也可用蛋白酶如纖溶酶切割，導致釋放出可溶的活性VEGF110。表達VEGF的組織大多數都同時可表達好幾種VEGF同工型，儘管VEGF121和VEGF165是主要形式，而VEGF206很少能檢測到[Ferrara，J Mol Med 77527-543(1999)]。VEGF145有所不同，它主要表達在來自生殖器官的細胞中[Neufeld等，FASEB J 139-22(1999)]。
VEGF-A的表達模式表明它參與正常脈管系統的發育和維持，並且參與了與腫瘤生長及其它病理狀況如風溼性關節炎相關的血管生成。VEGF-A表達在與發育中的脈管系統相關的胚胎組織中，並且被多種腫瘤細胞系分泌。對通過靶基因斷裂而敲除了VEGF-A的小鼠的分析表明VEGF-A對於存活至關重要，心血管系統的發育對VEGF-A濃度梯度高度敏感。缺乏單拷貝VEGF-A的小鼠在妊娠第11至12天死亡。這些胚胎顯示出受損的生長及數種發育異常，包括心血管發育缺陷。VEGF-A還是出生後生長、器官發育、調節生長板形態發生及軟骨內骨形成所必需的。對VEGF-A的需求隨年齡減低，特別是出生後第4周以後。成熟動物體內，對VEGF-A的需要主要在於傷口癒合及黃體發育等過程中激活血管生成。[Neufeld等，FASEB J 139-22(1999)；Ferrara，J Mol Med 77527-543(1999)]。VEGF-A的表達主要受組織缺氧及多種激素和細胞因子的影響，包括表皮生長因子(EGF)，TGF-β及各種白細胞介素。調控發生在轉錄及轉錄後，如增加mRNA穩定度[Ferrara，JMolMed77527-543(1999)]。
VEGF亞家族中的其它4個成員已經在感染人、綿羊及山羊的痘病毒中檢測出。Orf病毒-編碼的VEGF-E和NZ2VEGF是強效有絲分裂原和通透性提升因子。二者與哺乳動物VEGF-A間表現出約25％的胺基酸同一性，都表達為二硫鍵連接的同源二聚體。被這些病毒感染的特徵為膿胞性皮炎，其中涉及由這些病毒VEGF蛋白誘導的內皮細胞增殖和血管通透。[Ferrara，JMol Med 77527-543(1999)；Stacker and Achen，Growth Factors 171-11(1999)]。另外，還從另兩株orf病毒D1701[GenBank登記號為AF106020；描述見Meyer等，EMBO J 18363-374(1999)]和NZ10[描述見國際專利申請PCT/US99/25869，在此引入作為參考]鑑定出了VEGF-樣蛋白。已證實這些病毒性VEGF-樣蛋白可結合宿主內皮細胞上的VEGFR-2，這種結合對於感染的發展及病毒誘導的血管生成起著重要作用[Meyer等，EMBO J 18363374(1999)；國際專利申請PCT/US99/25869]。
G.治療VEGF-C相關病症的方法在另一技術方案中，本發明還涉及以配體-介導的VEGFR-3活性為特徵的病變的診斷和治療。可因該幹預而受益的病症很多，包括但不限於癌症、慢性炎症性疾病、類風溼性關節炎、牛皮癬，糖尿病性視網膜病，等。具體實施方案中，本發明所述治療方法用於治療淋巴管病症。本發明的細胞可分離自疑似患有通過VEGFC結合VEGFR-3介導的疾病的患者。
″淋巴管病症″意指能影響淋巴管系統的任一臨床症狀，包括但不限於淋巴水腫、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管肌瘤病、淋巴管擴張及水囊狀淋巴管瘤。優選的實施方案是篩選出淋巴水腫的患病危險增加了的受試人，即，除已知由非-遺傳因素(例如，寄生蟲、外科手術)引發的淋巴水腫外，被臨床醫生診斷為淋巴水腫且特徵為與淋巴液聚積相關的腫脹的任一病症。例如，淋巴水腫病症包括Milroy-Nonne(OMIM 153100)症候群-早發作(early onset)淋巴水腫[Milroy，N.Y.Med.J，56505-508(1892)；Dale，J.Med.Genet.，22274-278(1985)]和原發性(praecox)淋巴水腫(Meige綜合症，OMIM153200)-晚發作(late onset)淋巴水腫[Lewis等，J.Ped.，104641-648(1984)；Holmes等，Pediatrics 61575-579(1978)；and Wheeler等，Plastic Reconstructive Surg.，67362-364(1981)]，它們通常被描述為單獨實體，都以顯性遺傳為特徵。但是，在關於區分這類病症的文獻中存有令人混淆的地方。在Milroy′s症候群中，從出生時便可見水腫的存在，通常在下肢更為嚴重。原發性淋巴水腫的存在形式類似，但腫脹通常於青春期發作。現已報導一些病例於青春期後的時期發病。在本申請所述的具體試驗中，與5q34-q35連鎖的淋巴水腫家族中，大多數受侵襲的個體有早期發作，而這些家族的個體則出現於青春期或之後出現。
本發明治療特別關注的是具有可鑑定的遺傳誘因的遺傳性淋巴水腫。例如，國際專利公開文本WO005/58511描述了涉及VEGFR-3突變的淋巴水腫的篩選和治療。從所述患者分離淋巴管內皮細胞的能力使得讓來自體內的靶細胞與治療藥物結合，然後回輸該細胞，而改進基於蛋白或基於基因的治療。
此外，可根據本發明治療的另一類型病症僅限於涉及VEGFC和/或VEGFR-3。因此，例如，許多腫瘤都可用本發明的細胞測定，包括腦癌(成膠質細胞瘤、星形細胞瘤、少突膠質細胞瘤，室管膜細胞瘤)、肺癌、肝癌、脾癌、腎癌、淋巴結癌、胰腺癌、小腸癌、血細胞癌、結腸癌、胃癌、乳腺癌、子宮內膜癌、前列腺癌、睪丸癌、卵巢癌、皮膚癌、頭頸部癌、食道癌、骨髓癌、血癌及其它組織癌。從患有這些疾病的患者分離的細胞可用於向個體提供治療。
多處上下文中，在提供治療時，無需將腫瘤細胞殺死或誘導其經歷正常細胞死亡或「凋亡」。為了實現有意義的治療，所要做的全部就是一定程度減緩腫瘤的生長，或將其固定於特定區域並抑制其擴散至其它位點。腫瘤生長可被完全阻止，或者實現一定的腫瘤衰退。臨床術語如「消退」或「腫瘤的縮小」也都採用其通常用意。在本發明上下文中，所述治療效果可通過抑制血管生成和/或抑制淋巴管生成來實現。
I.基因治療本發明分離的細胞可用以核酸形式提供的基於基因的治療來處理，然後將其回輸入患者體內以便實現回體基因治療。在回體實施方案中，從患者體內取出細胞，在體外至少保持一段時間。在這段時間內，遞送治療物，然後將細胞回輸入患者；順利的話，樣本中的任一腫瘤細胞都被殺死。具體而言，讓所述細胞與能夠向該腫瘤的淋巴管細胞或血管細胞提供治療基因的表達構建體接觸，接觸的方式允許抑制該脈管系統中的VEGFR-3。
就這些治療方案而言，範例性表達構建體包含病毒或源自病毒基因組的工程構建體。該表達構建體通常包含編碼要表達的治療基因的核酸以及另加的調控區域，這些調控區域影響該基因在其所施用的細胞內的表達。所述調控區域包括例如啟動子、增強子、聚腺苷酸化信號等。
目前已經廣泛認識到可以使用多種多樣的病毒載體將DNA導入細胞。在這類實施方案中，表達構建體包括的含目的基因的病毒載體可以是下列病毒載體腺病毒(參見，例如，美國專利5,824,544；美國專利No.5,707,618；美國專利5,693,509；美國專利5,670,488；美國專利5,585,362；每一文獻在此引入作為參考)，逆轉錄病毒(參見，例如，美國專利5,888,502；美國專利5,830,725；美國專利5,770,414；美國專利5,686,278；美國專利No.4,861,719每一文獻在此引入作為參考)，腺伴隨病毒(參見，例如，美國專利5,474,935；美國專利5,139,941；美國專利5,622,856；美國專利5,658,776；美國專利5,773,289；美國專利5,789,390；美國專利5,834,441；美國專利5,863,541；美國專利5,851,521；美國專利No.5,252,479每一文獻在此引入作為參考)，腺病毒-腺伴隨病毒雜合體(參見，例如，美國專利No.5,856,152在此引入作為參考)或者痘苗病毒或皰疹病毒(參見，例如，美國專利5,879,934；美國專利No.5,849,571；美國專利5,830,727；美國專利5,661,033；美國專利5,328,688每一文獻在此引入作為參考)載體。
其它實施方案涉及非-病毒性遞送。這些包括磷酸鈣沉澱(Graham andVan Der Be，Virology，52456-467，1973；Chen and Okayama，Mol.Cell Biol.，72745-2752，1987；Rippe等，Mol.Cell Biol.，10689-695，1990)，DEAE-葡聚糖(Gopal，Mol.Cell Biol.，51188-1190，1985)，電穿孔(Tur-Kaspa等，Mol.CellBiol.，6716-718，1986；Potter等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，817161-7165，1984)，直接微注射(Harland and Weintraub，J.Cell Biol.，1011094-1099，1985.)，含DNA的脂質體(Nicolau and Sene，Biochim.Biophys.Acta，721185-190，1982；Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，763348-3352，1979；Felgner，Sci Am.276(6)102-6，1997；Felgner，Hum Gene Ther.7(15)1791-3，1996)，細胞超聲波處理(Fechheimer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，848463-8467，1987)，用高速微粒進行基因轟擊(Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，879568-9572，1990)，以及受體-介導的轉染(Wu and Wu，J.Biol.Chem.，2624429-4432，1987；Wu and Wu，Biochemistry，27887-892，1988；Wu and Wu，Adv.Drug Delivery Rev.，12159-167，1993)。
在本發明的一具體實施方案中，可將所述表達構建體(或者實際上是上述的肽)包裹入脂質體。脂質體是一種囊泡狀結構，特徵由磷脂雙層膜以及內部含水介質。多層脂質體具有多層被含水介質分隔的脂膜。當將磷脂懸於過量含水溶液中時它們就會自動生成。脂類成分在形成緊密結構之前進行自身-重新排列，將水和溶解後的溶質包裹於脂質雙層之間(Ghosh andBachhawat，InLiver diseases，targeted diagnosis and therapy using specificreceptors and ligands，Wu G，Wu C ed.，New YorkMarcel Dekker，pp.87-104，1991)。向陽離子脂質體加入DNA會導致拓樸學轉換，由脂質體變為光學雙折射液相-晶體相凝結球(optically birefringent liquid-crystalline condensedglobules)(Radler等，Science，275(5301)810-4，1997)。這些DNA-脂質複合體是可用於基因治療和遞送的非-病毒載體。
