檢測皮膚老化相關基因突變的方法及其專用引物與TaqMan-MGB探針的製作方法

2023-10-17 20:26:14

專利名稱：檢測皮膚老化相關基因突變的方法及其專用引物與TaqMan-MGB探針的製作方法
技術領域：
本發明涉及用分子生物學方法對突變鹼基進行定性、定量檢測的引物和探針。特別是涉及用實時螢光定量PCR(real-time fluorescent quantification PCR)技術對皮膚老化相關基因突變進行定性、定量檢測的引物和TaqMan-MGB探針。
背景技術：
目前，在已知的人類2萬至2. 5萬個基因中，有1500個基因對皮膚老化發揮關鍵作用。在人類衰老的過程中，有數百個基因會發生變異。人類皮膚老化有8種獨立的方式， 每種方式均由一組基因控制。一個人的皮膚是否會出現皺紋，不僅與生活方式有關，也與基因有關。每個人的皮膚老化狀況是不同的，這與每個人攜帶的遺傳信息不同有很大關係。 皮膚抗老化能力可以分為四個指標解毒能力；抗光老化能力；抗自由基能力；DNA損傷修復能力。在與皮膚老化相關的諸多基因中CYPIAl，CYP2E1，EPHXl，NQO1，GSTPl與皮膚的解毒能力相關；S0D3，CYBA，CAT，N0S3，P0N1，GPX1與皮膚抗自由基能力相關；XPA，XPD，XRCCl， MTHFR, hMLHl與NDA損傷修復能力相關；MMP1，MMP3，MMP9與皮膚抗光老化能力相關。通過檢測這些基因的突變情況就可以獲得皮膚老化的信息。目前，已報導的用於檢測皮膚老化相關基因突變的方法主要包括PCR直接測序和定性PCR等，這些方法普遍存在靈敏度低，特異性不高，費時費力且易汙染等缺點，使應用受到一定限制。實時螢光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入一對引物的同時加入一個特異性螢光探針，探針只與模板特異結合，其結合位點位於兩條引物之間，利用螢光信號積累實時監測整個PCR過程。目前常用的TaqMan螢光探針為寡核苷酸，其5』端標記有報告螢光基團，如FAM，VIC等，3』端標記有淬滅螢光基團，如TAMRA等。探針完整時，報告基團發出的螢光信號被淬滅基團吸收，故檢測不到螢光，當探針與靶序列配對時，PCR延伸反應聚合酶的5』 一 3』外切酶活性將探針酶切降解，是報告螢光基團和淬滅螢光基團分離，從而螢光檢測系統可以接收到螢光信號。每經過一個PCR循環，螢光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數增長的過程，每個循環結束後檢測一次螢光強度，整個反應結束後，便可得到一條擴增曲線，由已知濃度標準樣品的擴增曲線可以得到一條標準曲線，根據該標準曲線以及未知模板的擴增曲線可對未知模板進行定量分析。但是，實際上，探針較長使得兩端基團距離較遠，會導致螢光淬滅不徹底，而且，螢光基團也會產生不同波長的螢光，都會使得本底偏高。針對TaqMan探針螢光淬滅不徹底的問題，2000年美國ABI公司推出了一種新 TaqMan-MGB (TaqMan Minor Groove Binder Probe, TaqMan-MGB ), TaqMa-MGB ^ 針是帶有一個小溝結合物基團的寡核昔酸探針，工作原理與TaqMan探針相同，報告螢光基團連接在探針的5』端(如FAM、VIC等)，3』端標記有淬滅基團，不同的是淬滅基團為不發光的淬滅基團(Non-Fluorescent Quenoher，NFQ)，淬滅基團吸收報告基團的能量後並不發光，大大降低了本底信號的幹擾。此外，MGB探針的3』端還連接了一個二氫環化吲哚卟啉-三肽(dehydrocyclopyrroindole tripetide，DPI3)，DPI3 可摺疊進由探針末端 5_6bp 核營酸形成的小溝內。DPI3呈新月行，與B型DNA螺旋的淺深小溝一樣螺旋，主要通過範德華力穩定。TaqMan-MGB探針顯示了更強的序列特異性。可以大大穩定探針與模板的雜交， 升高探針Tm值，使較短的探針同樣能達到較高的Tm值一而短探針的螢光報告基團和淬滅基團的距離更近，淬滅效果更好，螢光背景更低，使得信噪比更高。總之，與傳統的TaqMan探針比較，TaqMan-MGB探針有以下優勢MGB增加了探針熔點溫度(Tm)，這樣可使探針較短，尤其適合富含A/T的序列，並且提高配對與非配對模板間的Tm值差異，可進行更多重的PCR ；提高信噪比，由於在探針的3 『端的淬滅基團為不發光的螢光基團，並且與報告基團在空間的位置更接近，實驗的結果更精確，解析度更高；且實驗步驟簡單，雜交的穩定性大大提高，重複性大大提高。目前尚沒有專門用於檢測皮膚老化相關基因突變的實時螢光定量PCR檢測技術。

