聚乙二醇修飾的脂質化合物及其應用的製作方法

2023-10-21 07:28:42

專利名稱：聚乙二醇修飾的脂質化合物及其應用的製作方法
對相關申請的交叉引用本專利申請要求2003年9月15日提交的美國專利申請號60/503,239的利益，並且與美國專利申請號10/893,121相關，所述美國專利申請號10/893,121要求提交於2003年7月16日的美國臨時專利申請號60/488,144，提交於2003年9月15日的60/503,279，和提交於2003年12月11日的60/529,406的利益，出於所有目的將其上述每個申請的教導完整結合於此作為參考。
背景技術：
有效和安全的基因遞送系統是將在臨床上有用的基因治療所需要的。病毒載體是相對有效的基因遞送系統，但是遭遇到多種局限，諸如逆轉成野生型的可能以及免疫應答問題。結果，非病毒基因遞送系統正在受到越來越多的關注(Worgall，et al.，Human Gene Therapy 837-44(1997)；Peeters，et al.，Human Gene Therapy 71693-1699(1996)；Yei，et al.，Gene Therapy1192-200(1994)；Hope，et al.，Molecular Membrane Biology 151-14(1998))。質粒DNA-陽離子脂質體複合物是目前最常用的非病毒基因遞送載體(Felgner，Scientific American 276102-106(1997)；Chonn，et al.，CurrentOpinion in Biotechnology 6698-708(1995))。然而，複合物較大，系統很不確定，其不適於全身應用並可激發相當大的毒性副作用(Harrison，et al.，Biotechniques 19816-823(1995)；Huang，et al.，Nature Biotechnology15620-621(1997)；Templeton，et al.，Nature Biotechnology 15647-652(1997)；Hofland，et al.，Pharmaceutical Research 14742-749(1997))。
最近的工作已經顯示質粒DNA可被包封在小的(～70nm直徑)「穩定的質粒-脂質顆粒」(SPLP)中，其由包封在雙層脂質載體中的單一質粒組成(Wheeler，et al.Gene Therapy 6271(1999))。這些SPLPs典型地包含「融合性的(fusogenic)」脂質二油醯磷脂醯-乙醇胺(DOPE)，低水平的陽離子脂質，並在存在聚(乙二醇)(PEG)包衣時在水性介質中是穩定的。SPLP具有全身應用，因為在靜脈內(i.v.)注射後，它們顯示延長的循環生存期，由於在這些區域增加的血管通透性，它們優先聚集在遠側腫瘤位點，並可在這些腫瘤位點介導轉基因表達。在i.v.注射包含螢光素酶標記基因的SPLP後，在腫瘤位點觀察到的轉基因表達的水平優於使用質粒DNA-陽離子脂質體複合物(lipoplexes)或裸DNA可獲得的水平。儘管如此，對於一些應用中的理想治療益處，可能需要提高水平的表達(見，例如，Monck，et al.，J.DrugTarg.7439-452(2000))。
典型地，脂質體和SPLPs都包含PEG-脂質衍生物。典型地，通過將二醯基甘油磷脂的極性頭部基團用PEG進行衍生化來製備PEG-脂質，所述二醯基甘油磷脂諸如二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺(DSPE)。這些磷脂通常包含兩條通過酯鍵與甘油的1-位和2-位結合的脂肪醯基鏈。不幸的是，在酸性或鹼性條件下，這些醯基基團易對於裂解敏感。這些得到的水解產物，諸如溶血磷脂和甘油磷酸酯的類似物，沒有保持與脂質體或SPLP的雙層結構的相關性。不幸的是，這些離解會削弱脂質體或SPLP結構的完整性，導致生物活性劑或藥物從脂質體或SPLP的顯著漏損並導致貯存過程中的不穩定，因此縮短脂質體或SPLP產物的貯存期限。此外，這些水解產物，諸如PEG-溶血磷脂從脂質體或SPLP的損失否定了否則可從PEG-磷脂的存在獲得的益處。
脂質的穩定性在脂質體或SPLP藥物遞送系統的開發中是重要的。因此，理想的是開發對水解較不敏感的PEG-脂質，由此增加脂質體或SPLP的循環壽命。本發明解決了這個和其它的需要。
發明概述本發明提供新的聚乙二醇-二烷氧基丙基(PEG-DAA)綴合物，與常用的PEG-脂質綴合物(諸如PEG-PE綴合物)相比，其具有增加的穩定性。本發明的PEG-修飾的二烷基丙基綴合物通過增加所述脂質體，SNALP，或SPLP的循環壽命或使用期限來提高脂質體以及核酸-脂質顆粒(例如，SNALPs和SPLPs)的性質。事實上，已經令人驚奇地發現，本發明的PEG-DAA綴合物比其它常用的PEG-脂質衍生物更穩定。作為增加的穩定性的結果，本發明的PEG-DAA綴合物增加了脂質體或SPLP的循環壽命或使用期限並還減少了由於使用其它PEG-脂質綴合物時脂質體雙層或SPLP的脂肪醯基鏈的水解所導致的漏損。
本發明提供新的具有如下結構的式I的PEG-DAA綴合物 在上述式I中，「R1和R2」被獨立地選擇並是具有約10-約20個碳原子的烷基基團；PEG是聚乙二醇；並且L是接頭部分(例如，包含非酯(non-ester)的接頭部分或包含酯的接頭部分)。適合的烷基基團包括，但不限於，月桂基(C12)，肉豆蔻基(C14)，棕櫚基(C16)，硬脂基(C18)和二十碳烷基(C20)。在一個優選的實施方案中；R1和R2是相同的，即它們都是肉豆蔻基(C14)或都是棕櫚基(C16)或都是硬脂基(C18)。在一個優選的實施方案中，所述烷基基團是飽和的。
在上述的式I中，「PEG」是聚乙二醇，其具有在約550道爾頓到約10,000道爾頓範圍內的平均分子量，更優選約750道爾頓到約5,000道爾頓範圍內的分子量，更優選約1,000道爾頓到約5,000道爾頓範圍內的分子量，更優選約1,500道爾頓到約3,000道爾頓範圍內的分子量，並且甚至更優選約2,000道爾頓，或約750道爾頓分子量。所述PEG可以任選地被烷基，烷氧基，醯基或芳基取代。在一個優選的實施方案中，末端羥基基團被甲氧基或甲基基團所取代。PEG可以與脂質直接綴合或可以通過接頭部分與脂質連接。可以使用任何適合於將PEG與脂質偶聯的接頭部分，其包括，例如包含非酯的接頭部分和包含酯的接頭部分。在一個優選的實施方案中，所述接頭部分是包含非酯的接頭部分。用於本文時，術語「包含非酯的接頭部分」指不包含羧酸酯鍵(-OC(O)-)的接頭部分。適合的包含非酯的接頭部分包括，但不限於，醯氨基(-C(O)NH-)、氨基(-NR-)、羰基(-C(O)-)、氨基甲酸酯(-NHC(O)O-)，脲(-NHC(O)NH-)，二硫化物(-S-S-)，醚(-O-)，琥珀醯(-(O)CCH2CH2C(O)-)，琥珀醯胺(-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-)，醚，二硫化物，等及其組合(諸如包含氨基甲酸酯接頭部分和醯氨基接頭部分的接頭)。在一個優選的實施方案中，將氨基甲酸酯接頭用於將PEG偶聯於脂質。