脂質體-介導的核酸遞送及外源DNA體外表達已經很成功。本發明另外還實施了各種涉及「脂轉染」技術的商品化方法。本發明特定實施方案中，可讓脂質體與凝血(hemagglutinating)病毒(HVJ)複合。已證實這樣能促進與細胞膜的融合併有助於被脂質體-包裹的DNA進入細胞(Kaneda等，Science，243375-378，1989)。其它實施方案中，可以將脂質體與核非組蛋白染色體蛋白(HMG-1)複合或聯合使用(Kato等，J.Biol.Chem.，2663361-3364，1991)。另外的實施方案中，可將脂質體與HVJ和HMG-1這二者複合或聯合使用。由於這類表達構建體已經成功用於核酸的體內及體外的轉移和表達，所以它們可以用於本發明。
能夠用來將編碼治療基因的核酸遞送入細胞的其它載體包括受體-介導的遞送載體。這些載體優勢在於能利用幾乎所有真核細胞的受體-介導性內吞作用選擇性攝入大分子。由於各種受體的細胞類型-特異性分布，所以遞送可以是高度特異的(Wu and Wu，1993，出處同上)。
受體-介導的基因靶向載體通常由兩個組分組成細胞受體-特異性配體和DNA-結合物。已有幾種配體被用於受體-介導的基因轉移。研究最為詳細的配體是脫唾液酸血清類粘蛋白(ASOR)(Wu and Wu，1987，supra)和運鐵蛋白(Wagner等，Proc.Nat′l.Acad Sci.USA，87(9)3410-3414，1990)。近來，一種合成的新糖蛋白已經被用作基因遞送載體，它與ASOR識別同樣的受體(Ferkol等，FASEB J.，71081-1091，1993；Perales等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA914086-4090，1994)，表皮生長因子(EGF)也已被用於向鱗狀癌細胞(squamous carcinoma cells)遞送基因(Myers，EPO 0273085)。
其它實施方案中，所述遞送載體可以包含配體和脂質體。例如，Nicolau等(Methods Enzymol.，149157-176，1987)使用乳糖基(lactosyl)-神經醯胺，一種半乳糖-末端脫唾液酸神經節苷脂(asialganglioside)，引入脂質體並且觀察到肝細胞的胰島素基因攝入量增加。因此，通過任意數量的受體-配體系統，在有或沒有脂質體存在的情況下，將編碼治療基因的核酸特異性遞送到具體類型的細胞中，這也都是切實可行的。
在本發明的另一實施方案中，所述表達構建體可僅由裸露的重組DNA或質粒組成。這種構建體的轉移可以通過上述任一用物理或化學手段穿透細胞膜的方法實施。這尤其可用於體外轉移，但是，也可體內使用。Dubensky等(Proc.Nat.Acad.Sci.USA，817529-7533，1984)成功地將多瘤病毒DNA以CaPO4沉澱的形式注射入成年和新生小鼠的肝和脾內，證實活性病毒複製和急性感染。Benvenisty和Neshif(Proc.Nat.Acad.Sci.USA，839551-9555，1986)也證明直接腹腔注射CaPO4沉澱的質粒也能導致轉染基因的表達。
本發明另一用於將裸露DNA表達構建體轉移入細胞的實施方案涉及微粒轟擊。這種方法取決於將DNA包被的微粒加速到高速以使它們能穿透細胞膜進入細胞但不殺死細胞的能力(Klein等，Nature，32770-73，1987)。現已開發出幾種用於加速微粒的裝置。一種這樣的裝置依靠高電壓產生電流，後者提供移動力(Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，879568-9572，1990)。使用的微粒由生物惰性物質如鎢或金珠組成。
本領域技術人員很容易會認識到如何在體內和回體情況下實施基因遞送。對於病毒載體而言，通常製備病毒載體原液。根據病毒種類以及可達到的滴度不同，可將1×104，1×105，1×106，1×107，1×108，1×109，1×1010，1×1011或1×1012個感染顆粒遞送給患者。通過比較相對攝入效率，可將類似數據外推到脂質體或其它非-病毒製劑。作為可藥用組合物的配製劑將在下文討論。
不同腫瘤類型採用不同途徑。下列有關途徑的章節包括了大量可能的途徑。對於任一種具體腫瘤而言，都可實施系統遞送。這對於攻擊顯微鏡可見的(microscopic)或轉移性的癌症特別重要。在鑑定出散在腫瘤實體時，可以採用多種直接的、局部的和區域性的方法。例如，可用表達載體或蛋白直接注射腫瘤。腫瘤的基底(tumor bed)可在切除術之前、當中或以後進行處理。切除術後，通常通過手術後該位置留置的導液管遞送載體。
II.免疫治療免疫治療通常依賴於免疫效應細胞及分子來靶向並摧毀腫瘤細胞。所述免疫效應物可以是，例如，腫瘤細胞表面上一些標誌物的特異性抗體。該抗體可以單獨作為治療效應物或者它也可動員其它細胞去實際實施細胞殺滅。所述抗體還可偶聯藥物或毒素(化療藥物，放射性核素，篦麻毒蛋白A鏈，霍亂毒素，百日咳毒素，等)並僅僅作為靶向物質。替代地，所述效應物可以是帶有表面分子的淋巴細胞，該分子與腫瘤靶細胞直接或間接作用。各種效應細胞包括細胞毒T細胞和NK細胞。
在本發明中，可以讓單個抗體、多個抗體、抗體偶聯物或免疫效應細胞靶向那些選出接受治療的腫瘤，而與該免疫治療結合的本發明所述肽靶向腫瘤的脈管系統，從而達到聯合治療效果。
聯合治療的常用方法在下文中討論。在本發明中，由於已經確證2E11D11和抗-podoplanin抗體能特異性識別淋巴管內皮細胞，所以有可能用細胞毒物質靶向這些細胞。因此，與各種癌症相關的淋巴管生成都可用本申請所述方法抑制。
一些實施方案中，所述抗體可用於將治療蛋白靶向淋巴管內皮細胞。這些治療作為抗-淋巴管生成和/或抗-血管生成治療時特別有效，但是應當理解的是本發明不僅限於這些有益效果。組合物的施用可以是系統的或局部的，並且可包括在單一位點注射治療有效量的蛋白。本發明涉及本領域技術人員已知可用於給藥本發明治療組合物的任一途徑，包括例如，靜脈內，肌肉內，皮下或者通過導管長期施用。替代地，也可以將治療組合物送到患者的多個位點。多位點給藥可以同時進行也可以在數小時內進行。特定情況下，提供連續流動的治療組合物較有利。其它治療可周期性施用，例如，每天、每周或每月。此外，也可將化療藥物靶向淋巴管內皮細胞。可用於本發明治療應用的這類物質將在下文詳細討論。
III.免疫治療與常規化療或放療聯合治療腫瘤細胞對DNA破壞物質的抗性是臨床腫瘤學的一大難題。目前腫瘤研究的一個目標就是發現提高化療和放療療效的方法。一種方法是將常規治療與基因治療聯合進行。例如，單純皰疹-胸苷激酶(HS-tk)基因，當通過逆轉錄病毒載體系統遞送到腦部腫瘤時，能成功地誘導出對抗病毒物質甘昔洛韋(ganciclovir)的易感性(Culver等，1992)。本發明的一個實施方案是，可將本發明的肽與化療或放療幹預、免疫治療或與其它抗血管生成/抗-淋巴管生成治療聯合施用。
為了殺死細胞，抑制細胞生長，抑制轉移、抑制血管生成或者逆轉或減緩腫瘤細胞的惡變表型，通過使用本發明的方法和組合物，通常可以使「靶」細胞、腫瘤或其脈管系統與至少兩種不同治療組合物接觸。這些組合物以聯合有效量提供，通過殺死和/或抑制癌細胞和/或供應及服務於這些癌細胞的血管及淋巴管內皮的增殖來殺死或抑制癌症的增生。該過程可能涉及讓所述細胞與肽或表達構建體及物質或因子同時接觸。這一點可以通過讓細胞與包括這兩種物質的單一組合物或藥物配製劑接觸或者通過讓細胞與兩種不同組合物或配製劑同時接觸來實現。
可替代地，兩種不同治療可間隔數分鐘至數周進行。在兩種治療分開進行的實施方案中，通常應當保證這段明顯的時間段不能超過每次遞送之間的時間，這樣才能使得第一和第二次治療可以發揮有效的聯合作用。在這類情形中，可以考慮將兩者的施用間隔約12-24小時，更優選，約6-12小時，最優選延遲時間僅約12小時。但一些情況下，期望將治療時間顯著延長，使每次施用治療的間隔時間從數天(2，3，4，5，6或7)到數周(1，2，3，4，5，6，7或8)。本發明特別涉及用一種或兩種治療方案反覆進行治療。在具體實施方案中，通過遞送抗-癌治療來直接攻擊癌細胞，所用方式導致殺死、抑制癌細胞或使其壞死，此外也可施用一種以抗血管生成和/或抗-淋巴管生成作用為基礎的治療組合物。所述抗-淋巴管生成組合物可在另一抗-癌物質之後、之前或者同時施用。
適於聯合治療的物質或因素為當施用給細胞時能導致DNA破壞的任一化學化合物或治療方法。這類物質及因素包括誘導DNA損傷的輻射和波，如γ-射線，X-射線，UV-照射，微波，電子發射(electronic emissions)，等。多種化學化合物(也稱為「化療物」)發揮作用導致DNA損傷，所有這些都可用於本申請所述的聯合治療方法中。可以使用的化療物包括，例如阿黴素，5-氟尿嘧啶(5FU)，依託泊苷(etoposide)(VP-16)，喜樹鹼(camptothecin)，放射菌素-D，絲裂黴素C，順鉑(CDDP)以及過氧化氫。本發明還包括聯用一種或多種DNA破壞物質，無論是以輻射為基礎的還是真正的化合物，例如X-射線與順鉑聯用或者順鉑與依託泊苷聯用。
在根據本發明治療癌症時，要讓腫瘤細胞和/或腫瘤脈管的內皮與除了抗淋巴管生成治療物以外的物質接觸。這一點可以通過用，例如X-射線，UV-光，γ-射線或甚至微波來輻射腫瘤局部而實現。可替代地，可讓腫瘤細胞與所述試劑接觸，其通過向受試者施用一種治療有效量的藥物組合物來實現，該組合物含有一種化合物，例如阿黴素，5-氟尿嘧啶，依託泊苷，喜樹鹼，放射菌素-D，絲裂黴素C，或順鉑。激酶抑制劑也可用來與本發明所述肽聯合治療。可以通過讓所述物質與VEGF-C/D抑制劑肽聯合來製備該物質，並作為聯合治療組合物或試劑盒，例如2001年1月17日提交的美國專利申請No.60/262,476中所述的抑制劑肽，在此引入作為參考。
能夠直接交聯核酸，特別是交聯DNA的試劑也會促進DNA損傷，從而導致與抗淋巴管生成物質的協同抗惡變聯合作用。順鉑等試劑以及其它DNA烷基化試劑也可使用。順鉑已經廣泛用於治療癌症，臨床使用的有效劑量，每3周有5天施用20mg/m2，總共3個療程。順鉑口服不能吸收，因此必須通過靜脈注射、皮下注射、腫瘤內注射或腹膜內注射遞送。
破壞DNA的試劑還包括幹擾DNA複製、有絲分裂及染色體分離的化合物。所述化療化合物包括阿黴素，依託泊苷，戊脈安(verapamil)，鬼臼毒素(podophyllotoxin)等。這些化合物廣泛用於腫瘤治療的臨床方案中，它們通過靜脈快速濃注來施用，靜脈注射劑量範圍從阿黴素的25-75mg/m2、間隔21天到依託泊苷的35-50mg/m2，或者以靜脈注射雙倍的量口服。
破壞核酸前體及亞單元合成及忠實度的試劑也可導致DNA損傷。因此已經開發了多種核酸前體。特別有用的是那些已經經過大量測試且易獲得的試劑。因此，優先被惡變組織使用的5-氟尿嘧啶(5-FU)等，使得該試劑對於靶向腫瘤細胞特別有效。5-FU儘管毒性很強，但是仍然用於很多種載體中，包括局部應用，但是靜脈內通常使用的劑量為3～15mg/kg/天。
例如，下列是一系列化療藥物及已證實可通過施用這類藥物進行控制的癌症。這些化療藥物與本發明肽聯用可有效緩解各種惡變病症。這些化合物的實例包括阿黴素(又稱為adriamycin，doxorubicin)，VP-16(又稱為依託泊苷)，等，道諾紅菌素(daunorubicin)(插入DNA，封閉DNA-介導的RNA聚合酶並抑制DNA合成)；絲裂黴素(又稱為突變黴素和/或絲裂黴素-C)是一種分離自頭狀鏈黴菌(Streptomyces caespitosus)培養液的抗生素，已證實具有抗腫瘤活性；放射菌素D也是一種可以與本發明肽聯用的有用藥物，因為，不能響應系統治療的腫瘤有時會對局部灌注放射菌素D(dactinomycin)產生應答，而這也被認為是一種強效放療方法。它也可與主要外科手術、放療及其它藥物聯合，尤其是長春新鹼和環磷醯胺，並且已發現可有效地抗尤因(Ewing’s)腫瘤，卡波西(Kaposi)肉瘤及軟組織肉瘤，絨(毛)膜癌，轉移性睪丸癌，何杰金氏(Hodgkin)病以及非-何杰金氏淋巴瘤。