發明內容
本發明的目的是提供針對皮膚老化相關基因突變進行定性、定量檢測的引物。為解決上述技術問題，本發明採取以下技術方案用於檢測CAT突變的引物，是由序列表中SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2組成的引物對。用於檢測CYBA突變的引物，是由序列表中SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4組成的引物對。用於檢測CYPlAl突變的引物，是由序列表中SEQ ID NO :5和SEQ ID N0:6組成的引物對。用於檢測CYP2E突變的引物，是由序列表中SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8組成的引物。用於檢測EPHX突變的引物，是由序列表中SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10組成的引物對。用於檢測GSTPl突變的引物，是由序列表中SEQID NO: 11和SEQ ID N0:12組成的引物對。用於檢測MTHFR突變的引物，是由序列表中SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 14組成的引物對。用於檢測N0S3突變的引物，是由序列表中SEQ ID N0:15和SEQ ID N0:16組成的引物對。用於檢測NQOl突變的引物，是由序列表中SEQ ID N0:17和SEQ ID N0:18組成的引物對。用於檢測PONl突變的引物，是由序列表中SEQ ID N0:19和SEQ ID N0:20組成的引物對。用於檢測S0D3突變的引物，是由序列表中SEQ ID N0:21和SEQ ID N0:22組成的引物對。
用於檢測XPA突變的引物，是由序列表中SEQ ID NO 23和SEQ ID NO 24組成的引物對。用於檢測XPD突變的引物，是由序列表中SEQ ID NO 25和SEQ ID NO 26組成的引物對。用於檢測XRCCl突變的引物，是由序列表中SEQ ID NO 27和SEQ ID NO 28組成的引物對與SEQ ID NO : 和SEQ ID NO 30組成的引物對。用於檢測MMP9突變的引物，是由序列表中SEQ ID N0:31和SEQ ID N0:32組成的引物對。用於檢測MMP3突變的引物，是由序列表中SEQ ID N0:33和SEQ ID而；34組成的引物對。用於檢測MMPl突變的引物，是由序列表中SEQ ID N0:35和SEQ ID N0:36組成的引物對。用於檢測hMLHl突變的引物，是由序列表中SEQ ID NO 37和SEQ ID NO 38組成的引物對。用於檢測GPXl突變的引物，是由序列表中SEQ ID N0:39和SEQ ID N0:40組成的引物對。本發明還提供了針對皮膚健康相關基因突變進行定性、定量檢測的TaqMan-MGB 探針。為解決上述技術問題，本發明採取以下技術方案用於檢測突變的CAT TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO 41和SEQ ID NO 42的DNA序列。用於檢測突變的CYBA TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:43和SEQ ID NO: 44的DNA序列。用於檢測突變的CYPlAl TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO 45和SEQ ID NO 46的DNA序列。用於檢測突變的CYP2E TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO 47和SEQ ID NO 48的DNA序列。用於檢測突變的EPHX TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:49和SEQ ID NO: 50的DNA序列。用於檢測突變的GSTPl TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO :51和SEQ ID NO 52的DNA序列。用於檢測突變的MTHFR TaciMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO 53禾口 SEQ ID NO 54的DNA序列。用於檢測突變的N0S3 TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:55和SEQ ID NO: 56的DNA序列。用於檢測突變的NQOl TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:57和SEQ ID NO: 58的DNA序列。用於檢測突變的PONl TaciMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:59禾口 SEQ ID NO: 60的DNA序列。