在其它實施方案中，包含酯的接頭部分被用於將PEG偶聯於脂質。適合的包含酯的接頭部分包括，例如，碳酸酯(-OC(O)O-)，琥珀一醯，磷酸酯(-O-(O)POH-O-)，磺酸酯及其組合。
在上述的式I中，「L」是包含非酯的接頭部分或包含酯的接頭部分。在一個優選的實施方案中，L是包含非酯的接頭部分。適合的包含非酯的接頭包括，但不限於，醯氨基接頭部分，氨基接頭部分，羰基接頭部分，氨基甲酸酯接頭部分，脲接頭部分，醚接頭部分，二硫化物接頭部分，琥珀醯胺接頭部分及其組合。在一個優選的實施方案中，包含非酯的接頭部分是氨基甲酸酯接頭部分(即，PEG-C-DAA綴合物)。在另一個優選的實施方案中，包含非酯的接頭部分是醯氨基接頭部分(即，PEG-A-DAA綴合物)。在一個優選的實施方案中，包含非酯的接頭部分是琥珀醯胺基接頭部分(即，PEG-S-DAA綴合物)。
在另一個方面，本發明提供包含式I的聚乙二醇-二烷氧基丙基(PEG-DAA)綴合物的脂質體。所述脂質體還典型地包括陽離子脂質和非陽離子脂質。在一些方面，所述脂質體還包括甾醇(例如，膽甾醇)。所述脂質體可以是空的或，備選地，脂質體還可以包含一種或多種生物活性劑(例如，本文所述的治療性產物)。適合的生物活性劑包括，但不限於，抗腫瘤藥，抗生素，免疫調節劑，消炎藥和作用在中樞神經系統上的藥物。類似地，適合的生物活性劑包括，但不限於，肽，蛋白質和核酸。
在另一個方面，本發明提供一種將生物活性劑遞送給細胞的方法，所述方法包括使細胞與包含式I的PEG-DAA綴合物的脂質體接觸，其中所述生物活性劑被包封在脂質體中。類似地，在另一方面，本發明提供一種將生物活性劑遞送給患者的方法，所述方法包括將包含式I的PEG-DAA綴合物的脂質體施用給患者，其中所述生物活性劑被包封在脂質體中。
在另一方面，本發明提供核酸-脂質顆粒，所述核酸-脂質顆粒包括核酸；陽離子脂質；非陽離子脂質；和式I的PEG-DAA。在一些方面，所述核酸-脂質顆粒還包括甾醇(例如，膽甾醇)。
在另一方面，本發明提供一種將核酸引入細胞的方法，所述方法包括使所述細胞與核酸-脂質顆粒接觸，所述核酸-脂質顆粒包括陽離子脂質，非陽離子脂質，式I的PEG-DAA綴合物，和核酸。
本發明的其它特點，目的和優勢及其優選實施方案將通過下面的詳細描述、實施例、權利要求和附圖而變得顯而易見。
附圖簡述

圖1舉例說明兩種示範性PEG-二烷氧基丙基衍生物，即N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)氨基甲酸酯PEG2000甲基醚(即，PEG-C-DMA)，N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)醯胺PEG2000甲基醚(即，PEG-A-DMA)，和N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)琥珀醯胺PEG2000甲基醚(即，PEG-S-DMA)的結構。
圖2舉例說明顯示包含PEG-DAA綴合物，PEG-DAG綴合物，PEG-神經醯胺綴合物，和PEG-DSPE綴合物的脂質體的穩定性的數據。
圖3舉例說明顯示在IV施用包含PEG-DAA綴合物，PEG-DAG綴合物，和PEG-神經醯胺綴合物的SPLP後，在腫瘤中的螢光素酶基因表達的數據。
圖4舉例說明顯示由包含PEG-DAA綴合物，PEG-DAG綴合物，PEG-神經醯胺綴合物，和PEG-DSPE綴合物的SPLP進行體內轉染的數據。
圖5舉例說明顯示在靜脈內施用包含PEG-DAA綴合物和PEG-DAG綴合物的SPLP 48小時後，在腫瘤中的螢光素酶基因表達的數據。
圖6舉例說明顯示靜脈內施用包含PEG-DAA綴合物和PEG-DAG綴合物的SPLP後，在肝，肺，脾，心臟和腫瘤中的螢光素酶基因表達的數據。
圖7舉例說明顯示在靜脈內施用包含PEG-DAA綴合物和PEG-DAG綴合物的SPLP或pSPLP 48小時後，顯示在腫瘤中的螢光素酶基因表達的數據。
圖8舉例說明顯示由包含PEG-DAA綴合物和PEG-DAG綴合物的SPLP進行的體內轉染的數據。
圖9舉例說明體內數據，所述體內數據證明在用SPLPs和SNALPs處理的具有Neuro-2a腫瘤的雄性A/J小鼠中的螢光素酶表達的沉默，所述SPLPs包括PEG-DAA綴合物並包含在CMV啟動子的控制下編碼螢光素酶的質粒，所述SNALPs包括PEG-DAA綴合物並包含抗螢光素酶siRNA。
圖10舉例說明體內數據，所述體內數據證明在用SPLPs和SNALPs處理的具有Neuro-2a腫瘤的雄性A/J小鼠中的螢光素酶表達的沉默，所述SPLPs包括PEG-DAA綴合物並包含在CMV啟動子的控制下編碼螢光素酶的質粒，所述SNALPs包括PEG-DAA綴合物並包含抗螢光素酶siRNA。
圖11舉例說明體內數據，所述體內數據證明在用SPLPs和SNALPs處理的具有Neuro-2a腫瘤的雄性A/J小鼠中的螢光素酶表達的沉默，所述SPLPs包括PEG-DAA綴合物並包含在CMV啟動子的控制下編碼螢光素酶的質粒，所述SNALPs包括PEG-DAA綴合物並包含抗螢光素酶siRNA。
圖12舉例說明體內數據，所述體內數據證明在用SPLPs和SNALPs處理的具有Neuro-2a腫瘤的雄性A/J小鼠中的螢光素酶表達的沉默，所述SPLPs包括PEG-DAA綴合物並包含在CMV啟動子的控制下編碼螢光素酶的質粒，所述SNALPs包括PEG-DAA綴合物並包含抗螢光素酶siRNA。
圖13舉例說明體內數據，所述體內數據證明在用SPLPs和SNALPs處理的具有Neuro-2a腫瘤的雄性A/J小鼠中的螢光素酶表達的沉默，所述SPLPs包括PEG-DAA綴合物並包含在CMV啟動子的控制下編碼螢光素酶的質粒，所述SNALPs包括PEG-DAA綴合物並包含抗螢光素酶siRNA。
圖14舉例說明證明細胞吸收包括PEG-C-DMA綴合物的SPLP的數據。
圖15舉例說明證明在施用SPLP或SNALP 24小時後，包括PEG-C-DMA或PEG-C-DSA的SPLP和SNALP在具有Neuro-2a腫瘤的雄性A/J小鼠中的生物分布的數據。
圖16舉例說明證明在施用SPLP多達24小時後，包含PEG-C-DMA的SPLP在雄性A/J小鼠中的血液清除率的數據。
圖17舉例說明在施用SPLP或SNALP 48小時後，包含PEG-C-DMA的SPLP和SNALP在具有Neuro-2a腫瘤的雄性A/J小鼠中的生物分布的數據。
圖18舉例說明在施用SPLP和SNALP多達24小時後，包括PEG-C-DMA或PEG-C-DSA的SPLP和SNALP在雄性A/J小鼠中的血液清除率的數據。
圖19舉例說明證明由SPLP和pSPLP體內轉染的數據，所述SPLP和pSPLP包含PEG-DAA綴合物和PEG-DAG綴合物並包封編碼螢光素酶的質粒。
圖20舉例說明證明由SPLP體內轉染的數據，所述SPLP包含PEG-C-DMA綴合物並包封編碼螢光素酶的質粒。
圖21舉例說明證明由SPLP體內轉染的數據，所述SPLP包含PEG-C-DMA綴合物並包封編碼螢光素酶的質粒。
圖22舉例說明證明與SNALPs接觸的Neuro-2a細胞中的螢光素酶表達的沉默的數據，所述SNALPs包括PEG-C-DMA綴合物並包含抗螢光素酶siRNA。
圖23舉例說明證明在表達螢光素酶和用SNALPs處理過的雄性A/J小鼠中的轉移性Neuro-2a腫瘤中的螢光素酶表達的沉默的體內數據，所述SNALPs包括PEG-C-DMA綴合物和包封抗螢光素酶siRNA。