博來黴素是一種分離自輪枝鏈黴菌(Striptomyces verticallus)的細胞毒性糖肽抗生素的混合物，單獨使用能有效控制下列腫瘤或與其它已批准的化療藥物按照已經證實的方式聯合用於鱗狀細胞癌，如頭和頸部(包括嘴、舌、扁桃腺，鼻咽，口咽，竇，上顎，嘴唇，口腔黏膜，齒齦，會厭，喉)，皮膚，陰莖，子宮頸，以及陰戶。另外還用於治療淋巴瘤和睪丸癌。
順鉑已經廣泛用於治療癌症如轉移性睪丸癌或卵巢癌，晚期膀胱癌，頭或頸部癌，宮頸癌，肺癌或其它癌症，並可與本發明肽有效聯用。VP16(依託泊苷)也主要與博來黴素和順鉑聯合用於治療睪丸腫瘤，與順鉑聯合用於肺小細胞癌。它還可有效對抗非-何杰金淋巴瘤、急性非淋巴細胞性白血病、乳腺癌以及與獲得性免疫缺陷症候群(AIDS)相關的卡波西肉瘤。能殺死一些類型癌細胞的腫瘤壞死因子[TNF；惡液質素]能夠激活細胞因子的生成，活化巨噬細胞和內皮細胞，促進膠原和膠原酶的生成，是一種炎症介質，也是敗血症性休克的介質，並能促進分解代謝，發熱和睡眠。TNF以有效量單獨使用時毒性很強，因此最佳方案是以較低劑量與其它藥物聯用。它的免疫抑制作用可通過γ-幹擾素增強，因此聯合用藥有潛在危險。TNF和幹擾素-α的雜合體也發現具有抗-癌活性。
紫杉醇(taxol)是一種抗有絲分裂試劑，最初分離自灰樹短葉紫杉(Taxusbrevifolia)的樹皮，它與它的衍生物紫杉酚(paclitaxol)已證實可用於抗乳腺癌，也可用於本發明的聯合治療。已有報導患有多種其它腫瘤的患者對長春新鹼產生有益應答，具體為Wilm瘤，成神經細胞瘤，腦瘤，橫紋肌肉瘤，以及乳腺、膀胱及男女生殖系統癌症。長春花鹼也證實與長春新鹼對於同種癌症具有有益療效。長春花鹼最經常的臨床用途是與博來黴素及順鉑聯合用於轉移性睪丸腫瘤的治癒性治療。它還可有效治療卡波西肉瘤，成神經細胞瘤，和Letterer-Siwe病(組織細胞增多症X)，以及女性乳腺癌及絨(毛)膜癌。
美法侖(Melphalan)又稱為左旋溶肉瘤素(alderan)，L-苯丙氨酸氮芥，苯丙氨酸氮芥，L-PAM，或L-溶肉瘤素，是氮芥的苯丙氨酸衍生物。美法侖是一種雙功能烷化劑，能有效對抗選擇性人惡變病。美法侖是稱為medphalan的D-同分異構體的活性L-同分異構體，medphalan抗某些動物腫瘤的活性較弱，對染色體產生作用所需劑量大於L-同分異構體所需劑量。美法侖有適於口服的形式，已用於治療多發性骨髓瘤。現有證據表明大約有三分之一到一半的多發性骨髓瘤患者對口服該藥物表現出有益應答。美法侖已被用於治療上皮性卵巢癌。
環磷醯胺在胃腸道中是穩定的，具有良好的耐受性，可通過口服或胃腸道外途徑發揮作用，而且不會引發局部起泡、壞死、靜脈炎或甚至疼痛。苯丁酸氮芥(chlorambucil)，是一種氮芥類型的雙功能烷化劑，已經發現它能有效對抗選擇性人惡變病。苯丁酸氮芥可用於治療慢性淋巴(淋巴細胞)白血病、惡性淋巴瘤包括淋巴肉瘤，巨大濾泡性淋巴瘤和何杰金氏病。它雖無法治癒這些病症中的任一個但是可以產生臨床有效緩解。
導致DNA破壞並已廣泛使用的其它因素包括通常已知的γ-射線，X-射線，和/或放射性同位素直接遞送於腫瘤細胞。另外還實施了其它形式的DNA破壞因素如微波及UV-照射。最可能的是所有這些因素對DNA前體、DNA的複製及修復以及染色體的組裝和維持發揮大範圍的破壞DNA作用。X-射線的劑量範圍從長期使用(3-4周)時的日劑量50-200倫琴到單劑的2000-6000倫琴。放射性同位素的劑量範圍變化相差很大，取決於同位素的半衰期、輻射的強度和類型以及惡變細胞的攝入。
本領域技術人員可參考″Remington′s Pharmaceutical Sciences″第15版，第33章，具體見第624-652頁。劑量上的一些變動根據要治療的受試者身體狀況進行。負責施用的人員，如論如何，都應當確定合適受試者個體的劑量。另外，施用於人時，製劑應當滿足FDA局對生物標準品要求的無菌性、發熱性、常規安全及純度標準。
本發明人提出將治療局部遞送給VEGFR-3-相關癌症的患者對於通過遞送治療有效基因來對抗臨床疾病是一種非常有效的方法。類似地，可將化療或放療物導向受試機體的具體受影響區域。替代地，系統遞送表達構建體和/或藥物在某些情況下也是合適的，例如，當發生了廣泛轉移的情況。
除上述討論的抗癌治療物外，可將本發明所述肽與其它抗血管生成抑制劑結合。本發明的肽期望同時具有抗-淋巴管生成和抗-血管生成的特性。許多抗血管生成藥物也具有抗淋巴管生成特性。http//cancertrials.nci.nih.gov/news/angio是國立衛生研究院所開辦的站點，該站點提供了目前進行的抗-血管生成藥物試驗的即時信息。這些藥物包括，例如，Marimastat(BritishBiotech，Annapolis MD；針對非小細胞肺癌，小細胞肺癌及乳腺癌)；AG3340(Agouron，LaJolla，CA；針對多形性成膠質細胞瘤)；COL-3(Collagenex，Newtown PA；針對腦瘤)；Neovastat(Aeterna，Quebec，Canada；針對腎癌及非小細胞肺癌)BMS-275291(Bristol-Myers Squibb，Wallingford CT；針對轉移性非-小細胞肺癌)；Thalidomide(Celgen；針對黑色素瘤，頭及頸部癌症，卵巢、卵巢，轉移性前列腺，及卡波西肉瘤；復發性或轉移性結腸直腸癌(加助劑)；婦科肉瘤，肝癌；多發性骨髓瘤；CLL，復發性或進行性腦癌，多發性骨髓瘤，非-小細胞肺癌，非轉移性前列腺癌，頑固性多發性骨髓瘤，及腎癌)；Squalamine(Magainin Pharmaceuticals Plymouth Meeting，PA；非小細胞癌及卵巢癌)；Endostatin(EntreMEd，Rockville，MD；針對實體瘤)；SU5416(Sugen，San Francisco，CA；復發性頭頸部腫瘤，晚期實體瘤，IIIB或IV期乳腺癌；復發性或進行性腦瘤(兒科)；卵巢，AML；神經膠質瘤，晚期惡性腫瘤，晚期結腸直腸癌，von-Hippel Lindau病，晚期軟組織癌；前列腺癌，結腸直腸癌，轉移性黑色素瘤，多發性骨髓瘤，惡性間皮瘤轉移性腎癌，晚期或復發性頭頸部癌，轉移性結腸直腸癌)；SU6668(Sugen San Francisco，CA；晚期腫瘤)；幹擾素-α；抗-VEGF抗體(National Cancer Institute，Bethesda MD；GenentechSan Franscisco，CA；頑固性實體瘤；轉移性腎細胞癌，未經治療的晚期結腸直腸癌)；EMD121974(Merck KCgaA，Darmstadt，Germany；與HIV相關的卡波西肉瘤，進行性或復發性退行性神經膠質瘤)；白細胞介素12(GeneticsInstitute，Cambridge，MA；卡波西肉瘤)以及IM862(Cytran，Kirkland，WA；卵巢癌，未經治療的轉移性結腸及直腸來源的癌以及卡波西肉瘤)。這些藥物後的附加信息註明了這些試驗中使用的藥物所針對的癌症。這些病症中的任一種都可用本發明肽單獨或與所列藥物聯合治療。
任一種所述治療對淋巴管內皮細胞的作用現在終於可以用本發明分離的淋巴管內皮細胞進行測試。獲得分離這些細胞的方法，使得可以開發出更加有效的治療方案來控制淋巴管內皮細胞病症。
F.用於鑑定其它治療藥物的試驗模式本發明還將這些淋巴管內皮細胞用於篩選可調節(增強或減弱)這些細胞的特性的化合物，所述特性例如這些細胞的VEGFR-3受體活性，細胞生長，淋巴管生成潛能等。這些試驗可以使用多種不同模式，取決於所要篩選的「活性」的種類。所考慮的功能性″讀出(read-outs)″包括VEGFR-3與底物的結合；配體與受體的結合；遷移試驗，或常用監測內皮細胞活性的任一其它功能性試驗。這類內皮細胞功能性試驗已為本領域技術人員熟知，一些範例性試驗在本文的其它地方已有描述。
a.試驗模式本發明提供了，在有和無候選物質存在的條件下檢測VEGFR-3活性，並比較所述結果，從而篩選該活性的抑制劑的方法。這種篩選技術證實可用於對抑制、減弱或阻止VEGFR-3活性的化合物進行常規鑑定。這類化合物用於治療各種病症，例如，淋巴瘤，淋巴水腫，以新血管形成為特徵的實體癌以及其它病症例如PCT/US99/06133中討論的病症，在此專門引入作為涉及VEGFR-3受體的病症的實例，以及具體地，包括但不限於遺傳性淋巴水腫、淋巴水腫、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管肌瘤病、淋巴管擴張，以及水囊狀淋巴管瘤。
這些實施方案中，本發明涉及一種用於測定候選物質抑制本發明淋巴管內皮細胞的VEGFR-3活性的能力的方法。
該方法通常包括下列步驟(i)提供本發明所述的分離的淋巴管內皮細胞培養物；(ii)讓所述培養物與候選物質接觸；以及(iii)將步驟(ii)中細胞培養物的活性或特性與無候選物質時觀察到的細胞培養物的活性或特性進行比較，
其中細胞培養物活性或特性上的改變表明所述候選物質為所述細胞的調節物。
上述試驗中為了鑑定能調節本發明細胞活性或者改變該細胞特性的候選物質，應當測量或測定不加候選物質時的活性或特性。然後向細胞培養物中加入候選物質，測定候選物質存在時的活性或特性。一種候選物質能使活性相對於其不存在時的觀察值發生變化，表明該候選物質具有調節能力。
儘管上述方法一般性描述了本發明培養物中的細胞活性或特性，但是應該理解的是候選物質也可以是能改變VEGFR-3的生成的物質，從而增加或減少相對於VEGFR-3每單位活性的VEGFR-3量。類似地，候選物質可以是一種能增加或減少細胞數目和/或大小的物質。另外，儘管上述討論涉及使用分離的淋巴管內皮細胞培養物，應當理解的是，也可設計類似試驗來鑑定對血管內皮細胞發揮作用或調節其受體及其成分的治療試劑。
b.候選物質本申請中使用的「候選物質」是指能調節淋巴管內皮細胞活性或特性的任一分子。特定實施方案中，所述分子是能調節VEGFR-3與其受體間結合活性的分子。替代地，所述候選物質可調節VEGFR-3受體/配體相互作用的下遊效應，例如受體磷酸化。所述候選物質可以是蛋白或其片段，小分子抑制劑，或甚至核酸分子。可以肯定的是，通過篩選試驗鑑定的最有效藥物化合物為與其它已知的VEGFR-3活性調節物結構上相關的化合物。所述活性化合物可包括天然化合物的片段和部分，或者可以是那些僅在與已知化合物聯用時才顯示活性、反之則無活性的化合物。但是，在用人或動物模型測試所述化合物前，需要測定多種候選物，將有潛能的物質定為治療物。
因此，所述活性化合物可包括天然化合物的片段和部分，或者可以是那些在與已知化合物聯用時才顯示活性、反之則無活性的化合物。因此，本發明提供了篩選試驗卡鑑定可調節細胞VEGF受體的物質。需要指出的是，分離自天然來源的化合物，例如動物、細菌、真菌、植物，包括葉和皮，以及海產品樣本，都可作為作為潛在有效藥物的候選物進行鑑定。
應當理解的是，所要篩選的藥物還可以源自或合成自化學組合物或人造化合物。因此，應當理解的是本發明鑑定的候選物質可以是多肽、多核苷酸、小分子抑制劑，或者可以是通過推理性藥物設計從已知的VEGF受體調節物設計出來的任一其它無機或有機化合物。
候選物篩選試驗很容易建立並實施。因此，在候選物篩選試驗中，當獲得了本發明所述分離的淋巴管內皮細胞群之後，可以在能使淋巴管內皮細胞出現特異性可測活性或特異性特性的條件下，將候選物與該細胞群混合。在這種方式中，可以測定出候選物質調節該細胞在無候選物時的活性或特性的能力。
具體情況下的「有效量」是指相對於其正常水平能有效地可重複地改變細胞的給定事件、活性或表型的量。可以使用能實現活性的顯著適當變化的化合物。
