小球藻突變株及其應用的製作方法

2023-10-18 03:49:34

專利名稱：小球藻突變株及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種經選育的用以生產單細胞油脂及生物柴油的小球藻突變株及其應用。
背景技術：
生物柴油突出的環保性和可再生性引起了世界發達國家尤其是資源貧乏國家的高度重視。生物柴油主要以生物脂為原料，經酯化反應轉化為脂肪酸甲酯而得。生物柴油產生的二氧化碳僅為傳統柴油的16%到40%，所產生的尾氣微粒排放量也降低了 30%左右，同時不需要對現有柴油發動機作任何改裝即可混合或單獨使用，也不需要改變能源的分配方式以及能源資源的市場，可直接作為民用燃料和內燃機燃料。生物柴油的生物脂原料主要來源於植物油脂、廢油和動物脂肪。其中以產脂微藻·作為原料製備生物柴油，具有其他產脂生物無法比擬的優勢(I)微藻很容易繁殖並且培養的時間短，一般高等植物需要生長好幾個月甚至幾年才能完成一代，微藻繁殖一代的時間僅為2-5天；(2)微藻不像高等植物那樣受氣候、季節變化的影響，可保持純培養，一年四季都可連續大規模生產，可保證原料供應充足；(3)微藻的生長繁殖是在水域中，不依靠土壤，可以在佔地有限的設備上進行而得到高產，不與糧爭地；(4)藻類所需酯化反應的條件相對較低，使生產成本降低，煉製工藝相對較為簡單。雖然產脂微藻是目前最好的生物柴油工業生產來源，但它的含油量不高，導致大規模培養微藻生產油脂成本昂貴，最終使得利用微藻製備生物柴油難以獲得經濟效益，產業化進程減緩。提高微藻細胞的油脂含量是目前降低成本的關鍵，有望從根本上解決生物柴油產業成本過高的瓶頸問題。因此，一直需要努力不懈的研究，以開發出產脂量及生物量更高的優良藻株，為單細胞油脂及生物柴油的工業生產提供具有競爭力的原材料。為了提高微藻細胞的產脂量，過去的研究主要集中在以下幾個方面(I)培養基優化；(2)培養過程控制；(3)代謝工程方法改造藻株；(4)誘變選育高脂突變株。前兩種方法雖然可在一定程度上有效促進藻細胞的產脂量，但提高的百分比數有限(通常提高20%以下)，仍無法滿足產業化規模開發的要求。代謝工程方法改造微藻是解決藻細胞脂含量低的根本方法，需要全面考慮藻株的整體代謝網絡的結構和調控特點，有待進一步進行研究。誘變育種方法研發成本低，選育過程簡單、耗時少，是提高微藻細胞產脂量的有效途徑。

發明內容
本發明目的在於提供一種小球藻突變株及其應用。為實現上述目的，本發明採用的技術方案為一種小球藻突變株小球藻突變株已於2011年5月27日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，編號為CGMCC No. 4917，分類名稱小球藻Chlorella kessleri0小球藻突變株的應用所述小球藻突變株為單細胞油脂高脂突變株，可應用於生物柴油生產工藝中。所述小球藻突變株的篩選過程I)將在Kuhl培養基中培養至對數生長期的小球藻(Chlorella kessleri)採用EMS化學誘變處理；將小球藻接種到Kuhl培養基中，在溫度為18-35 °C，轉速為100-200rpm,光照強度為20-150 μ mol πΓ2 s—1連續光照的搖床中振蕩培養至對數生長期，在培養至對數生長期的每毫升藻體內加入10-100 μ I EMS溶液，在黑 暗條件下以18-35°c處理15-180min，而後加入EMS溶液等體積的硫代硫酸鈉溶液終止誘變反應；所述Kuhl培養基為10g/L葡萄糖、lg/L硝酸鉀、89mg/L十二水磷酸氫二鈉、621mg/L 二水磷酸二氫鈉、246mg/L七水硫酸鎂、9. 3mg/LEDTA、6. 9mg/L七水硫酸亞鐵、