發明詳述I.介紹本發明提供新的聚乙二醇-二烷氧基丙基(PEG-DAA)綴合物，與常用的PEG-脂質綴合物(諸如PEG-PE綴合物)比較，其具有增加的穩定性。本發明的PEG-修飾的二烷基丙基綴合物通過增加所述脂質體，SNALP，或SPLP的循環壽命或使用期限來提高脂質體以及核酸-脂質顆粒(例如，SNALPs和SPLPs)的性質。事實上，已經令人驚奇地發現，包含通過接頭與DAA綴合的PEG的PEG-DAA綴合物比其它常用的PEG-脂質衍生物更穩定。具體而言，已經令人驚奇地發現，使用包含非酯的接頭部分導致了與常用的PEG-脂質綴合物比較穩定性增加的PEG-DAA綴合物(例如，PEG-PG綴合物)。作為它們增加的穩定性的結果，本發明的PEG-DAA綴合物增加了脂質體，SNALP或SPLP的循環壽命或使用期限並還減少了由於使用其它PEG-脂質綴合物時脂質體雙層，SNALP，或SPLP的脂肪醯基鏈的水解所導致的漏損。
II.定義術語「二烷氧基丙基」指具有2-烷基鏈的化合物，其R1和R2都獨立地具有2-30個碳。烷基基團可以是飽和的或具有不同程度的不飽和。二烷氧基丙基具有如下的通式 術語「PEG」指聚乙二醇，一種具有兩個末端羥基基團的線性，乙烯PEG重複單元的水溶性聚合物。根據它們的分子量，將PEGs進行分類；例如，PEG 2000具有約2,000道爾頓的平均分子量，並且PEG5000具有約5,000道爾頓的平均分子量。PEGs是可從Sigma Chemical Co.和其它公司商購的並且包括例如下列各項單甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)，單甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)，單甲氧基聚乙二醇-琥珀醯亞胺基琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)，單甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)，單甲氧基聚乙二醇-tresylate(MePEG-TRES)，和單甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。此外，所述實例提供合成單甲氧基聚乙二醇-乙酸(MePEG-CH2COOH)的方案，其特別在製備本發明的PEG-DAA綴合物中有用。
在一個優選的實施方案中，所述PEG是具有約550到約10,000道爾頓的平均分子量的聚乙二醇並且任選地被烷基，烷氧基，醯基或芳基取代。在一個優選的實施方案中，所述PEG在末端羥基位置被甲基所取代。在另一個優選的實施方案中，所述PEG具有約750到約5,000道爾頓的平均分子量，更優選地，具有約1,000約5,000道爾頓的平均分子量，更優選地具有約1,500到約3,000道爾頓的平均分子量，並且，甚至更優選地具有約2,000道爾頓或約750道爾頓的平均分子量。所述PEG可以任選地被烷基，烷氧基，醯基或芳基所取代。在一個優選的實施方案中，所述末端羥基基團被甲氧基或甲基基團所取代。
用於本文時，PEG-DAA綴合物指與二烷氧基丙基綴合的聚乙二醇。所述PEG可以直接與DAA綴合併且可以通過接頭部分與DAA綴合。適合的接頭部分包括包含非酯的接頭部分和包含酯的接頭部分。
用於本文時，術語「包含非酯的接頭部分」指不包含羧酸酯鍵(-OC(O)-)的接頭部分。適合的包含非酯的接頭部分包括，但不限於，醯氨基(-C(O)NH-)、氨基(-NR-)、羰基(-C(O)-)、氨基甲酸酯(-NHC(O)O-)，脲(-NHC(O)NH-)，二硫化物(-S-S-)，醚(-O-)，琥珀醯(-(O)CCH2CH2C(O)-)，琥珀醯胺(-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-)，醚，二硫化物，等及其組合(諸如包含氨基甲酸酯接頭部分和醯氨基接頭部分的接頭)。在一個優選的實施方案中，將氨基甲酸酯接頭用於將PEG偶聯於脂質。
在其它實施方案中，包含酯的接頭部分用於將PEG偶聯於脂質。適合的包含酯的接頭部分包括，例如，碳酸酯(-OC(O)O-)，琥珀一醯基，磷酸酯(-O-(O)POH-O-)，磺酸酯，及其組合。
術語「脂質」指一組有機化合物，其包括，但不限於脂肪酸的酯，並且特徵是在水中不溶的，但是在許多有機溶劑中是可溶的。通常將它們分成至少三類(1)「簡單的脂質」，其包括脂肪和油以及蠟；(2)「化合物脂質」其包括磷脂和糖脂；(3)「衍生的脂質」諸如甾族化合物。
「脂質小泡」指可用於遞送化合物的任何脂質組合物，其包括，但不限於，脂質體，其中水體積被兩親性脂雙層所包封；或其中脂質包被包括大分子組分的內部，諸如包括幹擾RNA序列的質粒，伴隨減少的水性內部；或脂質聚集體或膠團，其中被包封的成分包含在相對混亂的脂質混合物中。
用於本文時，「包封的脂質」可指提供具有充分包封、部分包封或兩者的化合物的脂質製劑。在一個優選的實施方案中，將所述核酸充分包封在脂質製劑中(例如，形成SPLP，pSPLP，SNALP，或其它核酸脂質顆粒)。核酸脂質顆粒及其製備方法公開於美國專利號5,976,567，美國專利號5,981,501和PCT專利公開號WO 96/40964中。
用於本文時，術語「SNALP」指穩定的核酸脂質顆粒，包括SPLP。SNALP代表包被減少的水性內部的脂質的小泡，所述內部包括核酸(例如，ssDNA，dsDNA，ssRNA，dsRNA，siRNA或質粒，包括轉錄幹擾RNA的質粒)。用於本文時，術語「SPLP」指包括被包封於脂質小泡中的核酸(例如，質粒)的核酸脂質顆粒。SNALPs和SPLPs典型地包含陽離子脂質，非陽離子脂質，和阻止所述顆粒聚集的脂質(例如，PEG-脂質綴合物)。SNALPs和SPLPs具有全身施用，因為它們在靜脈內(i.v.)注射後顯示延長的循環壽命，在遠端位點(例如，在物理上與施用位點分隔的位點上聚集並且可以介導被轉染的基因在這些遠端位點的表達。SPLPs包括「pSPLP」，其包括如在WO 00/03683中提及的被包封的縮合劑-核酸複合物。
術語「形成小泡的脂質」意欲包括任何具有疏水部分和極性頭部基團的兩親性脂質，並且其本身可以在水中自發形成雙層小泡，示例為大多數磷脂。
術語「採用小泡的脂質」意欲包括穩定與脂雙層結合的任何兩親性脂質以及其它的兩親性脂質，其疏水部分與內部，雙層膜的疏水區域接觸，並且其極性頭部基團部分朝向外部，膜的極性表面。採用小泡的脂質包括這樣的脂質，其能夠獨立地適宜於採用非層狀的相，還能夠在存在雙層穩定組分時，採取雙層結構。典型的實例是DOPE(二油醯磷脂醯乙醇胺)。雙層穩定組分包括，但不限於，抑制SNALPs聚集的綴合的脂質，聚醯胺低聚物(例如，ATTA-脂質衍生物)、肽、蛋白質、去汙劑、脂質衍生物、PEG-脂質衍生物諸如與二烷氧基丙基偶聯的PEG、與二醯基甘油偶聯的PEG、與磷脂醯乙醇胺偶聯的PEG，和與神經醯胺綴合的PEG(見，美國專利號5,885,613，將其併入本文作為參考)。PEG可以直接與脂質綴合或可以通過接頭部分與脂質連接。可以使用適合於將PEG偶聯於脂質的任何接頭部分，包括，例如，包含非酯的接頭部分和包含酯的接頭部分。