活性或功能特性的顯著變化，例如，用遷移試驗(migration assays)、細胞增殖試驗、受體結合、自身磷酸化等測量的結果，可以表示為活性增加/減少至少約30％-40％，最優選改變至少約50％，當然儘可能為較大值。本發明的活性化合物還可用於製備抗體，然後將該抗體用在分析性和製備性(preparatory)技術中，來檢測和定量其它這類調節物。
本發明分離的細胞培養物可用於本領域已知的高通量篩選(HTS)試驗。綜述見Jayawickreme and Kost，Curr.Cpin.Biotechnol.8629-634(1997)。本發明還涉及自動的小型化HTS試驗，例如見Houston and Banks Curr.Opin.Biotechnol.8734-740(1997)。
已有大量用於鑑定小分子調節物的不同文庫，包括化學文庫、天然產物文庫及組合文庫，包括隨機肽或經設計的肽、寡核苷酸或有機分子。化學文庫由已知化合物經過天然產物篩選或從潛在治療靶的篩選中鑑定為滿足條件(hits or leads)的結構類似物組成。天然產物文庫由來自微生物、動物、植物、昆蟲或海洋生物的產物組成，它們用於通過，例如，發酵和提取來自土壤、植物或海洋生物的培養液，而製備篩選混合物。天然產物文庫包括多肽、非-核糖體肽及其非-天然變體。綜述見cience28263-68(1998)。組合文庫由大量肽寡核苷酸或有機化合物的混合物組成。它們可通過常規的自動合成方法、PCR克隆或其它合成方法相對簡單地製備而成。特別感興趣的是包括肽、蛋白、肽模擬物、多平行合成匯集(multiparallel synthetic collection)，重組以及多肽文庫的文庫。組合文庫以及由其製備的文庫的綜述見Myers Curr.Opin.Biotechnol.8701-707(1997)。然後，可以將應用所述各種文庫鑑定得到的候選調節物優化，以便通過例如推理性藥物設計來調節細胞的活性。
當然，應該理解的是本發明的所有篩選方法本身都是有效的，但仍然有可能未能發現有效候選物。本發明提供了用於篩選這類候選物的方法，而不僅僅是發現它們的方法。
c.體外試驗在一個具體實施方案中，本發明包括不同的結合試驗，例如，篩選配體-受體複合物的抑制劑，或者篩選能結合VEGFR-3的分子，該分子可作為該受體功能的替代物，並因此改變天然配體與該受體的結合和影響其活性。這類試驗中，細胞可以游離在溶液中，或者固定在支持物上。可以對細胞表面的配體或受體進行標記，從而可以測定結合。
這類試驗很容易實現自動化和高通量。化合物的高通量篩選的描述見WO84/03564。大量的小肽測試化合物被合成在固相支持物上，例如塑料大頭針或其它一些表面上。讓肽測試化合物與細胞反應然後洗滌。用各種方法檢測結合的多肽。專門設計了製備合適的肽測試化合物的組合方法。
這種方式中最感興趣的是篩選VEGFR-3受體在這些細胞上的天然配體的多種不同突變體，包括缺失、截短、插入和取代突變體，它們有助於鑑定出哪個結構域參與了配體/受體相互作用。一旦鑑定出這種區域，就可鑑定出雖然已經改變了結構但仍保留部分或全部這些相互作用的功能的那些突變體。
可以將純化的配體直接包被到平板上用於上述的藥物篩選技術。但是，也可以用所述多肽的非-中和抗體將多肽固定到固相物上。另外，也可以用含反應活性區域(優選末端區域)的融合蛋白將配體活性區域連接到固相物。
其它形式的體外試驗包括那些採用了功能讀出(functional readouts)的試驗。這類試驗中，可以根據物質的生化特性來適當配製，然後與細胞接觸。根據該試驗，需要進行培養。然後依靠上述的多種不同生理學試驗對細胞進行檢測。替代地，也可以實施分子分析，其中對細胞特性進行測定。這包括測定例如蛋白表達、酶功能、底物利用、mRNA表達(包括全細胞或polyA RNA的差異展示)以及其它。
G.用細胞進行診斷試驗在一些技術方案中，本發明的方法可以用於診斷細胞成分的功能或活性
(例如VEGER-3/配體相互作用)異常的病症或疾病。例如，可以使用本發明方法從疑似患有淋巴管內皮細胞相關疾病的患者分離出細胞。用來自細胞的多核苷酸序列進行雜交或PCR試驗，以便檢測與疾病相關的表達的存在。這類方法具有可定性或定量的特性，可以包括Southern或Northern分析，斑點印跡或其它基於膜的技術；PCR技術；dip stick，大頭針技術(pin)，晶片及ELISA技術。所有這些技術已經為本領域熟知，是大多數商品化診斷試劑盒的基礎。
此外，所述試驗還可用於評估具體治療方案在動物試驗、臨床試驗或在監測個體患者治療中的效率。為了提供疾病診斷的基礎，需要建立例如VEGFR-3受體的正常或標準動態譜。這通常包括獲得正常受試者的淋巴管內皮細胞，對其中的疾病標誌物進行合適雜交或擴增。常規雜交可以通過與正常受試者用系列稀釋的標誌物得到的數值進行比較來定量。可以將獲自正常樣本的標準數值與獲自待診斷特定病症的受試者的細胞樣本的數值進行比較。標準值和測試值之間出現偏差表明疾病存在。
疾病一經證實，就可施用治療藥物；並且制定治療方案。這類試驗可以有規律地重複，以評估動態變化是否向前進展或回歸正常或標準水平。連續治療圖譜可用於顯示數天或數月內的治療效果。
PCR描述見美國專利4,683,195和4,965,188。用於這類試驗的寡聚物通常用化學方法合成，但是也可以如本申請所述用酶促方法或者從重組來源製得。寡聚物通常包括兩種核苷酸序列，一為正義鏈一為反義鏈，在鑑定特異性基因或病症的最佳條件下使用。同樣的兩寡聚物，巢式成套寡聚物，或甚至簡併寡聚物的集合體可用於較低嚴謹條件下檢測和/或定量密切相關的DNA或RNA序列。
此外，對具體分子的表達定量的方法包括對核苷酸進行放射性標記(Melby et aL，J Immunol Methods 159235-44，1993)或生物素化標記(Duplaa等，Anal Biochem 229-36，1993)，使對照核酸共擴增，以及將試驗結果作為內插值插入標準曲線。以ELISA方式操作可以加速多樣本的定量，在ELISA中，目的寡聚物以不同稀釋度出現，分光光度或比色反應實現快速定量。這類診斷可使健康專家能夠開始積極治療並且防止病情的進一步惡化。類似地，可以用另外試驗監測治療過程中患者的進程。
H.試劑盒本發明涉及使用上述方法分離淋巴管內皮細胞的試劑盒。所述試劑盒可以包括試劑盒、標準VEGF受體配體、緩衝液等。由於本發明鑑定出了能特異性檢測淋巴管內皮細胞的抗體，這些成分中的任一個或者二者都可提供在試劑盒中。因而試劑盒可以包括，在合適的容器中，作為標準物的淋巴管或血管內皮細胞成分，能優先結合淋巴管內皮細胞的第一抗體，以及免疫檢測試劑。
可以以試劑盒方式提供的其它的本發明所述組合物為，基本不含其它非-淋巴管細胞系汙染細胞的淋巴管內皮細胞，以及基本不含其它非-血管細胞系汙染細胞的血管內皮細胞。所述細胞可以是培養瓶中增殖的培養物，或者深低溫保藏的細胞。以細胞為基礎的試劑盒還包括合適的培養基、生長補充劑以及用於培養細胞的培養條件的說明。
一些實施方案中，可將能結合淋巴管內皮細胞的第一抗體固定於固相支持物，例如柱體基質或微量滴定板的孔。
所述試劑盒的免疫檢測試劑可採用多種形式中的任一形式，包括那些結合或連接到特定抗體或抗原上的可檢測標記物，以及結合或連接到第二結合配體上的可檢測標記物。範例性的第二配體是那些對第一抗體或抗原具有結合親和力的第二抗體，和對人抗體具有結合親和力的第二抗體。
用於本發明試劑盒的其它合適免疫檢測試劑包括兩-組分試劑，其包括對第一抗體或抗原具有親和力的第二抗體，以及對第二抗體具有親和力的第三抗體，該第三抗體上連接一可檢測標記物。
所述試劑盒還可包括適當等分量的增殖細胞或深低溫保藏細胞，它們帶有或者不帶有標記，可用來製備檢測試驗的標準曲線。
所述試劑盒可包括抗體-標記物偶聯物，該偶聯物可以是完全偶聯形式，中間體形式，或者是要靠試劑盒使用者進行連接的多個獨立組件。試劑盒的組分可以包裝於含水介質或凍幹形式。
試劑盒的容器通常包括至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器或其它容器，其中放置抗體或抗原，並且優選進行適當等分。當提供第二或第三種結合配體或附加組分的情況下，所述試劑盒通常還包括第二、第三種或其它另外的容器，可將該配體或組分放置其中。本發明的試劑盒通常還包括裝載抗體、抗原的器皿，和任一其它全封閉適於商品化銷售的試劑容器。所述容器可包括注射器或吹製成型的塑料容器，其中可保留(retain)小瓶。
I.淋巴管內皮細胞成像本發明方法的另一用途是在組織成像中確定具體組織中是否存在淋巴管內皮細胞。所述診斷成像特別適用於從例如患淋巴管病症的患者的組織獲得圖像。另外，腫瘤實體之中或附近的淋巴管也可通過本發明成像。此前，本領域技術人員已經使用VEGFR-3抗體用於成像目的，例如美國專利6,107,046中所述(在此引入作為參考)。本發明中的2E11D11及相關抗體可用來以與美國專利6,107,046中抗體為基礎的方法類似的方式成像。
可將本發明的成像試劑(即，本申請全文中提及的抗體或抗體衍生物)共價或非共價偶聯於合適的超磁、順磁、電子密集的、產回聲的或放射性的試劑從而製備出一種定位成像試劑。這類實施方案中，將成像試劑定位於淋巴管內皮細胞，然後使用上述技術讓所定位的區域成像。
本領域已知了許多合適的成像試劑，以及將標記試劑結合到本發明肽上的方法(參見，例如，美國專利4,965,392，美國專利4,472,509，美國專利5,021,236和美國專利5,037,630，在此引入作為參考)。將可藥用載體中的成像試劑施加於患者，讓其聚集在具有淋巴管內皮細胞的目標位點。然後該成像試劑作為目標位點X-射線、磁共振、超聲波或閃爍成像的對比試劑(contrastreagent)。對於癌症、淋巴水腫及其它淋巴管內皮細胞病症的診斷研究而言，本發明的抗體操作方便，是現有醫學成像工具武器庫的重要補充。當然，應該理解的是所述成像可以在體外進行，其中，通過活組織檢查獲得患者組織，藉助本申請所述成像試劑，以及用於製備並固定組織的組織化學技術，來確定淋巴管內皮細胞的存在。
用於本發明成像試劑中的順磁離子包括例如鉻(III)，錳(II)，鐵(III)，鐵(II)，鈷(II)，鎳(II)，銅(II)，釹(III)，釤(III)，鐿(III)，釓(III)，釩(II)，鋱(III)，鏑(III)，鈥(III)和鉺(III)。用於X-射線成像的離子包括但不限於鑭(III)，金(III)，鉛(II)以及特別是鉍(III)。診斷用的放射性同位素包括例如，211砹，14碳，51鉻，36氯，57鈷，67銅，152Eu，67鎵，3氫，123碘，125碘，11銦，59鐵，32磷，186錸，75硒，35硫，99m鎝以及90釔。
本發明的抗體可用本領域熟知的技術標記。例如，本發明肽可通過與碘化鈉或碘化鉀及化學氧化劑如次氯化鈉或酶氧化劑如乳過氧(化)物酶接觸實現碘標記。可以通過配體交換實現抗體的鎝99m標記，例如，用二價錫溶液還原高鎝酸鹽(pertechnate)，將還原後的鎝螯合於Sephadex柱，然後將抗體加載到該柱體上。這些或其它標記蛋白及肽的技術已為本領域熟知。
J.藥物組合物許多方面，本發明所述的細胞或其它組合物可用於臨床用途。因此，有必要將其配製成藥物組合物，即一種適於體內使用的形式。通常，應當確保製成的組合物基本不含熱原，並且基本不含對人或動物體有害的其它雜質。
本領域技術人員通常使用合適的鹽及緩衝液以使遞送載體穩定並可為靶細胞攝入。在將重組細胞導入患者時也可以使用緩衝液。本發明的含水組合物包括有效量的肽或細胞表達載體，溶解或懸浮於可藥用載體或含水介質中。所述組合物也被稱為接種物。″可藥用″是指分子實體及組合物施用給動物或人體時不會產生有害、過敏或其它不良反應。本申請中，「可藥用載體」包括任一及所有溶劑、懸浮介質、包衣、抗細菌及抗真菌劑，等滲及吸收延緩劑等。這些介質及試劑用於藥物活性物質已為本領域熟知。任一常用介質或試劑除非其與本發明的載體或細胞不相容，否則都可用於治療組合物。還可向組合物中添加活性成分。