用於檢測突變的S0D3 TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:61和SEQ ID NO: 62的DNA序列。用於檢測突變的XPA TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO 63和SEQ ID NO 64的DNA序列。用於檢測突變的XPD TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO 65和SEQ ID NO 66的DNA序列。用於檢測突變的XRCC IiTaciMan-MGB 探針，是序列表中 SEQ ID NO :67，SEQ ID NO: 68，SEQ ID NO :69 和 SEQ ID NO 70 的 DNA 序列。用於檢測突變的MMP9 TaciMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:71禾口 SEQ ID NO: 72的DNA序列。用於檢測突變的MMP3 TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO 73的DNA序列。用於檢測突變的MMPl TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO 74的DNA序列。用於檢測突變的hMLHl TaciMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO 75禾P SEQ ID NO 76的DNA序列。用於檢測突變的GPXl TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:77和SEQ ID NO: 78的DNA序列。所述探針經過螢光標記，5』端標記有發光顏色不同的報告螢光基團，3』端不僅標記有不發光的淬滅集團，還連接有二氫環化吲哚卟啉-三肽。報告螢光基團為FAM或VIC， 不發光的淬滅基團為NFQ。本發明還提供了一種檢測皮膚健康相關基因突變的試劑盒，可包括上述用於檢測皮膚健康相關基因突變的引物又以及TaqMan-MGB探針。
具體實施例方式本發明結合具體實施例做進一步說明。應理解，這些實施例僅用於說明目的，而不用限制本發明範圍實施例1、用於對皮膚健康相關基因CAT突變進行檢測的引物和TaqMan-MGB探針的設計CAT基因序列的突變位點，用Primer Express Software 2. 0軟體設計PCR引物， 同時根據野生型CAT基因及突變型CAT基因的反向互補序列設計2條TaqMan-MGB探針，將 2條TaqMan-MGB探針的5』端分別標記報告螢光基因FAM(紅色螢光)和VIC(綠色螢光)， 3』端標記不發光淬滅基團，並連接DIP3。引物及TaqMan-MGB探針序列為引物5， -attttactcttcaacatagctttt-3，5， -attggcttctttaaacactggaga-3，TaqMan-MGB 探針5， -VIC-cttacctgggggtaaaatttg-MGB-3，5' -FAM-cttacctgggagtaaaatttg-MGB-3'實施例2、皮膚健康相關基因CAT突變的檢測1)樣本基因組DNA的獲取
8
用細胞裂解法提取口腔黏膜脫落細胞中的DNA，懸浮於Iml生理鹽水中，2000Xg 離心IOmin ；棄上清，每管加Iml生理鹽水重複洗滌一次，再2000 X g離心IOmin ；棄上清，每管加 400 μ 1 細胞裂解緩衝液(10mmol/L Tris-HCl, PH 8. 0 ；0. Imol EDTA, PH 8. 0 ；0. 5% SDS)，放在50°C水浴中溫育30分鐘；然後冷卻至室溫，加等體積的酚一氯仿一異戊醇(體積比25 24 1)，混勻，5000 Xg離心IOmin ；轉移上層水相到另一 Eppendorf管中，重複抽提一次；再轉移上層水相到另一 Eppendorf管中，加1/10體積的3M NaAc (pH5. 2)，混勻； 加入2. 5倍體積的95%冷乙醇，混勻，-20°C沉澱DNA 30分鐘；10000 Xg離心15分鐘，棄上清；加lml70%冷乙醇清洗沉澱，IOOOOXg離心分鐘，棄上清；37°C溫箱30分鐘烘乾；將DNA 沉澱溶於20 μ 1 TE緩衝液中，加1 μ 1 RNA酶，37°C 30分鐘，置於_20°C保存。2) PCR 擴增以步驟1)提取的DNA為模板，在實施例1所述引物及TaqMan-MGB探針的引導下， 用ABI7900實時螢光定量PCR儀(美國應用生物系統公司)進行PCR擴增，並按等位基因鑑別實驗操作步驟完成並分析，即依次進行讀取等位基因鑑別實驗PCR擴增前信號、執行擴增程序及讀取、分析擴增後信號。其中，PCR反應體系為2 XTaqMan通用PCR擴增預混試劑 (購自美國應用生物系統公司)，引物各900nM，螢光標記的2條I1aqMan-MGB探針各200nM， 150ng DNA。PCR反應條件為先95°C 10分鐘；然後95°C 15秒，60°C 1分鐘，共40個循環。3)得出結果用SDS軟體(美國應用生物系統公司)分析實驗結果。本次實驗共取100名受試
者樣本進行實驗，最終的基因型分布見下表。
受試者數AAAGGG
1OO51445序列表64124DNA人工序列1attttactct tcaacatagc tttt224DNA人工序列2
attggcttct ttaaacactggaga
3
24
DNA
人工序列