術語「兩親性脂質」部分地指任何適合的材料，其中脂質材料的疏水部分朝向疏水相，而親水部分朝向水相。兩親性脂質通常是脂質小泡的主要成分。親水性質來自極性或帶電基團諸如碳水化合物，磷酸鹽(酯)，羧基、硫酸根合、氨基、巰基、硝基、羥基和其它類似基團的存在。疏水性可以通過包含非極性基團來賦予，所述基團包括，但不限於，長鏈飽和和不飽和脂族烴基團和由一個或多個芳香族、脂環族或雜環基團取代的這樣的基團。兩親性化合物的實例包括，但不限於，磷脂、氨脂質和神經鞘脂類。磷脂的代表性實例包括，但不限於，磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯肌醇、磷脂酸、棕櫚醯油醯磷脂醯膽鹼、溶血磷脂醯膽鹼、溶血磷脂醯乙醇胺、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、二油醯磷脂醯膽鹼、二硬脂醯磷脂醯膽鹼或二亞油醯磷脂醯膽鹼。缺乏磷的其它化合物，諸如鞘磷脂、鞘糖脂家族、二醯基甘油和β-醯氧基酸也在被稱為兩親性脂質的組中。另外，上述的兩親性脂質可與其它脂質混和，所述脂質包括甘油三酯和固醇。
術語「中性脂質」指在選定的pH以未帶電荷或中性兩性離子形式存在的許多脂質種類中的任何一種。在生理pH下，這樣的脂質包括，例如，二醯基磷脂醯膽鹼、二醯基磷脂醯乙醇胺、神經醯胺、神經鞘磷脂、腦磷脂、膽固醇、腦苷脂和二醯基甘油。
術語「非陽離子脂質」指如上所述的任何中性脂質以及陰離子脂質。
術語「陰離子脂質」指在生理pH下帶負電荷的任何脂質。這些脂質包括，但不限於，磷脂醯甘油、心磷脂、二醯基磷脂醯絲氨酸、二醯基磷脂酸、N-十二烷醯磷脂醯乙醇胺、N-琥珀醯磷脂醯乙醇胺、N-戊二醯磷脂醯乙醇胺，賴氨醯磷脂醯甘油、棕櫚醯油醯磷脂醯甘油(POPG)，和其它與中性脂質連接的陰離子修飾基團。
術語「陽離子脂質」指許多脂質種類中的任何一種，其在選定的pH，諸如生理pH下攜帶淨正電荷。這些脂質包括，但不限於，N，N-二油基-N，N-二甲基氯化銨(「DODAC」)；N-(2，3-二油基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化銨(「DOTMA」)；N，N-二硬脂基-N，N-二甲基溴化銨(「DDAB」)；N-(2，3-二油醯氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化銨(「DOTAP」)；3-(N-(N』，N』-二甲基氨基乙烷)-氨基甲醯基)膽固醇(「DC-Chol」)和N-(1，2二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N，N-二甲基-N-羥乙基溴化銨(「DMRIE」)。如下的脂質是陽離子的並且在低於生理pH時具有正電荷DODAP，DODMA，DMDMA等。
術語「疏水脂質」指具有非極性基團的化合物，其包括，但不限於，長鏈飽和和不飽和脂族烴基團並且這些基團任選地被一個或多個芳香族、脂環族或雜環族基團所取代。合適的實例包括，但不限於，二醯基甘油、二烷基甘油、N-N-二烷基氨基、1，2-二醯氧基-3-氨基丙烷和1，2-二烷基-3-氨基丙烷。
術語「融合性的」指脂質體，SNALP或其它藥物遞送系統與細胞膜融合的能力。所述膜可以是質膜或圍繞細胞器，例如內體、核等的膜。
術語「二醯基甘油」指具有2-脂肪醯基鏈的化合物，其R1和R2都獨立地具有通過酯鍵與甘油的1-和2-位鍵合的2-30個碳原子。所述醯基基團可以是飽和的或具有不同程度的不飽和。二醯基甘油具有如下的通式 術語「ATTA」或「聚醯胺」指，但不限於，在美國專利號6,320,017和6,586,559中公開的化合物，將它們都併入本文作為參考。這些化合物包括具有如下式的化合物 其中R是選自由氫、烷基和醯基組成的組中的成員；R1是選自由氫和烷基組成的組中的成員；或任選地，R和R1和它們所結合的氮原子形成疊氮基部分；R2是選自由氫、任選地取代的烷基、任選地取代的芳基和胺基酸側鏈組成的組的成員；R3是選自由氫、滷素、羥基、烷氧基、巰基、肼基、氨基和NR4R5組成的組的成員，其中R4和R5獨立地是氫或烷基；n是4-80；m是2-6；p是1-4；並且q是0或1。那些本領域技術人員將清楚的是其它聚醯胺可用在本發明的化合物中。
術語「核酸」或「聚核酸」指包含至少兩個脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的以單或雙鏈形式存在的聚合物。核酸包括包含已知核苷酸類似物或修飾的主鏈殘基或鍵的核酸，其是合成的，天然存在的，或非天然存在的，其具有與參考核酸相似的結合特性，並且其以與參考核苷酸相似的方式進行代謝。這些類似物的實例包括，但不限於，硫代磷酸酯(phosphoroorothioates)，氨基磷酸酯，磷酸甲酯，手性-磷酸甲酯，2-O-甲基核糖核苷酸，肽-核酸(PNAs)。除非具體限制，該術語涵蓋包含天然核苷酸的已知類似物的核酸，其具有與參照核酸相似的結合特性並且以與天然存在的核苷酸相似的方式進行代謝。除非另外指出，具體的核酸序列還暗含涵蓋其保守性修飾的變體(例如，簡併密碼子替換)，等位基因，直向同源物，SNPs和互補序列以及明顯指出的序列。具體地，可通過產生序列來獲得簡併密碼子替換，在所述序列中一個或多個選定(或所有)的密碼子的第三個位置由混和的鹼基和/或脫氧肌苷殘基所取代(Batzer et al.，Nucleic Acid Res.195081(1991)；Ohtsuka et al.，J.Biol.Chem.2602605-2608(1985)；和Cassol et al.(1992)；Rossolini et al.，Mol.Cell.Probes 891-98(1994))。「核苷酸」包含糖脫氧核糖(DNA)或核糖(RNA)，鹼基，和磷酸基團。核苷酸通過磷酸基團進行連接。「鹼基」包括嘌呤和嘧啶，其進一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷，和天然類似物，以及嘌呤和嘧啶的合成衍生物，其包括，但不限於取代新的反應基的修飾，所述反應基諸如，但不限於，胺、醇、硫醇、羧酸鹽(酯)和滷代烷。DNA可以以反義、質粒DNA、質粒DNA的部分、預壓縮的DNA、聚合酶鏈式反應(PCR)的產物、載體(P1，PAC，BAC，YAC，人工染色體)、表達盒、嵌合序列、染色體DNA或這些組的衍生物存在。術語核酸與基因、cDNA、由基因編碼的mRNA和幹擾RNA分子可替換地使用。
術語「基因」指包括部分長度或全長的編碼序列的核酸(例如，DNA或RNA)序列，所述編碼序列是產生多肽或多肽前體(例如，來自A，B，C，D，E，G型肝炎病毒；或單純皰疹病毒的多肽或多肽前體)所必需的。
用於本文時，「基因產物」指基因的產物諸如包括，例如mRNA的RNA轉錄物。
III.聚乙二醇-修飾的二烷氧基丙基(PEG-DAA)綴合物本發明提供新的聚乙二醇-二烷氧基丙基(PEG-DAA)綴合物，與常用的PEG-脂質綴合物(諸如PEG-PE綴合物)相比，其具有增加的穩定性。更具體地，本發明提供新的具有如下結構的式I的PEG-DAA綴合物 在上述式I中，「R1和R2」被獨立地選擇並是具有約10-約20個碳原子的烷基基團。所述烷基基團可以是飽和的或是不飽和的。適合的烷基基團包括，但不限於，月桂基(C12)，肉豆蔻基(C14)，棕櫚基(C16)，硬脂基(C18)和二十碳烷基(C20)。在一個實施方案中，R1和R2是相同的，即R1和R2都是肉豆蔻基(C14)或都是硬脂基(C18)等。在另一個實施方案中，R1和R2是不同的，即R1是肉豆蔻基(C14)，R2是硬脂基(C18)。在一個優選的實施方案中，本發明的PEG-DAA綴合物是對稱的，即，R1和R2都是相同的。