本發明的活性組合物包括常規藥物製劑。本發明的這些組合物可以通過任一常用途徑施用，只要通過該途徑能夠為靶組織利用。藥物組合物可通過任一常規方法導入受試者，例如靜脈內，皮內，肌肉內，乳房內，腹膜內，鞘內，眼球後，肺內(例如，定期釋放(term release))；通過，舌下，鼻腔，肛門，陰道，或經皮遞送，或者通過外科手術植入具體位點。治療可以由單劑量或者一段時期內的多劑量組成。
可以將要施用的活性化合物製備為游離鹼或可藥用鹽的水溶液，與表面活性劑(例如羥丙基纖維素)適當混合。也可以在甘油、液態聚乙二醇及其混合物中製備膠體溶液和在油中製備膠體溶液。當在常規條件下存儲和使用時，這些製劑含有防止微生物生長的防腐劑。
適於注射用的藥物形式包括無菌水溶液或膠體溶液以及即時配製無菌注射液或膠體溶液的無菌粉末。所有情況下，所述形式必須無菌並且必須流動性達到易於注射的程度。在製備及存儲條件下它必須穩定，並且保存於抗微生物(例如細菌和真菌)汙染作用的條件下。所述載體可以是溶劑或分散介質包括，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油，丙二醇，以及液態聚乙二醇，等)，其合適的混合物，以及植物油。可以通過下列手段保持合適的流動率例如，通過使用包衣如卵磷脂，通過保持膠體溶液的所需顆粒大小以及通過使用表面活性劑。防止微生物作用可通過各種各種抗細菌和抗真菌劑實現，例如，對羥基苯甲酸酯類，氯丁醇，苯酚，山梨酸，硫柳汞，等。許多情況下，優選包括等滲劑，例如，蔗糖或氯化鈉。可注射組合物的延時吸收可通過在組合物中使用延緩吸收劑實現，例如單硬脂酸鋁和明膠。
無菌注射液可以通過下述方法配製而成將需要量的活性化合物以及必要時連同各種其它上面所列成分，引入合適的溶劑中，然後過濾除菌。通常，膠體溶液通過將各種無菌活性成分和所需其它上列成分引入到含有基礎分散介質的無菌載體中來製備。對於製備無菌注射液所用的無菌粉末而言，優選的製備方法是真空乾燥技術及凍幹技術，從其已經過濾除菌的溶液製備活性成分粉末以及任一附加的所需成分。
本申請中，「可藥用載體」包括任一及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌及抗真菌劑，等滲及吸收延緩劑等。這些介質及試劑用於藥物活性物質已為本領域熟知。任一常用介質或試劑除非其與該活性成分不相容，否則都可用於治療組合物。還可向組合物中引入輔助活性成分。
當口腔施用時，組合物中可引入賦形劑，使用形式為不可消化的漱口藥及貼牙劑(dentifrice)。漱口藥可通過將合適量的活性成分引入適當溶劑，例如硼酸鈉溶液(Dobell′s Solution)中來製備。替代地，可以將活性成分引入含硼酸鈉、甘油及碳酸氫鉀的消毒洗液。還可將活性成分分散於貼牙劑中，包括凝膠、糊劑、粉末及漿劑。可以將治療有效量的活性成分加入到糊狀貼牙劑中，貼牙劑可包括水、粘合劑、研磨劑、調味劑、發泡劑以及溼潤劑。
本發明的組合物可配製成中性或鹽的形式。可藥用鹽包括酸加成鹽(用蛋白質的游離氨基形成的)以及用無機酸如鹽酸或磷酸形成的或者用醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等有機酸形成的鹽。用游離羧基形成的鹽也可出自無機鹼，例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化氨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，以及異丙胺，三甲胺，組氨酸，普魯卡因(procaine)等有機鹼。
本發明的組合物可配製成中性或鹽的形式。可藥用鹽包括酸加成鹽(用蛋白質的游離氨基形成的)以及用無機酸如鹽酸或磷酸形成的或者用醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等有機酸形成的鹽。用游離羧基形成的鹽也可出自無機鹼，例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化氨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，以及異丙胺，三甲胺，組氨酸，普魯卡因(procaine)等有機鹼。
通過配製，以與服用劑型(dosage formulation)相容的方式和治療有效的量施用溶液。所述配製劑易於以多種劑型施用，例如注射液、藥物釋放膠囊等。當以水溶液進行胃腸道外施用時，如果必要應將溶液適當緩衝並且首先用足量的鹽或葡萄糖使液態稀釋液劑等滲。這些具體的含水溶液特別適於靜脈內，肌肉內，皮下及腹膜內施用。
″單位劑量″定義為治療組合物分散於合適載體中的離散量，當胃腸道外施用多肽時，多肽組合物通常的注射劑量為1μg/kg～100mg/kg體重/天，優選的劑量為0.1mg/kg～約50mg/kg體重/天。胃腸道外施用可以通過先快速濃注然後連續灌輸實現，以便保持藥品的治療循環水平。本領域的普通技術人員很容易就可根據良好的醫療實踐及患者個體的臨床狀況優化治療有效量以及確定施用方案。
用藥頻率取決於該藥物的藥物動力學參數及施用途徑。本領域技術人員可以根據施用途徑及所需劑量確定出最佳的藥物劑型。參見，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版.(1990，Mack Publ.Co，EastonPA18042)pp1435-1712，在此引入作為參考。所述劑型可影響身體狀況，所施用藥物的穩定度、體內釋放速率及體內清除速率。依據施用途徑，可根據體重、體表面積或器官大小計算出合適劑量。確定合適治療劑量所需的進一步精確計算，本領域普通技術人員無需過度試驗就可很容易地實現，特別是在本申請公開的劑量信息和試驗以及動物或人臨床試驗觀察到的藥動數據幫助下。
合適劑量可以通過已有的測定凝血水平(blood clotting level)的試驗結合相關劑量-應答數據來確定。最終的用藥方案由主治大夫考慮改變藥物作用的因素後決定，例如，藥物具體活性、損傷嚴重程度及患者的敏感程度、年齡、身體狀況、體重、性別及患者飲食，任一感染的嚴重程度，施用時間以及其它臨床因素。當試驗進行時，還會出現有關合適劑量水平以及針對特定疾病及身體狀況的治療持續時間的進一步信息。
在使用病毒遞送的基因治療實施方案中，可以根據所施用病毒顆粒的劑量計算出單位劑量。病毒劑量包括具體數目的病毒顆粒或噬斑形成單位(pfu)。對於使用腺病毒的治療方案，具體的單位劑量包括103，104，105，106，107，108，109，1010，1011，1012，1013或1014pfu。由於存在感染性缺陷顆粒，所以顆粒劑量可以稍作增加(10～100倍)。
應當理解的是本發明的藥物組合物及治療方法可以用於人醫和獸醫。因此，所治療的受試者可以是哺乳動物，優選為人或其它動物。對於獸醫領域，受試者包括，例如，農場動物，包括奶牛、綿羊、豬、馬及山羊；伴侶動物，包括狗和貓，引進的(exotic)和/或動物園動物；實驗室動物，包括小鼠、大鼠、豚鼠和倉鼠；以及禽類例如雞、火雞和鵝。
K.實施例下列實施例雖然給出了優選的實施方案和技術，但是無意對本發明進行限制。本領域技術人員，根據說明書的內容，應當能理解到可以對所公開的具體物質和方法進行多種改動，而仍然得到不脫離本發明實質和範圍的相同或類似結果。
實施例1材料和方法本實施例提供了本申請以及本申請實施例部分所使用材料和方法的詳細情況。
抗體和生長因子.免疫螢光中使用的第一抗體為小鼠抗人CD31(Dako)、vWF(Dako)或VEGFR-3的mAbs(克隆9D9F9、2E11D11和7B3F9；Jussila等，Cancer Res.581599-1604，1998)，兔抗人LYVE-1抗血清(Banerji等，J.Biol.Chem.，144(4)789-801，1999)，親和純化的兔抗-人podoplanin(Breiteneder-Geleff等，等，Am.J.Path.，154(2)385-394，1999)或兔抗-人VEGF-C(882；Joukov等，EMBO J.，15290-298，1996)。抗增殖細胞核抗原的單克隆抗體(克隆PC10)購自Santa Cruz Biotechnology。FITC-或TRITC-偶聯的山羊抗-兔IgG、山羊抗-小鼠IgG以及驢抗-小鼠IgG購自JacksonImmunoresearch。兔抗人VEGFR-2血清為Lena Claesson-Welsh(Uppsala，Sweden)惠贈，親和純化的山羊抗-人VEGFR-1購自RD系統。兔抗Akt、MAPK或CREB多克隆抗體購自New England生物實驗室。鹼性FGF，重組人VEGF165和重組成熟人VEGF-D(由Phe93～Ser201殘基組成)購自RD。重組人P1GF-1為Graziella Persico(Naples，Italy)惠贈。重組人VEGF-C(Thr103～Leu215)、VEGF-C156S(Thr103～Ile225)、ORFV2-VEGF和人VEGFR-3-Ig按照此前描述的方法(Joukov等，EMBO J.，163898-3911，1997；Mkinen等，Nature Med.，7199-205，2001；Wise等，Proc.Nat′l Acad Sci.，963071-3076，1999)製備和純化。沃特曼寧(wortmannin)、LY294002、PD98059和Bisindolylmaleimide I(GF109203X)購自Calbiochem，U0126購自Promega(Madison，WI)。
細胞培養物.HMVE和HUVE細胞購自PromoCell(Heidelberg，Germany)，用廠商提供的內皮細胞培養基培養，在傳至第3-7代時使用。鼠Ba/F3原-B淋巴細胞培養於添加了10％胎牛血清、穀氨醯胺和2ng/ml IL-3的DMEM(Calbiochem)中。
免疫螢光染色.將玻璃蓋片上的細胞用4％多聚甲醛(PFA)或甲醇∶丙酮(1∶1)固定10分鐘。如果需要，將細胞用0.1％的TritonX-100PBS溶液通透5分鐘。細胞用5％山羊血清封閉後，在室溫下用第一抗體染色30分鐘，然後用FITC或TRITC-偶聯的第二抗體(15ug/ml)孵育30分鐘。用Hoechst 33258螢光染料(Sigma，以0.5μg/ml於PBS中)染色細胞核。如果細胞活體染色，操作在冰上進行，然後用PFA固定。
淋巴管和血管內皮細胞的分離.單克隆VEGFR-3抗體(克隆2E11D11)或多克隆的podoplanin抗體，MACS膠體性質的超-順磁微珠偶聯的大鼠抗-小鼠IgG1或山羊抗-兔IgG抗體(Miltenyi Biotech，Bergisch Gladbach，Germany)，用MACS MS分離柱和MiniMACS離析器(Miltenyi Biotech)按廠商說明書分選細胞。
VEGFR刺激的生物分析.存活力試驗使用表達有VEGFR-2/EpoR(Achen等，Proc Natl Acad Sci USA 95548-53 1998；Stacker等，J.Biol.Chem.，27434884-34892，1999)或VEGFR-3/EpoR(Achen等，Eur.J.Biochem.，2672505-2515，2000)的Ba/F3原-B細胞，按照前述方法(Mkinen等，NatureMed.，7199-205，2001)進行。為了製備Ba/F3VEGFR-1/EpoR細胞，通過下述操作構建一嵌合受體將BglII位點導入人VEGFR-1cDNA中編碼跨膜區的序列之前，其後連接由小鼠促紅細胞生成素受體跨膜區及胞內區域構成的BglII-NotI片段(Achen等，Eur.J.Biochem.，26725052515，2000)。將VEGFR-1/EpoR cDNA亞克隆入pEF-BOS表達載體(Mizushima and Nagata，NucleicAcid Res.，185322，1990)，然後與pCDNA3.1(+)Zeo載體(Invitrogen)共轉染Ba/F3細胞。用250mg/ml zeocin篩選，得到穩定的細胞庫。