3
ccgagtggga gaggcccagcCgCg
4
24
DNA
人工序列


4
atagtaattc ctggtaaagggccc
5
24
DNA
人工序列


5
agaaggtgat tatctttggcatgg
6
24
DNA
人工序列


6
ttccacccg ttgcagcaggatagc
7
24
DNA
人工序列


7cttcatttct catcatattt tcta824DNA人工序列8ttctgttcta actggcaata tata924DNA人工序列9atctcctact ggcggaatga at tt1024DNA人工序列10tcggtctctc cctacataca gtac1124DNA人工序列11Bgccctggtg gacatggtga atga1224DNA人工序列
12ccaaccctgg tgcagatgct caca1324DNA人工序列<230〉13atgtgtcagc ctcaaagaaa agct1424DNA人工序列14ccgaagcagg gagctttgag gctg1524DNA人工序列15aggaaacggt cgcttcgacg tgct1624DNA人工序列16acgtggggtg ctccaggggc acct1724DNA人工序列
12


17
cttccaggat ttgaattcgggcgt
18
24
DNA
人工序列


18
cctcagagtg gcattctgcatttc
19
24
DNA
人工序列


19
tcacttggac tatagtagac3.3.C3.
20
24
DNA
人工序列


20
ttatgtgtgt atgttttaattgca
21
24
DNA
人工序列


21
tgggcgtgtg CgggCCSgggctct
22
24
DNA人工序列 22
tggccgccgc cgggtggggg CCgC 23 24 DNA 人工序列 23
ctaaagccgc cgcctccggc aaag
24
24
DNA
人工序列