在上述式I中，PEG是聚乙二醇，一種具有兩個末端羥基基團的線性，乙烯PEG重複單元的水溶性聚合物。根據它們的分子量，將PEGs進行分類；例如，PEG 2000具有約2,000道爾頓的平均分子量，並且PEG 5000具有約5,000道爾頓的平均分子量。PEGs是可從Sigma Chemical Co.和其它公司商購的並且包括下列單甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)，單甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)，單甲氧基聚乙二醇-琥珀醯亞胺基琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)，單甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)，單甲氧基聚乙二醇-tresylate(MePEG-TRES)，和單甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。此外，所述實例提供合成單甲氧基聚乙二醇-乙酸(MePEG-CH2COOH)的方案，其特別在製備本發明的PEG-DAA綴合物中有用。
在一個優選的實施方案中，所述PEG是具有約550到約10,000道爾頓的平均分子量的聚乙二醇並且任選地被烷基，烷氧基，醯基或芳基取代。在一個優選的實施方案中，所述PEG在末端羥基位置被甲基所取代。在另一個優選的實施方案中，所述PEG具有約750到約5,000道爾頓的平均分子量，更優選地，具有約1,000到約5,000道爾頓的平均分子量，更優選地具有約1,500到約3,000道爾頓的平均分子量，並且，甚至更優選地具有約2,000道爾頓或約750道爾頓的平均分子量。
在上述式I中，「L」是包含非酯的接頭部分或包含酯的接頭部分。在一個優選的實施方案中，L是包含非酯的接頭部分，即，不包含羧酸酯鍵(-OC(O)-)的接頭部分。適合的包含非酯的接頭包括，但不限於，醯氨基接頭部分，氨基接頭部分，羰基接頭部分，氨基甲酸酯接頭部分，脲接頭部分，醚接頭部分，二硫化物接頭部分，琥珀醯胺接頭部分，琥珀醯基及其組合。在一個優選的實施方案中，包含非酯的接頭部分是氨基甲酸酯接頭部分(即，PEG-C-DAA綴合物)。在另一個優選的實施方案中，包含非酯的接頭部分是醯氨基接頭部分(即，PEG-A-DAA綴合物)。在一個優選的實施方案中，包含非酯的接頭部分是琥珀醯胺基接頭部分(即，PEG-S-DAA綴合物)。
在其它實施方案中，L是包含酯的接頭部分。適合的包含酯的接頭部分包括，例如，羧酸酯(-OC(O)O-)，琥珀一醯基，磷酸酯(-O-(O)POH-O-)，磺酸酯及其組合。
使用本領域那些技術人員已知的標準技術和試劑來合成本發明的PEG-DAA綴合物。將認識到本發明的PEG-DAA綴合物將包含各種醯胺，胺，醚，硫代，氨基甲酸酯和脲鍵。本領域那些技術人員將意識到形成這些鍵的方法和試劑是眾所周知的並且是容易獲得的。見，例如，March，ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY(Wiley 1992)，Larock，COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS(VCH 1989)；和Furniss，VOGEL′S TEXTBOOK OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY5th ed.(Longman 1989)。還將理解的是，任何出現的官能團在合成本發明的PEG-DAA綴合物中的不同點上可需要保護和去保護。本領域那些技術人員將意識到這些技術是眾所周知的。見，例如Green和Wuts，PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS(Wiley 1991)。
形成本發明的PEG-DAA綴合物的反應的一般順序在下面的實施例部分進行闡明。所述實施例提供製備本發明的PEG-A-DMA，PEG-C-DMA和PEG-S-DMA綴合物的合成方案。使用類似的方法，本領域技術人員可以容易地產生本發明的其它PEG-DAA綴合物。
除前述之外，對於本領域那些技術人員將容易變得顯而易見的是可以使用其它親水性聚合物來取代PEG。可以用來取代PEG的適合的聚合物的實例包括，但不限於，聚乙烯吡咯烷酮，聚甲基噁唑啉，聚乙基噁唑啉，聚羥基丙基甲基丙烯醯胺，聚甲基丙烯醯胺和聚二甲基丙烯醯胺，聚乙酸，聚羥基乙酸，和衍生化纖維素，諸如羥甲基纖維素和羥乙基纖維素。
IV.包含PEG-DAA綴合物的SPLPs和SNALPs在一個實施方案中，本發明提供包含聚乙二醇(PEG)-二烷氧基丙基(DAA)綴合物，即，PEG-DAA綴合物的穩定的核酸-脂質顆粒(例如，SPLPs和SNALPs)以及其它的基於脂質的載體系統。本發明的脂質-核酸顆粒典型地包括核酸，陽離子脂質，非陽離子脂質和PEG-DAA綴合物。所述陽離子脂質典型地構成在所述顆粒中存在的總脂質的約2％到約60％，優選地構成所述顆粒中存在的總脂質的約5％到約45％。在某些優選的實施方案中，陽離子脂質構成在所述顆粒中存在的總脂質的約5％到約15％。在其它優選的實施方案中，陽離子脂質構成在所述顆粒中存在的總脂質的約40％到約50％。非陽離子脂質典型地構成在所述顆粒中存在的總脂質的約5％到約90％，優選地構成在所述顆粒中存在的總脂質的約20％到約85％。PEG-DAA綴合物典型地構成在所述顆粒中存在的總脂質的1％到約20％，優選地構成在所述顆粒中存在的總脂質的2％到約15％，更優選地構成在所述顆粒中存在的總脂質的約4％到約10％。本發明的核酸-脂質顆粒還可以包含膽甾醇。如果存在，膽甾醇典型地構成在所述顆粒中存在的總脂質的約10％到約60％，優選地膽甾醇構成在所述顆粒中存在的總脂質的約20％到約45％。對於本領域技術人員將容易變得顯而易見的是，例如，使用在下面的實施例部分中描述的ERP測定，核酸-脂質顆粒的成分的比例可以變化。例如，對於全身遞送，陽離子脂質可以構成在所述顆粒中存在的總脂質的約5％到約15％，而對於局部或區域性遞送，所述陽離子脂質構成在所述顆粒中存在的總脂質的約40％到約50％。
本發明的SPLPs和SNALPs典型地具有少於約150nm的平均直徑並且是基本無毒的。此外，當存在於本發明的SPLPs和SNALPs中時，核酸對於水溶液中核酸酶的降解具有抗性。SPLPs和SNALPs以及它們的製備方法公開於美國專利號5,976,567，美國專利號5,981,501和PCT專利公開號WO 96/40964中，將其所有的教導併入本文作為參考。
可以單獨或與一種或多種其它的陽離子脂質種類或非陽離子脂質種類組合來將各種適合的陽離子脂質用在本發明中。