生物傳感器實驗.所有蛋白製劑在臨用之前都用裝備在SMARTTM系統(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)中的Superose12(3.2/30)柱進行微量製備性大小排阻HPLC，以便分析同質性和進行緩衝交換(Nice andCatimel，Bioessays，21339-352，1999)。用E280 1％ 1cm的0-65在280nm處的吸收值測定VEGF-C和VEGF-D的濃度。用常規氨基偶聯化學方法(Niceand Catimel，Bioessays，21339-352，1999)將受體結構域偶聯於CM5傳感器晶片的羧甲基化葡聚糖層，用BIAcore2000光學生物傳感器(BIAcore，Uppsala，Sweden)分析配體的結合情況。被固定的VEGFR-2和VEGFR-3的水平分別為3,000RU和7,000RU。固定後，將剩餘的活性酯基團用下述操作封閉用pH8.5的1M鹽酸乙醇胺處理後用10mM二乙胺洗滌除去未-共價結合的物質。在VEGF-D或VEGF-C結合試驗之間分別用10mM二乙胺或10mM HCl使傳感器表面再生。將樣本稀釋於工作緩衝液(running buffer)(10mM HEPES pH7.4，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％Tween20)。通過下述方法測定VEGF-C和VEGF-C156S與受體結構域之間的表觀結合親和力分析初始解離階段以獲得kd，然後用其約束曲線結合區域的整體分析(global analysis)，採用1∶1 Langmuirian模型。按照此前描述的方法(Catimelelal.，J.Chronutogr.，77615-30，1997)用BIAevaluation3.0(BIAcore，Uppsala，Sweden)進行數據分析。
內皮細胞凋亡試驗.對於凋亡試驗，以每孔70,000個細胞的量種植於24-孔平板。進行雙份平行處理，通過用死亡檢測ELISA PLUS試劑盒(Roche，Indianapolis，IN)測量細胞質組氨酸-結合性DNA片段，從而檢測凋亡。測試得到下列的生長因子濃度範圍bFGF 10-20ng/ml、P1GF-1 50-1000ng/ml、VEGF 10-50ng/ml、VEGF-C 50-1000ng/ml、VEGF-D 50-1000ng/ml、VEGF-C156S 50-1000ng/ml和VEGF-E 50-1000ng/ml。按照廠商說明書通過螢光顯微鏡檢術用膜聯蛋白-V-FLUOS(Roche，Indianapolis，IN)檢測凋亡細胞上的磷脂醯絲氨酸。用碘化丙錠(1μg/ml)同時染色，用來區別可能的壞死細胞。
Western印跡試驗.將內皮細胞培養於35mm平皿至接近鋪滿，用無血清培養基飢餓24h，如所述進行刺激。該刺激的1-3小時前，加入沃特曼寧(30nM)，LY294002(10-20μM)、PD98059(10-25μM)或GF109203X(2.5-5μM)。DMSO中溶入抑制劑用作對照。刺激後，將細胞裂解於裂解緩衝液(50mM HEPES，pH7.5，150mM NaCl，10mM EDTA，100mM NaF，1％TritonX-100，補加2mM Na3V04，0.5mM PMSF，100U/ml抑蛋白酶肽和10μg/ml亮抑蛋白酶肽)中。將澄清的裂解物用SDS-PAGE分離，轉移至硝酸纖維素膜，用抗Akt-Ser473、Akt-Thr308、p42/44 MAPK-Thr202/Tyr204或CREB-Ser133的磷酸特異性(phosphospecific)抗體進行免疫印跡。用偶聯有辣根過氧化物酶的二抗和增強化學發光檢測系統檢測結合的上述抗體。將印跡製成小條，用抗Akt、MAPK或CREB的抗體進行再探測，然後通過用Multi-Analyst2.0.1程序(Bio-Rad)讀取光密度信號來定量。
細胞遷移試驗.遷移試驗在48-趨化性Boyden槽(Neuroprobe Inc.)中進行。8微米Nucleopore聚碳酸酯濾膜(Corning)用100μg/ml I型膠原質(Upstate Biotechnology)+4℃下過夜包被，然後空氣乾燥。將濾膜置於下部的槽孔，該孔中盛裝著置於補加有0.2％BSA的無血清培養基中的生長因子。對於封閉試驗而言，將VEGF和VEGF-C156S用10倍摩爾過量的可溶性人VEGFR-3預孵育30分鐘。將HMVE細胞懸於培養基中，向上部槽孔每孔中加入含10,000個細胞的50μl上述培養基。然後讓細胞37℃遷移6小時，然後，上述濾膜用冷甲醇固定，並用蘇木精(Meyer)染色。用棉籤刮去濾膜上表面上的未-遷移細胞，然後計算遷移細胞的數目。共進行4組平行試驗，並且用三個不同批次的HMVECs進行重複。
實施例2由不同群的血管及淋巴管內皮細胞組成的人真皮微脈管內皮細胞不同VEGF受體的功能已經在轉染細胞系進行了詳細研究，但是由於缺乏合適的細胞背景使這些研究獲得的結果打了折扣。因此，本發明著手將微脈管內皮細胞分離為由一種基本不含其它類型內皮細胞的內皮細胞特異性組成的內皮細胞群。更具體地說，本發明人製備了基本不含血管內皮細胞的淋巴管內皮細胞群，反之亦然。為了繼續這種努力並闡明促進內皮細胞存活的VEGFR-3信號傳導途徑，本發明人使用了原代內皮細胞、人真皮微脈管內皮細胞(HMVEC)以及人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)。已經證實所有三種VEGF酪氨酸激酶受體以及neuropilin-1共受體在HMVE和HUVE這兩種細胞培養物中都有表達。本實施例對這些結果進一步詳細解釋。
為了測定VEGFR mRNAs在原代人真皮微脈管內皮細胞(HMVEC)、人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)和豬主動脈內皮(PAE)細胞中的表達，用放射性標記的人VEGF受體cDNA片段探測含8μg mRNA的Northern印跡，等量加樣b-肌動蛋白作為對照。右側數字代表轉錄本的大小(kb)。VEGFR-3mRNA的表達在微脈管內皮細胞中較強，因此，將這些細胞用於後續試驗中VEGFR-3信號傳導的研究。
使用免疫螢光，本發明人查明HMVE細胞由血管內皮細胞及淋巴管內皮細胞這兩種不同群組成。簡而言之，用抗VEGFR-3和LYVE-1的抗體進行免疫螢光雙-染色，用Hoechst螢光素復染細胞核。免疫螢光染色表明所有VEGFR-3陽性細胞中都沒有檢測到LYVE-1的表達，而一些VEGFR-3陰性細胞也僅被LYVE-1抗體微弱染色。另外還用抗podoplanin、vWF和CD31的抗體進行了免疫標記，並用Hoechst螢光素對核進行染色。這套雙染色試驗表明vWF表達主要發生在podoplanin陰性細胞但是在podoplanin陽性細胞中也檢測到了微量的表達。對VEGFR-3、LYVE-1染色，細胞核用Hoechst螢光素復染以及對podoplanin染色都使用活的細胞在冰上進行，而對vWF和CD31的染色要先用PFA固定。
因此，免疫螢光顯微鏡檢術表明只有一個亞組(subset)的HMVE細胞為VEGFR-3陽性。抗原-封閉試驗以及3種不同單克隆抗體的使用表明VEGFR-3染色是特異性的。表達VEGFR-3的細胞呈獨立島嶼狀生長，周圍環繞著VEGFR-3陰性細胞。根據此前的人組織免疫染色結果(Jussila等，CancerRes.5815991604，1998；Lymboussaki等，Am.J.Pathol.，153395-403，1998)，可以認定前者為淋巴管內皮細胞而後者為血管內皮細胞。這些細胞中大多數但並非所有，以及一些VEGFR-3陰性細胞用淋巴管內皮細胞標記物LYVE-1染色(Banerji等，J.Biol.Chem.，144(4)789-801，1999)。VEGFR-3陽性細胞還可針對另一種最近鑑定的淋巴管內皮細胞標誌物podoplanin(Breiteneder-Geleff等，等，；，Am.J.Path.，154(2)385-394，1999)進行特異性染色。在FACS分析中也獲得了近似結果。vWF抗原在podoplanin陰性的血管內皮細胞中表達更為顯著。所有細胞中都檢測到了泛-內皮細胞標誌物CD31，這證實了沒有汙染非-內皮細胞。另外，根據Western印跡試驗，在兩種內皮細胞群中都檢測到了VEGFR-1和VEGFR-2。在新鮮分離到的HMVE細胞中，VEGFR-3陽性細胞的比例一般大於50％，反覆再培養的情況下有所減少。
實施例3細胞存活試驗中使用的VEGFR特異性配體的分析VEGF是一種內皮細胞有絲分裂原，另外還發現其能通過活化VEGFR-2保護內皮細胞免遭餓死以及TNF-a誘導的凋亡(Gerber等，J.Biol Chem.，27330336-30343，1998；Spyridopoulos等，J Mol.Cell.Cardiol.，291321-1330，1997)。不同VEGFR促進內皮細胞存活的能力通過VEGFR的特異性VEGF進行比較。所用生長因子的特異性用細胞存活生物分析來測定。對於生物分析而言，用嵌合受體穩定轉染Ba/F3原-B細胞，該嵌合受體中含有與小鼠促紅細胞生成素受體跨膜結構域及胞質結構域融合的人VEGFR-1、VEGFR-2或VEGFR-3胞外區。
正如所料，只有VEGF和P1GF能誘導VEGFR-1/EpoR細胞的存活(圖1A)。VEGF、VEGF-C、VEGF-D和orf病毒性NZ2(ORFV2-VEGF)能夠支持VEGFR-2/EpoR表達細胞的存活，而只結合併活化VEGFR-3的突變型VEGF-C156S(Joukov等，EMBOJ.，15290-298，1998)未對這些細胞的存活產生影響(圖1B)。相反，VEGFR-3/EpoR表達細胞在有VEGF-C，VEGF-C156S和VEGF-D存在的條件下存活(圖1C)。VEGF-C濃度為100ng/ml和VEGF-C156S濃度為500ng/ml時，VEGFR-3/EpoR細胞存活試驗獲得最大存活力，在後續的凋亡及信號傳導試驗中選擇上述濃度。
用生物傳感器試驗進一步研究VEGF-C及VEGF-C156S與VEGFR-2及VEGFR-3間的相互作用。分析生物傳感器結合曲線證實了VEGF-C156S只能結合VEGFR-3的胞外區，而野生型VEGF-C結合VEGFR-2和VEGFR-3兩種受體(圖1D-圖1G)。VEGF-C/VEGFR相互作用的動力學分析(表I)顯示KD值低於此前使用受體表達細胞培養物進行放射活性配體結合試驗的報導值(Joukov等，EMBO J.，163898-3911，1997)。但是，在這兩個試驗中，VEGF-C對VEGFR-3的親和力高於對VEGFR-2的親和力。當與VEGF-C相比時，VEGF-C156S對VEGFR-3的親和力明顯較低，但是程度上近似於小鼠VEGF-D與小鼠VEGFR-3間相互作用的報導結果(Baldwin等，J.Biol.Chem.，27619166-19171，2001)。