24
ctggctcgcc tcggcgtgca gtgc
25 24
DNA
人工序列


25
gaaccgttta tggccccacc cgcc
26
24
DNA
人工序列


26
cctgtccctg ctcatcctgg agca
27
24
CN 102168128 A
說明書10/21頁
[0243 [0244 [0245 [0246 [0247 [0248 [0249 [0250 [0251 [0252 [0253 [0254 [0255 [0256 [0257 [0258 [0259 [0260 [0261 [0262 [0263 [0264 [0265 [0266 [0267 [0268 [0269 [0270 [0271 [0272 [0273 [0274 [0275 [0276 [0277 [0278 [0279 [0280 [0281
1權利要求
1.用於檢測CAT突變的引物，是由序列表中SEQID NO :1和SEQ ID NO :2組成的引物對。
2.用於檢測CYBA突變的引物，是由序列表中SEQID NO :3和SEQ ID NO :4組成的引物對。
3.用於檢測CYPlAl突變的引物，是由序列表中SEQID NO :5和SEQ ID NO :6組成的引物對。
4.用於檢測CYP2E突變的引物，是由序列表中SEQID NO :7和SEQ ID NO :8組成的引物對。
5.用於檢測EPHX突變的引物，是由序列表中SEQID NO :9和SEQ ID N0:10組成的引物對。
6.用於檢測GSTPl突變的引物，是由序列表中SEQID N0:11和SEQ ID N0:12組成的引物對。
7.用於檢測MTHFR突變的引物，是由序列表中SEQIDN0:13和SEQ ID N0:14組成的引物對。
8.用於檢測N0S3突變的引物，是由序列表中SEQID N0:15和SEQ ID N0:16組成的引物對。
9.用於檢測NQOl突變的引物，是由序列表中SEQID NO 17和SEQ ID NO 18組成的引物對。
10.用於檢測PONl突變的引物，是由序列表中SEQID N0:19和SEQ ID N0:20組成的引物對。
11.用於檢測S0D3突變的引物，是由序列表中SEQID NO :21和SEQ ID N0:22組成的引物對。
12.用於檢測XPA突變的引物，是由序列表中SEQID NO 23和SEQ ID NO 24組成的引物對。
13.用於檢測XPD突變的引物，是由序列表中SEQID NO 25和SEQ ID NO J6組成的引物對。
14.用於檢測XRCCl突變的引物，是由序列表中SEQID NO 27和SEQ ID NO J8組成的引物對與SEQ ID NO 29和SEQ ID NO 30組成的引物對。
15.用於檢測MMP9突變的引物，是由序列表中SEQID NO :31和SEQ ID N0:32組成的引物對。
16.用於檢測MMP3突變的引物，是由序列表中SEQID N0:33和SEQ ID而；34組成的引物對。
17.用於檢測MMPl突變的引物，是由序列表中SEQID NO 35和SEQ ID NO :36組成的引物對。
18.用於檢測hMLHl突變的引物，是由序列表中SEQID NO 37和SEQ ID NO 38組成的引物對。
19.用於檢測GPXl突變的引物，是由序列表中SEQID NO 39和SEQID NO :40組成的引物對。
20.用於檢測突變的CATTaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO :41禾口 SEQ ID NO:(42的DNA序列。
21.用於檢測突變的CYBATaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:43和SEQ ID NO: 44的DNA序列。
22.用於檢測突變的CYPlAlTaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO 45和SEQ ID NO 46的DNA序列。
23.用於檢測突變的CYP2EiTaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:47和SEQ ID NO: 48的DNA序列。
24.用於檢測突變的EPHXTaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:49和SEQ ID NO: 50的DNA序列。
25.用於檢測突變的GSTPlTaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:51和SEQ ID NO: 52的DNA序列。
26.用於檢測突變的MTHFRTaciMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO :53和SEQ ID NO: 54的DNA序列。
27.用於檢測突變的N0S3TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:55和SEQ ID N0: 56的DNA序列。
28.用於檢測突變的NQOlTaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:57和SEQ ID N0: 58的DNA序列。
29.用於檢測突變的PONlTaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:59和SEQ ID N0: 60的DNA序列。
30.用於檢測突變的S0D3TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:61禾口 SEQ ID N0: 62的DNA序列。
31.用於檢測突變的XPATaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO :63禾口 SEQ ID N0: 64的DNA序列。
32.用於檢測突變的XPDTaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO 65禾口 SEQ ID N0: 66的DNA序列。
33.用於檢測突變的XRCCITaqMan-MGB探針，是序列表中SEQID NO :67，SEQ ID N0: 68，SEQ ID NO :69 和 SEQ ID NO 70 的 DNA 序列。
34.用於檢測突變的MMP9TaciMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:71禾口 SEQ ID N0: 72的DNA序列。
35.用於檢測突變的MMP3TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO :73的DNA序列。
36.用於檢測突變的MMPlTaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO :74的DNA序列。
37.用於檢測突變的hMLHlTaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:75和SEQ ID N0: 76的DNA序列。
38.用於檢測突變的GPXlTaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:77和SEQ ID N0: 78的DNA序列。
39.根據權利要求20-38所述的DNA序列，其特徵在於5』端標記有發光顏色不同的報告螢光基團，3』端不僅標記有不發光的淬滅集團，還連接有二氫環化吲哚卟啉-三肽。
40.根據權利要求20-38所述的TaqMan-MGB探針，其特徵在於所述報告螢光基團為 FAM或VIC，不發光的淬滅基團為NFQ。
41. 一種檢測皮膚老化相關基因突變的試劑盒，包括權利要求1-19所述的引物以及權利要求20-38所述的TaqMan探針。
全文摘要
本發明公開了用於檢測皮膚老化相關基因突變的方法及其專用引物與TaqMan-MGB探針。用於檢測皮膚老化相關基因突變的引物，是由序列表中SEQ ID1～SEQ ID40共40條DNA序列組成。該TaqMan-MGB探針是序列表中SEQ ID41～SEQ ID78共38條DNA序列所述DNA序列5』端標記有發光顏色不同的報告螢光基團，3』端不僅標記有不發光的淬滅集團，還連接有二氫環化吲哚卟啉-三肽。本發明為皮膚老化的檢測、測試、分析、評估提供了一條快速、可靠、準確的新途徑。
文檔編號C12Q1/68GK102168128SQ20101011452
公開日2011年8月31日 申請日期2010年2月26日 優先權日2010年2月26日
發明者樓屹 申請人:上海金緣生物科技有限公司