用在本發明中的陽離子脂質可以是在選定的pH，諸如生理pH下攜帶淨正電荷的許多脂質種類的任何一種。適合的陽離子脂質包括，但不限於，DODAC，DOTMA，DDAB，DOTAP，DOSPA，DOGS，DC-Chol和DMRIE，或其組合。也用在本發明中的許多這些陽離子脂質和相關類似物，已經描述在同時待審的USSN 08/316,399；美國專利號5,208,036，5,264,618，5,279,833和5,283,185中，將其內容併入本文作為參考。此外，可獲得許多陽離子的商購製劑並可將其用在本發明中。這些包括，例如LIPOFECTIN(可商購的陽離子脂質體，其包括來自GIBCO/BRL，GrandIsland，New York，USA的DOTMA和DOPE)；LIPOFECTAMINE(可商購的陽離子脂質體，包括來自GIBCO/BRL的DOSPA和DOPE)；和TRANSFECTAM(可商購的陽離子脂質體，包括來自Promega Corp.，Madison，Wisconsin，USA的DOGS)。
用於本發明的非陽離子脂質可以是能夠產生穩定複合體的多種中性不帶電荷的，兩性離子或陰離子脂質。它們優選地是中性的，儘管它們可以備選地是帶正電荷或帶負電荷的。用在本發明中的非陽離子脂質的實例包括磷脂-相關的物質，諸如卵磷脂，磷脂醯乙醇胺，溶血卵磷脂，溶血磷脂醯乙醇胺，磷脂醯絲氨酸，磷脂醯肌醇，鞘磷脂，腦磷脂，心磷脂，磷脂酸，腦苷脂，二鯨蠟基磷酸酯，二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)，二油醯磷脂醯膽鹼(DOPC)，二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)，二油醯磷脂醯甘油(DOPG)，二棕櫚醯磷脂醯甘油(DPPG)，二油醯-磷脂醯乙醇胺(DOPE)，棕櫚醯油醯磷脂醯膽鹼(POPC)，棕櫚醯油醯-磷脂醯乙醇胺(POPE)和二油醯-磷脂醯乙醇胺4-(N-馬來醯亞胺基甲基)-環已烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)。非陽離子脂質或甾醇諸如膽甾醇可以存在。另外的不含磷的脂質是，例如，硬脂胺，十二烷胺，十六胺，乙醯基棕櫚酸酯，甘油蓖麻醇酸酯，硬脂酸十六烷基酯，十四烷酸異丙酯，兩性丙烯酸酯聚合物，三乙醇胺-硫酸月桂酯，烷基-芳基硫酸酯聚乙氧化脂肪酸醯胺，二(十八烷基)二甲基溴化銨等，二醯基磷脂醯膽鹼，二醯基磷脂醯乙醇胺，神經醯胺，鞘磷脂，腦磷脂，和腦苷脂。其它的脂質諸如溶血磷脂醯膽鹼和溶血磷脂醯乙醇胺可以存在。非陽離子脂質還包括基於聚乙二醇的聚合物諸如PEG2000，PEG 5000和與磷脂或與神經醯胺(被稱作PEG-Cer)綴合的聚乙二醇，如在同時待審的USSN 08/316,429中所描述的，將其併入本文作為參考。
在優選的實施方案中，非陽離子脂質是二醯基磷脂醯膽鹼(例如，二硬脂醯磷脂醯膽鹼，二油醯磷脂醯膽鹼，二棕櫚醯磷脂醯膽鹼和二亞油醯磷脂醯膽鹼)，二醯基磷脂醯乙醇胺(例如，二油醯磷脂醯乙醇胺和棕櫚醯油醯磷脂醯乙醇胺)，神經醯胺或鞘磷脂。在這些脂質中的醯基基團優選地是來自具有C10-C24碳鏈的脂肪酸的醯基基團。更優選地是醯基基團是月桂醯，肉豆蔻醯，硬脂醯或油醯。在特別優選的實施方案中，非陽離子脂質將是膽甾醇，1，2-sn-二油醯磷脂醯乙醇胺，或卵鞘磷脂(ESM)。
除了陽離子和非陽離子脂質之外，本發明的SPLPs包括聚乙二醇-二烷氧基丙基綴合物，即PEG-DAA綴合物。術語「二烷氧基丙基」指具有2-烷基鏈的化合物，其R1和R2都獨立地具有2-30個碳。烷基基團可以是飽和的或具有不同程度的不飽和。二烷氧基丙基具有如下的通式
在本發明優選的實施方案中，PEG-DAA綴合物是二月桂基氧基丙基(C12)-PEG綴合物，二肉豆蔻基氧基丙基(C14)-PEG綴合物，二棕櫚醯氧基丙基(C16)-PEG綴合物或二steryl氧基丙基(C18)-PEG綴合物。本領域那些技術人員將容易明白其它的二烷氧基丙基可以用在本發明的PEG-DAA綴合物中。
在一個優選的實施方案中，PEG-DAA綴合物具有下式 在式I中，R1和R2獨立地被選擇並且是具有約10到約22個碳原子的長鏈烷基基團。長鏈烷基基團可以是飽和的或是不飽和的。適合的烷基基團包括，但不限於，月桂基(C12)，肉豆蔻基(C14)，棕櫚基(C16)，硬脂基(C18)和二十碳烷基(C20)。在優選的實施方案中，R1和R2是相同的，即，R1和R2都是肉豆蔻基(即，二肉豆蔻基)，R1和R2都是硬脂基(即，二硬脂基)，等。在式I中，PEG是具有約550到約8,500道爾頓的平均分子量的聚乙二醇。在一個優選的實施方案中，PEG具有約1,000到約5,000道爾頓的平均分子量，更優選地，具有約1,000到約3,000道爾頓的平均分子量，甚至更優選地，具有約2,000道爾頓或約750道爾頓的平均分子量。所述PEG可以任選地被烷基，烷氧基，醯基或芳基基團所取代。
在式I中，L是接頭部分(例如，包含非酯的接頭部分或包含酯的接頭部分)。可以使用適合於將PEG偶聯於二烷氧基丙基主鏈的任何接頭部分。在一個優選的實施方案中，L是包含非酯的接頭部分，即，不包含羧酸酯鍵(-OC(O)-)的接頭部分。適合的包含非酯的接頭部分包括，但不限於，醯氨基(-C(O)NH-)，氨基(-NR-)，羰基(-C(O)-)，氨基甲酸酯(-NHC(O)O-)，脲(-NHC(O)NH-)，琥珀醯(-(O)CCH2CH2C(O)-)，琥珀醯胺基，醚，二硫化物，及其組合。在一個優選的實施方案中，包含非酯的接頭部分是氨基甲酸酯接頭部分(即，PEG-C-DAA綴合物)。在另一個優選的實施方案中，包含非酯的接頭部分是醯氨基接頭部分(即，PEG-A-DAA綴合物)。在一個優選的實施方案中，包含非酯的接頭部分是琥珀醯胺基接頭部分(即，PEG-S-DAA綴合物)。
在其它實施方案中，L是包含酯的接頭部分。適合的包含酯的接頭部分包括，例如，碳酸酯(-OC(O)O-)，琥珀一醯基，磷酸酯(-O-(O)POH-O-)，磺酸酯及其組合。
已經令人驚奇地發現，PEG-DAA綴合物特別有用於本發明的核酸-脂質顆粒(例如，SNALPS和SPLP’s)。PEG-DAA綴合物具有超過PEG-磷脂衍生物的多個優勢。例如，PEG-磷脂衍生物在它們的磷酸鹽基團上具有負電荷，其導致多種不利。首先，負電荷可以導致與製劑中的陽離子脂質的相互作用，並且因此，導致阻止PEG-磷脂交換出雙層的靜電力。第二，磷酸酯基團的負電荷中和作為包封過程的必需部分的陽離子電荷。為了抵消磷酸酯基團的中和作用，必須使用更高摩爾百分比的陽離子脂質，因此增加了製劑的毒性。此外，與PEG-神經醯胺相比，PEG-DAA綴合物更易於生產和製造。
除了前述組分之外，本發明的SPLPs還可以包含陽離子聚(乙二醇)(PEG)脂質，或CPLs，其已經被設計插入脂雙分子層以賦予正電荷(見，Chen，et al.，Bioconj.Chem.11433-437(2000))。用在本發明中的適合的SPLPs和SPLP-CPLs，以及製備和使用SPLPs和SPLP-CPLs的方法公開於，例如提交於2000年4月20日的美國申請號09/553,639，和提交於2000年4月20日並在2000年10月26日公布為WO 00/62813的PCT專利申請號CA 00/00451，將其每個的教導全文併入本文作為參考。