表I生物傳感器分析VEGF-C及VEGF-C156S與VEGFR-2及VEGFR-3間相互作用得到的動力學數據。採用1∶1 Langmuirian模型用BIAevaluation 3.0整體適配(global fitting)提取數據，有質量轉換(mass tranfer)。
*＝參考文獻Baldwin等，J.Biol.Chem.，27619166-19171，2001縮寫h＝人；m＝小鼠Baldwin等試驗中使用的配體為成熟形式的VEGF-D，本試驗中使用的VEGF-C和VEGF-C156S也為成熟形式。除mVEGFR-2為單價以外，其它所用受體全部都為二價免疫球蛋白融合蛋白。
實施例4VEGFR-3信號傳導保護內皮細胞免遭血清飢餓-引發的凋亡能夠刺激VEGFR-2或VEGFR-3或者兩者都能刺激的所有VEGF，包括VEGF、VEGF-C、VEGF-C156S、VEGF-D和ORFV2-VEGF，都能保護微脈管內皮細胞免遭飢餓誘導的DNA降解，這種降解用細胞質組氨酸-結合性DNA片段的量來測算(圖2A)。相反，只結合VEGFR-1的P1GF並沒有提供明顯保護。VEGFR-1介導的存活信號的缺乏也被下述事實所驗證VEGFR-2的特異性配體ORFV2-VEGF提供了與VEGF近乎相當的保護。VEGF-C和VEGF-C156S呈劑量-依賴性地抑制寡核小體及單核小體在血清-剝奪後的淋巴管內皮細胞中的積聚。VEGF-C在100ng/ml時達到最強效果，而VEGF-C156S在500ng/ml時效果最佳。
實施例5表達VEGFR-3的淋巴管內皮細胞的分離為了將VEGF對淋巴管內皮細胞存活的作用與對血管內皮細胞存活的作用進行比較，使用特異性抗體和磁性微珠分離並培養VEGFR-3陽性及陰性細胞。簡而言之，在該方法中，培養三組相互獨立的表達VEGFR-3的淋巴管內皮細胞第一組培養於含5％血清的完全培養基，第二組培養於含5％血清並補加了VEGF(10ng/ml)的完全培養基，第三組培養於含5％血清並補加了VEGF-C(100ng/ml)的完全培養基。分選後，將VEGFR-3陽性細胞在血清中或在補加了VEGF-C後培養5天，對podoplanin染色，然後增殖細胞核抗原(PCNA)。核用Hoechst螢光色素染色。如果補加了VEGF-C或VEGF，那麼細胞就染色PCNA。另外，還用抗podoplanin或VEGFR-3的抗體對未-分選細胞或VEGFR-3陰性及VEGFR-3陽性細胞群進行免疫螢光雙染色。
根據免疫螢光染色的結果，淋巴管內皮細胞培養物的純度高於95％。分離的VEGFR-3陽性細胞並未充分吸附到培養皿上，只有極少數細胞在含血清的完全培養基中增殖。但是，如果補加了VEGF或VEGF-C，那麼大部分podoplanin陽性細胞很容易地就增殖了。相反，血管內皮細胞在未添加這些因子的條件下生長很好。
分離的淋巴管內皮細胞變得更長，細胞出現數個突出，尤其是培養在有VEGF-C存在的條件下。在未-分選的VEGFR-3陰性和VEGFR-3陽性細胞群中，podoplanin和VEGFR-3的免疫螢光共定位於同一種細胞。在補加了VEGF-C的培養基中，只觀察到了針對VEGFR-3的細胞質染色，這與配體-受體複合體的內化相一致。相反，在有血清或VEGF的培養基中，VEGFR-3分布在細胞表面上。
實施例6VEGF-C主要促進表達VEGFR-3的淋巴管內皮細胞的存活測量細胞質單核小體及寡核小體的積聚，作為血清飢餓過程中兩種內皮細胞群凋亡的信號。在VEGFR-3表達細胞，VEGF-C和VEGF促進細胞存活(圖2B)。但是，對於VEGFR-3陰性細胞來說，VEGF-C是一種較低效的存活因子，要達到與VEGFR-3陽性細胞檢測到的同等效果需要提高5-10倍的濃度。正如所料，VEGF-C156S只誘導VEGFR-3陽性細胞的存活(圖2B)。這些結果證實VEGFR-3獨自就能傳導內皮細胞存活信號，VEGF和VEGF-C分別靶向血管內皮細胞和淋巴管內皮細胞。選擇性促進淋巴管內皮細胞生長的能力使得這些類型細胞的細胞培養物進一步富集。
另外，血清-剝奪誘導的凋亡也可以通過用螢光-偶聯磷脂-結合蛋白，膜聯蛋白-V，分析細胞表面磷脂醯絲氨酸的暴露情況來監測。血清飢餓24小時後檢測到了膜聯蛋白-V染色的細胞，飢餓72小時時，貼壁細胞中約40％凋亡，但這些細胞在早期的數代及在融合時對凋亡抗性更強。
向飢餓培養基中加入VEGF大大減少了呈膜聯蛋白-V陽性的細胞的數目以及細胞的脫附。膜聯蛋白-V染色HMVE細胞在無血清培養基(BSA)單獨培養或者VEGF或VEGF-C刺激72小時後進行的。用抗podoplanin抗體同時染色，以區分淋巴管內皮細胞和血管內皮細胞。使用這種染色方法，能夠檢測凋亡的、膜聯蛋白-V陽性淋巴管內皮細胞和凋亡的血管內皮細胞。另外，核用Hoechst螢光色素復染。膜聯蛋白-V陽性細胞未被碘化丙錠染色，因此，它們是凋亡的細胞而非壞死的細胞。另一方面，核用Hoechst螢光色素染色顯示凋亡中的細胞典型的固縮核。這些固縮核經TUNEL染色也為陽性。值得注意的是，用VEGF-C刺激以及特別是用VEGF-C156S刺激主要增加了淋巴管內皮細胞的存活(圖3)。在BSA和VEGF處理的培養物中，Podoplanin陰性細胞中膜聯蛋白-V陽性細胞的數目也較高(圖3)。這可能部分為間接效果，因為血管內皮細胞而非淋巴管內皮細胞產生VEGF-C，因此它們可能促進淋巴管內皮細胞的存活。
實施例7VEGFR-3磷酸化導致PI-3-激酶依賴性Akt活化正如在發明背景中討論的那樣，生長因子受體促進細胞存活時所利用的一種主要信號傳導途徑使用PI-3-激酶及其下遊靶，絲氨酸-蘇氨酸激酶Akt。可以通過使用磷酸特異性抗體測評絲氨酸473和蘇氨酸308的Akt磷酸化，以便分析不同的VEGF對Akt的作用。在經VEGF，ORFV2-VEGF，VEGF-C，VEGF-C156S或VEGF-D刺激的HMVE細胞中，Akt在Ser473被磷酸化，而經P1GF刺激的HMVE細胞無此情況。這表明Akt是通過由VEGFR-2或VEGFR-3，而非由VEGFR-1傳導的生長因子信號活化的。另外還檢測到了AktThr308磷酸化的類似增加。PI3-激酶抑制劑沃特曼寧(30nM)和LY294002(20，μM)終止了應答所有VEGF時的Akt磷酸化，這表明VEGFR-3介導的Akt活化是通過PI3-激酶傳導的，和此前VEGFR-2觀察到的情況相同(Gerber等，J.BiolChem.，27330336-30343，1998；Thakker等，J.BioL Chem.，2741000210007，1999)。
在HMVEC暴露於VEGF後20-30分鐘，Akt的磷酸化達到最大程度，而VEGF-C誘導的Akt磷酸化峰值出現在之後的10分鐘時(圖4)。形成鮮明對照的是，VEGF-C156S刺激導致較慢的磷酸化，峰值在第30-40分鐘時。下遊靶標活化中的差異表明通過VEGFR-2或VEGFR-3進行的Akt磷酸化可以通過不同途徑傳導。VEGFR-2通過經典途徑傳導Akt磷酸化的信號，該途徑與PI3-激酶的調控性p85亞單元組成性結合(Thakker等，JBiol.Chem.，27410002-10007，1999)。相反，本發明人及其它人還未能檢測p85與VEGFR-3的結合或者VEGFR-3自身磷酸化後PI3-激酶活性的刺激(Borg等，Oncogene，10973-984，1995；Pajusola等，Oncogene，93545-3555，1994)。
實施例8用VEGF-C同時刺激VEGFR-2和VEGFR-3導致持續的p42/p44MAPK活化本發明人發現當VEGF-C刺激時，通過VEGFR-2和VEGFR-3的同時信號傳導導致HMVE細胞中持續的p42/p44MAPK活化。p42/p44MAPK活化通過Western印跡用磷-Thr202/Tyr204-MAPK特異性抗體檢測，而CREB磷酸化使用磷-Ser133特異性抗體檢測。所用生長因子濃度為VEGF10ng/ml，VEGF-C100ng/ml和VEGF-C156S500ng/ml。此外，本試驗表明HMVE細胞中VEGFR-3誘導的p42/p44MAPK活化是通過蛋白激酶C誘導的。蛋白激酶C被GF109203X抑制、MEK1被PD98059抑制以及PI-3激酶被LY294002抑制對HMVE細胞中p42/p44MAPKThr202/Tyr204磷酸化、CREBSer133磷酸化以及AktSer473磷酸化的影響。所用生長因子濃度為VEGF1ng/ml，VEGF-C10ng/ml以及VEGF-C156S500ng/ml。
有絲分裂原-活化的蛋白激酶(MAPK)信號傳導途徑是參與生長因子-依賴性細胞存活的另一機制。本發明人發現當用VEGF-C刺激時，VEGFR-2和VEGFR-3介導的同時信號傳導導致HMVE細胞中持續性p42/p44MAPK活化。p42/p44MAPK活化通過Western印跡，用磷-Thr202/Tyr204-MAPK特異性抗體檢測，而CREB磷酸化用磷-Ser133特異性抗體檢測。
本發明人發現VEGFR-3被VEGF-C156S刺激後檢測到HMVE細胞中的MAPK活化。但是，被VEGFR-2配體VEGF和VEGF-C誘導的MAPK磷酸化在這些細胞中明顯更強。儘管在VEGF-C和VEGF刺激後MAPK活化峰值出現第10-20分鐘，但是VEGF誘導的活化比VEGF-C誘導的活化更加短暫，VEGF-C誘導的活化存續至少6小時。
MAP激酶的下遊，MAPK活化的激酶Rsks，已經證明其使轉錄因子CREB(cAMP反應元件-結合蛋白)在Ser133位磷酸化，這樣能通過提高原-存活基因的轉錄促進細胞存活(Bonni等，Science，28613581362，1999)。CREB磷酸化與p42/p44活化相關，在HMVECs被VEGF或VEGF-C刺激後檢測到了CREB磷酸化，但是VEGF-C156S刺激後未檢測到。儘管Akt也已被證實能使CREB磷酸化(Du andMontminy，J.Biol.Chem.，27332377-323791998)，但是用LY294002抑制Akt不影響CREB磷酸化。相反，PD98059或U0126抑制MEKI(MAP激酶激酶)，則抑制了VEGF-C誘導的CREB磷酸化，但是不抑制VEGF誘導的CREB磷酸化。
此外，本發明人發現VEGFR-3誘導的MAPK活化是通過PKC介導的。VEGF誘導的MAPK級聯反應的活化已被證實是通過蛋白激酶C(PKC)介導的，而不是經典Ras途徑介導的(Doanes等，Biochem.Biophys.Res.Commun.255545-548，1999；Takahashi等，Oncogene，182221-2230，1999；Yoshiji等，Cancer Res.，594413-4418，1999)。為了研究PKC抑制對VEGF-C及VEGF-C156S誘導的MAPK活化的影響，通過Western印跡用磷酸特異性抗體測量出實現最大程度p42/p44MAPK活化所需VEGF，VEGF-C和VEGF-C156S的最小濃度。這些條件下，GF109203X抑制PKC，這完全阻斷了VEGF，VEGF-C或VEGF-C156S誘導的p42/44MAPK磷酸化，以及VEGF或VEGF-C誘導的CREB磷酸化。而且，PD98059抑制MEKI導致VEGF-C刺激的CREB磷酸化減弱。令人奇怪的是，這種處理沒有抑制VEGF誘導的CREB磷酸化。相一致的是，最近一項試驗中，VEGF誘導的CREB磷酸化被證實是通過PKC和p38MAPK介導的，而不是通過p42/p44MAPK介導的。