14.7mg/L 二水氯化鈣、O. 29mg/L七水硫酸鋅、O. 17mg/L 一水硫酸錳、O. 06mg/L硼酸、O. 002mg/L五水硫酸銅、(λ 012mg/L四水鑰酸銨，pH 6. 5。2)將步驟I)誘變處理後藻體轉接培養在高脂定向篩選平板上，篩選出體積增大的單細胞藻體進行擴種繼代培養；即將誘變處理後藻體洗滌後觀測其細胞濃度，根據細胞數將藻體稀釋IO3-IO6倍，分別塗布到高脂定向篩選平板上，置於18-35°c的程控恆溫培養箱中無光靜置培養，篩選單細胞體積增大的藻體於Kuhl培養基中,在溫度為18-35°C,轉速為100-200rpm,光照強度為20-150 μ mol m_2 s—1連續光照的搖床中振蕩擴種繼代培養至對數生長期。3)將上述擴種繼代培養至對數生長期的藻體進行誘導培養6-20天，待用；將擴種繼代培養至對數生長期的藻體中加入50%葡萄糖母液(取250g葡萄糖溶於水中至總體積500ml)至終濃度為30-60g/L，誘導培養6-20天，使藻細胞內脂的大量合成，而後用去離子水3000g低溫離心洗滌，去除上清，藻泥沉澱進行真空冷凍乾燥處理24h，得到幹藻粉。4)取步驟3)藻體利用氣相色譜(GC)測定突變株與野生株的脂含量，突變株的脂含量與野生株的脂含量的比值大於110%，即突變株為單細胞油脂高脂突變株；將誘導培養後藻體中加入甲苯、1%硫酸一甲醇(體積比硫酸甲醇=I 99)和十九烷酸(C19:0)內標液混合均勻後，置於50-60°C振蕩水浴過夜；取出，冷卻後，加入5% NaCl水溶液和正己烷，混合均勻後，離心收集上層液體，向收集的上層液中加入2% KHCO3水溶液混合均勻，漩渦儀上混勻離心收集上層液體，用氮氣吹乾溶劑後，用正己烷定容，利用氣相色譜(GC)測定突變株中脂含量。所述氣相色譜條件為採用分流模式，以氮氣為載氣；進樣口溫度為2500C ；FID檢測器溫度為260°C ;柱溫箱的溫度為以2. 5°C /min的升溫速率從140°C升至240。。。經上述技術方案選育獲得的高脂突變株小球藻(Chlorella keSSleri)Al，已於2011年5月27日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，編號為CGMCC No. 4917,分類名稱小球藻 Chlorella kessleri。所述的小球藻(Chlorella kessleri)Al CGMCC No. 4917具有典型的綠藻門、綠藻綱、綠球藻目、小球藻科、小球藻屬的特徵性結構。在無菌BG-II、BBM, Basal、CZ-Ml、Kuhl、KMl等培養液中、適宜條件下培養時，其營養細胞大小約5-10 μ m，球形，綠色，生長快速。所述的小球藻(Chlorella kessleri)Al CGMCC No. 4917生理生化特徵如下I.在BG-II、BBM、Basal、CZ-MU Kuhl、KMl等自養培養基和異養培養基中均能生長，也可以混養培養。混養時生長最好。混養時最適的碳源是葡萄糖，最好的氮源是硝酸鹽。較低的溶解氧有利於自養生長，而飽和的溶解氧有利於異養生長。適量的鎂能改善其生長。2.營養生長時以孢子繁殖的方式進行細胞增殖，比生長速率為O. 025-0. 065^1,代時為27. 72-10. 66h ;生長最適pH範圍4_10 ;生長最適宜溫度18_35°C ;生長最適光照強度為20-150 μ mol πΓ2 s4 ;搖床振蕩培養時的最適轉速100-200rpm。3.