A.目標產物除了上述組分之外，本發明的SPLPs和SNALPs包括核酸(例如，單鏈或雙鏈DNA，單鏈或雙鏈RNA，RNAi，siRNA等)。適合的核酸包括，但不限於，質粒，反義寡核苷酸，核酶以及其它的聚-和寡-核苷酸。在優選的實施方案中，所述核酸編碼產物，例如目標治療性產物。
目標產物可以用於商業目的，包括用於作為藥物或診斷的治療性目的。治療性產物的實例包括，蛋白質，核酸，反義核酸，核酶，tRNA，snRNA，siRNA，抗原，VIII因子，和凋亡蛋白(Zhuang et al.(1995)Cancer Res.55(3)486-489)。適合種類的基因產物包括，但不限於，細胞毒性/自殺基因，免疫調節劑，細胞受體配體，腫瘤抑制物，和抗血管發生的基因。選擇的特定基因將取決於所意欲的目的或治療。這些目標基因的實例在下面和貫穿整個說明書進行描述。
1.siRNASNALPs和SPLPs的核酸組分典型地包括幹擾RNA(即，siRNA)，其可以以幾種形式進行提供，包括，例如作為一個或多個分離的小幹擾RNA(siRNA)雙鏈體，更長的雙鏈RNA(dsRNA)，或作為轉錄自DNA質粒中的轉錄盒的siRNA或dsRNA。
RNA群可以用於提供長的前體RNAs，或與可用於製備siRNA的選定靶序列具有基本或完全同一性的長前體RNAs。所述RNAs可以按照本領域技術人員中眾所周知的方法來從細胞或組織中分離，合成，和/或克隆。RNA可以是混和的群(獲自細胞或組織，轉錄自cDNA，扣除的(subtrated)，選擇的等)，或可以代表單一靶序列。RNA可以是天然存在的，例如，分離自組織或細胞樣品，例如使用T7或SP6聚合酶和PCR產物或克隆的cDNA在體外合成的；或以化學方法合成。
為了形成長的dsRNA，對於合成RNAs，互補體還可以在體外轉錄並雜交以形成ds RNA。如果使用天然存在的RNA群，例如通過轉錄相應於RNA群的cDNAs，或通過使用RNA聚合酶，還提供了RNA互補體(例如，形成dsRNA，其通過大腸桿菌(E.coli)RNAse III或切酶進行消化)。接著，前體RNAs進行雜交從而形成雙鏈RNAs進行消化。dsRNAs可以直接被包封在SNALPs中或可以在包封前進行體外消化。
或者，可以將編碼一個或多個siRNA模板的一個或多個DNA質粒包封在核酸-脂質顆粒中。例如，基於小核RNAU6或人RNase P RNA H1的天然存在轉錄單位，可以從質粒中的DNA模板將siRNA轉錄為自動摺疊為具有髮夾環的雙鏈體的序列，所述質粒具有RNA聚合酶III轉錄單位(見，Brummelkamp，et al.，Science 296550(2002)；Donzé，et al，Nucleic A cidsRes.30e46(2002)；Paddison，et al.，Genes Dev.16948(2002)；Yu，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.996047(2002)；Lee，et al.，Nat.Biotech.20500(2002)；Miyagishi，et al.，Nat.Biotech.20497(2002)；Paul，et al.，Nat.Biotech.20505(2002)；和Sui，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.995515(2002))。典型地，轉錄單位或盒將包含RNA轉錄啟動子序列，諸如H1-RNA或U6啟動子和終止序列，所述啟動子可操作地與轉錄所需siRNA序列的模板連接，所述終止序列包括2-3個尿苷殘基和聚胸苷(T5)序列(多腺苷酸化信號)(Brummelkamp，Science，同上)。選定的啟動子可以提供組成型或誘導型轉錄。將組合物和DNA-指導的RNA幹擾分子的轉錄的方法詳細描述於美國專利號6,573,099，將其併入本文作為參考。優選地，所述合成性或轉錄的siRNA具有約1-4個，優選地約2-3個核苷酸的3』突出端以及5』磷酸末端(Elbashir，et al.，Genes Dev.15188(2001)；Nyknen，et al.，Cell 107309(2001))。將轉錄單位結合到質粒或DNA載體中，幹擾RNA轉錄自所述質粒或DNA載體。將適合於體內遞送遺傳物質用於治療目的的質粒詳細描述於美國專利號5,962,428和5,910,488中，它們兩者都結合到本文作為參考。選定的質粒可以提供靶細胞的瞬時或穩定的遞送。本領域那些技術人員將清楚的是起初被設計用於表達所需基因序列的質粒可以被進行修飾從而包含轉錄siRNA的轉錄單位盒。
分離RNA，合成RNA，雜交核酸，製備和篩選cDNA文庫以及進行PCR的方法是本領域眾所周知的(見，例如.，GublerHoffman，Gene25263-269(1983)；Sambrook at al.，同上；Ausubel et al.，同上)，PCR方法也是這樣(見美國專利4,683,195和4,683,202；PCR ProtocolsA Guide toMethods and Applications(Innis et al.，eds，1990))。表達文庫也是本領域技術人員眾所周知的。公開用在本發明中的一般方法的另外的基本書籍包括Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(2nd ed.1989)；Kriegler，Gene Transfer and ExpressionA Laboratory Manual(1990)；和Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.，eds.，1994))。
對適合的質粒進行工程改造從而使其以可表達的形式包含模板序列，所述序列編碼目標基因產物的部分長度的序列或完整的序列。模板序列還可以用於提供分離的或合成的siRNA和dsRNA。一般而言，理想的是使目標基因產物的轉錄或翻譯下調或沉默。適合種類的基因產物包括，但不限於，與腫瘤發生和細胞轉化相關的基因，血管發生基因，免疫調節劑基因，諸如與炎症和自體免疫應答有關的那些，配體受體基因，與神經變性疾病相關的基因，和與病毒感染和存活相關的基因。
與腫瘤發生和細胞轉化相關的基因序列的實例包括易位序列諸如MLL融合基因，BCR-ABL(Wilda，et al.，Oncogene，215716(2002)；Scherr，et al.，Blood 1011566)，TEL-AML1，EWS-FLI1，TLS-FUS，PAX3-FKHR，BCL-2，AML1-ETO和AML1-MTG8(Heidenreich，et al.，Blood 1013157(2003))；過度表達的序列諸如多藥物抗性基因(Nieth，et al.，FEBS Lett.545144(2003)；Wu，et al，Cancer Res.631515(2003))，細胞周期蛋白(Li，etal.，Cancer Res.633593(2003)；Zou，et al.，Genes Dev.162923(2002))，β-聯蛋白(Verma，et al.，Clin Cancer Res.91291(2003))，端粒末端轉移酶基因(Kosciolek，et al.，Mol Cancer Ther.2209(2003))，c-MYC，N-MYC，BCL-2，ERBB1和ERBB2(Nagy，et al.Exp.Cell Res.28539(2003))；和突變序列諸如RAS(綜述於Tuschl和Borkhardt，Mol.Interventions，2158(2002))。使編碼DNA修復酶的序列沉默在與化療劑的施用聯合使用中發現了應用(Collis，et al.，Cancer Res.631550(2003))。編碼與腫瘤遷移有關的蛋白質的基因也是目標靶序列，例如，整聯蛋白，選擇蛋白和金屬蛋白酶。前述實例不是窮盡性的。可以將任何有利於或促進腫瘤發生或細胞轉化，腫瘤生長或腫瘤遷移的完整或部分基因序列包括作為靶序列。