實施例9VEGFR-3誘導內皮細胞遷移內皮細胞的遷移在脈管生成中發揮著重要作用，至少一些由VEGF誘導的遷移信號是通過PI3-激酶傳導的(Gille等，JBiol.Chem.，2763222-3230，2001；Gille等，EMBOJ.，194064-4073，2000；QiandClaesson-Welsh，Exp.CellRes.，263173-182，2001)。由於VEGFR-3缺陷型胚胎的死亡是由於無法完成脈管重塑(Dumont等，Science，282946-949，1998)，所以，VEGFR-3信號傳導是否也參與內皮細胞遷移這一問題值得進一步研究。Boyden槽試驗中將HMVE細胞在有不同VEGF存在的條件下孵育。VEGF誘導對細胞遷移的10-倍刺激，VEGF-C或VEGF-D與VEGF的效果近乎相當(圖5)。另外，VEGF-C156S也誘導了HMVE細胞遷移，但這被10-倍摩爾過量的可溶性VEGFR-3特異性阻斷(圖5，淺灰色的柱條)。這些結果表明通過VEGFR-3進行的信號傳導足以誘導內皮細胞的遷移。
儘管本發明的組合物和方法以優選實施方案的方式進行了描述，但是本領域技術人員顯然能夠認識到可對本發明所述方法進行改動而不脫離本發明的概念、實質和範圍。所有對於本領域技術人員來說顯而易見的類似替代及修飾都必然在本發明的實質、範圍和概念範疇之內。製備表達文庫的技術以及製備和分離重組肽的技術已為本領域技術人員熟知，並可與本發明結合使用。
權利要求
1.一種從含淋巴管內皮細胞的生物樣本中分離淋巴管內皮細胞的方法，該方法包括a)讓所述樣本與能優先識別淋巴管內皮細胞而非其它內皮細胞的抗體在該抗體能與淋巴管內皮細胞結合的條件下接觸，以及b)分離與所述抗體結合的淋巴管內皮細胞。
2.權利要求1的方法，其中所述抗體為具有針對VEGFR-3胞外區中表位的免疫學反應活性的抗體，VEGFR-3為淋巴管內皮細胞特異性標誌物。
3.權利要求1的方法，其中所述生物樣本來自人類患者。
4.權利要求1的方法，其中所述抗體固定在固相支持物上，所述生物樣本與該支持物接觸從而使得淋巴管內皮細胞與所述抗體結合。
5.權利要求1的方法，其中所述抗體用螢光標記物標記，所述淋巴管內皮細胞通過螢光激活細胞分選方法分離得到。
6.權利要求1的方法，其中所述抗體用磁性標記物標記，所述淋巴管內皮細胞通過磁性激活細胞分選方法分離得到。
7.權利要求1的方法，其中所述淋巴管內皮細胞用免疫組織化學方法分離得到。
8.權利要求1的方法，其中所述淋巴管內皮細胞用免疫層析方法分離得到。
9.權利要求1的方法，其中所述抗體為多克隆抗體。
10.權利要求1的方法，其中所述抗體為單克隆抗體。
11.權利要求1的方法，其中所述抗體為含有2E11D11的抗原結合片段的結合試劑。
12.權利要求11的方法，其中所述抗體能識別VEGFR-3蛋白上可被2E11D11識別的同一表位。
13.權利要求1的方法，其中所述抗體為2E11D11。
14.權利要求1的方法，其中所述抗體為抗podoplanin。
15.一種從微脈管內皮細胞樣本中分離血管內皮細胞的方法，該方法包括a)讓所述細胞與能優先結合淋巴管內皮細胞而非其它內皮細胞的抗體在該抗體能與淋巴管內皮細胞結合的條件下接觸，以及b)從未被所述抗體結合的微脈管細胞中取出已被所述抗體結合的淋巴管內皮細胞，其中所述的未被所述抗體結合的微脈管細胞包括基本不含淋巴管內皮細胞的血管內皮細胞群。
16.權利要求15的方法，其中所述抗體為具有針對VEGFR-3胞外區的免疫學反應活性的抗體。
17.根據一種方法分離得到的淋巴管內皮細胞群，該方法包括a)讓含淋巴管內皮細胞的生物樣本與能優先結合淋巴管內皮細胞而非其它內皮細胞的抗體在該抗體能與淋巴管內皮細胞結合的條件下接觸，以及b)分離與所述抗體結合的淋巴管內皮細胞。
18.權利要求17中的淋巴管內皮細胞群，其中所述抗體為具有針對VEGFR-3胞外區的免疫學反應活性的抗體。
19.權利要求17中的淋巴管內皮細胞群，其中所述細胞的生物樣本含有異源內皮細胞群。
20.權利要求17中的淋巴管內皮細胞群，其中所述細胞的生物樣本為微脈管內皮細胞群。
21.權利要求17中的淋巴管內皮細胞群，其中所述的淋巴管內皮細胞群基本未被血管內皮細胞汙染。
22.權利要求17的方法，該方法包括擴增所述淋巴管內皮細胞。
23.根據一種方法分離得到的血管內皮細胞群，該方法包括a)讓微脈管內皮細胞群與能優先結合淋巴管內皮細胞而非血管內皮細胞的抗體在該抗體能與淋巴管內皮細胞結合的條件下接觸，以及b)從未被所述抗體結合的微脈管細胞中取出已被所述抗體結合的淋巴管內皮細胞，其中所述的未被所述抗體結合的微脈管細胞包括基本不含淋巴管內皮細胞的血管內皮細胞群。
24.權利要求23中的血管細胞群，其中所述抗體為具有針對VEGFR-3胞外區的免疫學反應活性的抗體。
25.權利要求23中的血管內皮細胞群，其中所述方法進一步包括擴增所述的血管內皮細胞群。
26.一種基本不含其它汙染性內皮細胞的淋巴管內皮細胞群。
27.一種基本不含其它汙染性內皮細胞的血管內皮細胞群。
28.一種獲得基本富含淋巴管內皮細胞亞群的組合物的方法，該方法包括(a)獲得一種含微脈管內皮細胞的細胞源；(b)讓所述細胞與一種能夠優先結合淋巴管內皮細胞而非其它內皮細胞的單克隆抗體在確保抗體結合淋巴管內皮細胞的條件下接觸；(c)分離那些被所述單克隆抗體特異性結合的細胞，從而獲得基本富含淋巴管內皮細胞亞群的組合物。
29.權利要求28的方法，其中所述抗體為抗podoplanin抗體。
30.權利要求28的方法，其中所述抗體為2E11D11。
31.一種通過權利要求28、29或30所述方法獲得的基本富含淋巴管內皮細胞亞群的組合物。
32.一種改善淋巴管內皮細胞病症的方法，該方法包括將治療藥物靶向淋巴管內皮細胞，其中所述治療藥物是利用能夠優先結合淋巴管內皮細胞而非其它內皮細胞的抗體靶向所述細胞的，其中所述抗體是具有針對VEGFR-3胞外區免疫反應活性的抗體。
33.權利要求30的方法，其中所述病症選自淋巴瘤，遺傳性淋巴水腫，淋巴水腫，淋巴管瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管肌瘤病，淋巴管擴張，以及水囊狀淋巴管瘤。
34.一種改善淋巴管病症的方法，其中所述方法包括回體治療，包括a)從需要治療的患者獲得微脈管內皮細胞；b)讓所述微脈管內皮細胞與能夠優先結合淋巴管內皮細胞而非其它內皮細胞的抗體在確保該抗體結合淋巴管內皮細胞的條件下接觸；c)分離出被所述抗體結合的淋巴管內皮細胞；d)用一種表達構建體轉染該淋巴管內皮細胞，該構建體含有有效量的可操作地連接於一啟動子上的治療蛋白編碼核酸，所述有效量足以使所述蛋白在細胞中表達；(e)將經過轉染的細胞回輸入患者體內。
35.權利要求34的方法，其中所述抗體為具有針對VEGFR-3胞外區的免疫學反應活性的抗體。
36.一種促進淋巴管內皮細胞在培養中生長的方法，該方法包括a)按照權利要求1所述方法獲得淋巴管內皮細胞；b)用VEGFR-3配體刺激所述細胞；其中用VEGFR-3配體刺激所述細胞生長與無所述刺激存在相比能夠促進所述細胞在培養中的存活。
37.權利要求36的方法，其中所述VEGFR-3配體為VEGF-C、VEGF-C156S或VEGF-D。
38.權利要求36的方法，還包括用VEGFR-2配體刺激所述細胞。
39.權利要求36的方法，其中刺激所述細胞能夠保護細胞免遭凋亡。
40.權利要求36的方法，其中所述細胞的保護是通過活化Akt或p42/MAPK信號傳導分子實現的。
41.權利要求36的方法，其中所述刺激使得所述細胞能夠保持分化的內皮細胞的特性。
42.一種選擇性調控哺乳動物機體內淋巴管內皮細胞的方法，該方法包括a)按照權利要求1所述方法從哺乳動物機體分離淋巴管內皮細胞；b)讓上述分離的淋巴管內皮細胞與一種能調控淋巴管內皮細胞的物質接觸；以及c)將該淋巴管內皮細胞重新導回該機體。
43.權利要求42的方法，其中所述的接觸步驟包括將外源性多核苷酸導入所述細胞。
44.權利要求42的方法，其中所述機體患有特徵為淋巴管內皮細胞表達基因遺傳突變的病症，所述接觸包括將外源多核苷酸導入細胞以克服所述基因遺傳突變的影向。
45.權利要求44的方法，其中所述病症為遺傳性淋巴水腫。
46.一種在取自脊椎動物機體的組織中使淋巴管內皮細胞成像的方法，該方法包括下述步驟(a)讓疑似含有淋巴管內皮細胞的脊椎動物組織與一種含有能優先結合淋巴管內皮細胞而非其它內皮細胞的抗體的組合物在能確保該抗體結合淋巴管內皮細胞的條件下接觸；(b)檢測與所述組織中淋巴管內皮細胞結合的所述抗體；以及(c)通過鑑定被所述抗體結合的淋巴管內皮細胞，使淋巴內皮細胞在組織中成像，其中淋巴管內皮細胞與所述抗體的結合表明該組織中存在或居留有淋巴管內皮細胞。
47.權利要求46的方法，其中所述組織包括人體組織。
48.權利要求46的方法，還包括下述步驟在接觸步驟之後成像步驟之前，在能從所述組織中將未與該組織中淋巴管內皮細胞結合的抗體取出的條件下洗滌該組織。
49.權利要求46的方法，其中所述抗體為具有針對VEGFR-3胞外區的免疫學反應活性的抗體。
50.權利要求46的方法，其中所述抗體為抗podoplanin抗體。
51.權利要求46的方法，其中所述抗體還包括與其共價相連的可檢測標記物。
52.權利要求46的方法，該方法還包括下述步驟讓所述組織與第二種化合物接觸，這種化合物能特異性結合基本不出現在血管內皮中的淋巴管內皮標記物；以及檢測與所述組織中的細胞結合的第二種化合物；其中所述成像步驟包括鑑定被所述抗體以及第二種化合物這二者標記了的淋巴管，其中被所述抗體和第二種化合物這二者標記了的淋巴管與該組織中淋巴管內皮細胞的出現或居留相關。
53.權利要求52的方法，其中所述抗體為具有針對VEGFR-3胞外區的免疫學反應活性的抗體，所述第二種化合物為抗-podoplanin抗體。
54.一種篩查特徵在於淋巴管內皮細胞變化的疾病的方法，該方法包括(a)從疑似患有特徵為淋巴管內皮細胞變化疾病的脊椎動物機體獲取組織樣本；(b)將該組織樣本暴露於一種含有能優先結合淋巴管內皮細胞而非其它內皮細胞的抗體的組合物，所用條件允許該抗體結合該生物中的淋巴管內皮細胞；(c)洗滌該組織樣本；以及(d)通過檢測所述組織樣本中結合抗體的存在、量或分布來篩查所述疾病。
55.一種特異性檢測哺乳動物淋巴管內皮細胞的方法，包括下述步驟(a)向哺乳動物施用一種含有能優先結合淋巴管內皮細胞而非其它內皮細胞的抗體的組合物，所用條件允許該抗體結合淋巴管內皮細胞；以及(b)檢測結合了淋巴管內皮細胞的抗體，從而檢測所述生物中的淋巴管內皮細胞。
56.權利要求55的方法，還包括向該哺乳動物施用可特異性結合淋巴管內皮細胞標誌物的第二種化合物；其中所述的檢測步驟包括檢測與淋巴管內皮細胞結合的所述抗體和第二種化合物。
57.一種修飾淋巴管內皮細胞的方法，該方法包括a)獲取微脈管內皮細胞；b)讓所述微脈管內皮細胞與一種能優先結合淋巴管內皮細胞而非其它內皮細胞的抗體在該抗體能結合淋巴管內皮細胞的條件下接觸；c)分離被所述抗體結合的淋巴管內皮細胞，以及d)用表達構建體轉染該淋巴管內皮細胞，該構建體含有有效量的可操作地連接於一啟動子上的治療蛋白編碼核酸，所述有效量足以使所述蛋白在細胞中表達，其中所述轉染產生經修飾的淋巴管內皮細胞。
58.一種按照權利要求57所述方法製備的淋巴管內皮細胞。
全文摘要
本發明涉及從混合細胞群分離淋巴管內皮細胞的方法和組合物。更具體地說，本發明發現識別VEGFR－3胞外區的特定抗體可用於特異性分離基本不含其它汙染性非－淋巴管內皮細胞的淋巴管內皮細胞。本發明還公開了用於製備所述細胞以及使用所述細胞的方法和組合物。
文檔編號A61K48/00GK1555488SQ02817923
公開日2004年12月15日 申請日期2002年7月12日 優先權日2001年7月12日
發明者卡裡·阿利塔洛, 泰加·馬基嫩, 卡裡 阿利塔洛, 馬基嫩 申請人:路德維格癌症研究院, 利森蒂亞有限公司