在氮限制、磷或硫缺乏、鹽脅 迫等不利環境條件下，補給足夠的碳源，Chlorellakessleri Al CGMCC No. 4917細胞迅速變大，脂合成速度加快，脂產量顯著提高，產脂率可達2. 93mg g—1 h—1,高達Chlorella kessleri野生株產脂率的2· 14倍。碳水化合物含量也相應增加，但總蛋白含量下降。4.細胞中主要色素為葉綠素a、b，新黃質，紫黃質，環氧玉米黃質，玉米黃質，葉黃素以及β_胡蘿蔔素。在高脂誘導、合成過程中，細胞的色素組成不變，各色素的比例隨誘導及培養條件的不同而有所變化，但色素總量呈下降趨勢。5.在高脂誘導、合成過程中，細胞的呼吸速率上升，光合速率下降。6.細胞中脂的主要成分C16、C18系飽和和不飽和脂肪酸，為肉豆蘧酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸中的一種或幾種。本發明以小球藻的野生株係為材料，採用化學誘變，脂合成抑制劑篩選的誘變育種方法，結果得到了一個產脂率高達出發株2. 14倍、生理生化特性穩定、具有穩定遺傳性能的小球藻優良突變株。本發明所具有的優點本發明與現有的高脂微藻突變株選育方法區別在於，從誘變處理後的藻株中，直接選育耐受脂合成抑制劑的微藻突變株，因而避免了低脂突變株和脂含量變化不顯著的突變株的幹擾，實現了高脂突變株的定向篩選，避免了盲目性，因此大大提高了選育效率，減少了無用工作量，節約了研發成本和研發時間。
具體實施例方式以下結合實施例為本發明作進一步描述。第一步、在無菌操作臺上，挑取固體培養基上生長狀態良好的原始野生株小球藻(Chlorella kessleri)藻落，接種到含IOml無菌Kuhl培養基的50ml三角瓶中，在溫度為25°C,轉速為150rpm,光照強度為ΙΟΟμηιοΙ πΓ2 s4連續光照的搖床中振蕩培養。Kuhl培養基配方10g/L葡萄糖、lg/L硝酸鉀、89mg/L十二水磷酸氫二鈉、621mg/L 二水磷酸二氫鈉、246mg/L七水硫酸鎂、9. 3mg/L EDTA、6. 9mg/L七水硫酸亞鐵、14. 7mg/L 二水氯化鈣、0. 29mg/L七水硫酸鋅、0. 17mg/L 一水硫酸錳、0. 06mg/L硼酸、0. 002mg/L五水硫酸銅、0. 012mg/L四水鑰酸銨，加水至總體積1000ml, pH 6. 5。第二步、取第一步中生長至指數期的藻液，進行EMS化學誘變處理。在黑暗無菌條件下，取3ml藻液到有蓋的無菌玻璃試管中，加入300μ I EMS溶液(IM)，充分混勻。25°C處理30min，以處理Omin作為空白對照。加入EMS溶液等體積無菌現配的硫代硫酸鈉溶液(10%, w/v)終止誘變反應。第三步、將第二步中誘變處理完畢的藻細胞分別用新鮮無菌Kuhl培養基離心(3000rpm, IOmin)清洗兩次，收集沉澱將其懸浮在3ml新鮮無菌Kuhl培養基中，4°C避光存放。第四步、觀測第三步中懸浮液的細胞濃度，而後將第三步中懸浮液稀釋至空白對照組細胞密度，空白對照組細胞密度約為lX103cellS/ml，取ΙΟΟμ I稀釋的藻液塗布高脂定向篩選平板，將塗布了藻液的500個平板置於25°C的程控恆溫培養箱中無光靜置培養。所述配製的高脂定向篩選平板為，配製含有15g/L瓊脂的高起始C/N比(30g/L葡萄糖、lg/L硝酸鉀)的Kuhl培養基，於120°C下高壓蒸汽滅菌20分鐘後冷卻至50°C，加入過濾滅菌後的脂合成抑制劑淺藍菌素(Cerulenin)至終濃度為200 μ M，輕輕搖動混勻，倒製成高脂定向篩選平板。第五步、將能夠在第四步中生長的菌株與對照(原始小球藻)相比單克隆藻明顯增大的單克隆藻落挑出，懸浮到裝有3ml新鮮無菌Kuhl液體培養基的玻璃試管中，在溫度為25°C,轉速為150rpm,光照強度為ΙΟΟμηιοΙ πΓ2 s4連續光照的搖床中振蕩培養,進行擴種繼代培養；第六步、將第五步中生長至指數期的藻液中加入已滅菌的50%葡萄糖母液(取250g葡萄糖溶於水中至總體積500ml)至終濃度為50g/L，誘導藻細胞內脂的大量合成。 第七步、在第六步中誘導培養6天時,取50ml藻液,用去離子水3000rpm低溫離心洗滌2次，去除上清，藻泥沉澱進行真空冷凍乾燥處理24h，得到幹藻粉。第八步、稱取第七步中所述幹藻粉20mg，加入Iml甲苯、2ml I %硫酸一甲醇(體積比為硫酸甲醇=1 99)、0.8ml十九烷酸(C19:0)內標液，漩渦儀上混勻後，置於50°C振蕩水浴過夜。取出，冷卻後，加入5ml 5% NaCl水溶液、3ml正己烷，漩渦儀上混勻，離心收集上層液體，重複多次直至提取完全，向收集的上層液中加入6ml 2% KHCO3水溶液，漩渦儀上混勻，離心收集上層液體，用氮吹儀吹乾溶劑後，用正己烷定容至lml，去除雜質後轉移入色譜進樣瓶中，4°C保存。將樣品中的有效脂肪酸提取並甲酯化以便利用氣相色譜(GC)測定。利用氣相色譜(GC)法測定第八步所述提取液。色譜條件為DB_23毛細管氣相色譜柱(30mX0. 25mmX0. 25 μ m);氮氣為載氣；採用分流模式，進樣體積為I μ I ;進樣口溫度為250°C ；FID檢測器溫度為260°C ;柱溫箱的溫度為以2. 5°C /min的升溫速率從140°C升至240°C。通過比較脂肪酸甲酯與可信標準的停留時間來識別脂肪酸甲酯，並且通過比較脂肪酸甲酯與內標的峰面積對脂肪酸甲酯進行量化(參見表I)。本實施例以小球藻(Chlorella kessleri)為原始株,經化學誘變劑EMS處理,高脂定向篩選平板初篩，獲得80個高脂突變株新品系，經氣相色譜法復篩，分析結果顯示，這80個新品系確實全部為高脂突變株，其中突變株的脂含量與野生株的脂含量的比值為110-150%的佔 9%，為 150-200%的佔 43%，200% 以上的佔 48%。其中的一個新品系小球藻(Chlorella kessleri)Al,其目的產物脂的產脂率高達野生株的2. 14倍，而生長狀況與出發株一致，是一個理想的優良突變株，可應用於單細胞油脂及生物柴油的工業生產有一定的優勢。該高脂突變株新品繫於2011年5月27日提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，編號為CGMCC No. 4917,該藻株命名為小球藻(Chlorella kessleri) Al CGMCC No. 4917。小球藻(Chlorellakessleri)Al CGMCC No. 4917藻株的脂肪酸組成、各脂肪酸佔總脂肪酸的比例、以及產脂率如下表I :表I突變株Al誘導脂合成六天時脂肪酸組成及含量與野生株的比較。
權利要求
1.一種小球藻突變株，其特徵在於小球藻突變株已於2011年5月27日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，編號為CGMCC No. 4917。
2.—種權利要求I所述的小球藻突變株的應用，其特徵在於所述小球藻突變株為單細胞油脂高脂突變株，可應用於生物柴油生產工藝中。
3.按權利要求2所述的小球藻突變株的應用，其特徵在於所述小球藻突變株的篩選過程 1)將在Kuhl培養基中培養至對數生長期的小球藻(Chlorellakessleri)採用EMS化學誘變處理； 2)將步驟I)誘變處理後藻體轉接培養在高脂定向篩選平板上，篩選出體積增大的單細胞藻體進行擴種繼代培養； 3)將上述擴種繼代培養至對數生長期的藻體進行誘導培養6-20天，待用； 4)取步驟3)藻體利用氣相色譜(GC)測定其脂含量以及測定野生株的脂含量，突變株的脂含量與野生株的脂含量的比值大於110%，即突變株為單細胞油脂高脂突變株；其高脂突變株已於2011年5月27日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，編號為 CGMCC No. 4917。
4.按權利要求3所述的小球藻突變株的應用，其特徵在於所述步驟I)將小球藻接種到Kuhl培養基中，在溫度為18-35°C，轉速為100-200rpm，光照強度為20-150 μ mol πΓ2s-1連續光照的搖床中振蕩培養至對數生長期，在培養至對數生長期的每毫升藻體內加入10-100 μ I EMS溶液，在黑暗條件下以18-35°c處理15-180min，而後加入EMS溶液等體積的硫代硫酸鈉溶液終止誘變反應； 所述Kuhl培養基為10g/L葡萄糖、lg/L硝酸鉀、89mg/L十二水磷酸氫二鈉、621mg/L 二水磷酸二氫鈉、246mg/L七水硫酸鎂、9. 3mg/LEDTA、6. 9mg/L七水硫酸亞鐵、14. 7mg/L水氯化鈣、O. 29mg/L七水硫酸鋅、O. 17mg/L 一水硫酸錳、O. 06mg/L硼酸、O. 002mg/L五水硫酸銅、O. 012mg/L四水鑰酸銨，pH 6. 5。
5.按權利要求3所述的小球藻突變株的應用，其特徵在於將誘變處理後藻體洗滌後塗布到高脂定向篩選平板上，置於18-35°C的恆溫培養箱中無光靜置培養，篩選單細胞體積增大的藻體於Kuhl培養基中，在溫度為18-35°C，轉速為100-200rpm，光照強度為20-150 μ mol m_2 s—1連續光照的搖床中振蕩擴種繼代培養至對數生長期。
6.按權利要求3所述的小球藻突變株的應用，其特徵在於將擴種繼代培養至對數生長期的藻體中加入50%葡萄糖母液至終濃度為30-60g/L，誘導培養6-20天，使藻細胞內脂的大量合成，而後用去離子水3000g低溫離心洗滌，去除上清，藻泥沉澱進行真空冷凍乾燥處理24h，得到幹藻粉。
7.按權利要求3或6所述的小球藻突變株的應用，其特徵在於將誘導培養後藻體中加入甲苯、1%硫酸一甲醇和十九烷酸(C19:0)內標液混合均勻後，置於50-60°C振蕩水浴過夜；取出，冷卻後，加入5% NaCl水溶液和正己烷，混合均勻後，離心收集上層液體，向收集的上層液中加入2% KHCO3水溶液混合均勻，漩渦儀上混勻離心收集上層液體，用氮氣吹乾溶劑後，用正己烷定容，利用氣相色譜(GC)測定突變株中脂含量。
8.按權利要求3所述的小球藻突變株的應用，其特徵在於所述氣相色譜條件為採用分流模式，以氮氣為載氣；進樣口溫度為250°C ；FID檢測器溫度為260°C ;柱溫箱的溫度為以2. 5°C /min 的升溫速率從140°C升至240°C。
全文摘要
本發明涉及一種經選育的用以生產單細胞油脂及生物柴油的小球藻突變株及其應用。所述小球藻突變株已於2011年5月27日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，編號為CGMCC No.4917。所述小球藻突變株為單細胞油脂高脂突變株，可應用於生物柴油生產工藝中。
文檔編號C12N15/01GK102888347SQ201110218479
公開日2013年1月23日 申請日期2011年7月22日 優先權日2011年7月22日
發明者王豔, 秦松 申請人:中國科學院煙臺海岸帶研究所