生血管基因能夠促進心血管的形成。特別感興趣的是血管內皮生長因子(VEGF)(Reich，et al.，Mol.Vis.9210(2003))。
免疫調節劑基因是調節一個或多個免疫應答的基因。免疫調節劑基因的實例包括細胞因子諸如生長因子(例如，TGF-α.，TGF-β，EGF，FGF，IGF，NGF，PDGF，CGF，GM-CSF，SCF，等)，白細胞介素(例如，IL-2，IL-4，IL-12(Hill，et al.，J.Immunol.171691(2003))，IL-15，IL-18，IL-20，等)，幹擾素(例如，IFN-α，IFN-β，IFN-γ，等)和TNF。Fas和Fas配體基因也是目標免疫調節劑靶序列(Song，et al.，Nat.Med.9347(2003))。在生血和淋巴樣細胞中的編碼次級信號分子的基因也包括在本發明中，例如，Tec家族激酶，諸如酪氨酸蛋白激酶(Btk)(Heinonen，et al.，FEBS Lett.527274(2002))。
細胞受體配體包括這樣的配體，其能夠結合細胞表面受體(例如，胰島素受體，EPO受體，G-蛋白偶聯受體，具有酪氨酸激酶活性的受體，細胞因子受體，生長因子受體等)從而調節(例如，抑制，激活等)涉及受體的生理途徑(例如，葡萄糖水平調節，血液細胞發展，有絲分裂發生等)。細胞受體配體的實例包括細胞因子，生長因子，白細胞介素，幹擾素，紅細胞生成素(EPO)，胰島素，胰高血糖素，G-蛋白偶聯受體配體等)。編碼三核苷酸重複(例如，CAG重複)的延伸的模板在神經變形疾病中使病原序列沉默中發現用途，所述疾病由三核苷酸重複的延伸所導致，諸如脊髓延髓肌肉萎縮和亨廷頓舞蹈病(Caplen，et al.，Hum.Mol.Genet.11175(2002))。
與病毒感染和存活相關的基因包括由病毒表達從而結合，進入和在細胞中進行複製的那些。特別感興趣的是與慢性病毒疾病相關的病毒序列。特別感興趣的病毒序列包括人免疫缺陷病毒(HIV)的序列(Banerjea，et al.，Mol.Ther.862(2003)；Song，et al.，J.Virol.777174(2003)；StephensonJAMA 2891494(2003)；Qin，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.100183(2003))，肝炎病毒(Hamasaki，et al.，FEBS Lett.54351(2003)；Yokota，et al.，EMBORep.4602(2003)；Schlornai，et al.，Hepatology 37764(2003)；Wilson，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.1002783(2003)；Kapadia，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.1002014(2003))，皰疹病毒(Jia，et al.，J.Virol.773301(2003))，和人乳頭狀瘤病毒(HPV)(Hall，et al.，J.Virol.776066(2003)；Jiang，et al.，Oncogene 216041(2002))。
2.另外的治療性產物如上解釋，在本發明的一些實施方案中，所述SPLPs和SNALPs包封編碼治療性產物的核酸，諸如，例如，腫瘤抑制基因，免疫調節劑基因，細胞受體配體基因，抗-生血管基因，和細胞毒性/自殺基因。
a)腫瘤抑制腫瘤抑制基因是能夠抑制細胞，特別是腫瘤細胞的生長的基因。因此，將這些基因遞送到腫瘤細胞中在癌症的治療中是特別有用的。腫瘤抑制基因包括，但不限於，p53(Lamb et al.，Mol.Cell.Biol.61379-1385(1986)，Ewen et al.，Science 25585-87(1992)，Ewen et al.(1991)Cell 661155-1164，和Hu et al.，EMBO J.91147-1155(1990))，RB1(Toguchida et al.(1993)Genomics 17535-543)，WT1(Hastie，N.D.，Curr.Opin.Genet.Dev.3408-413(1993))，NF 1(Trofatter et al.，Cell 72791-800(1993)，Cawthon etal.，Cell 62193-201(1990))，VHL(Laif et al.，Science 2601317-1320(1993))，APC(Gorden et al.，Cell 66589-600(1991))，DAP激酶(見，例如，Diess etal.(1995)Genes Dev.915-30)，p16(見，例如，Marx(1994)Science264(5167)1846)，ARF(見，例如，Quelle et al.(1995)Cell 83(6)993-1000)，神經纖維瘤蛋白(見，例如，Huynh et al.(1992)Neurosci.Lett.143(1-2)233-236)，和PTEN(見，例如，Li et al.(1997)Science 275(5308)1943-1947)。
b)免疫調節劑基因免疫調節劑基因是調節一個或多個免疫應答的基因。免疫調節劑基因的實例包括細胞因子諸如生長因子(例如，TGF-α.，TGF-β，EGF，FGF，IGF，NGF，PDGF，CGF，GM-CSF，G-CSF，SCF，等)，白細胞介素(例如，IL-2，IL-3，IL-4，IL-6，IL-7，IL-10，IL-12，IL-15，IL-20，等)，幹擾素(例如，IFN-α，IFN-β，IFN-γ，等)，TNF(例如，TNF-α)和Flt3-配體。
c)細胞受體配體細胞受體配體包括這樣的配體，其能夠結合細胞表面受體(例如，胰島素受體，EPO受體，G-蛋白偶聯受體，具有酪氨酸激酶活性的受體，細胞因子受體，生長因子受體等)從而調節(例如，抑制，激活等)涉及受體的生理途徑(例如，葡萄糖水平調節，血液細胞發展，有絲分裂發生等)。細胞受體配體的實例包括，但不限於細胞因子，生長因子，白細胞介素，幹擾素，紅細胞生成素(EPO)，胰島素，單鏈胰島素(Lee et al.(2000)Nature408483-488)，胰高血糖素，G-蛋白偶聯受體配體等)。這些細胞表面配體可以用在治療遭受疾病的患者中。例如，當在葡萄糖反應性肝細胞-特異性L類型的丙酮酸激酶(LPK)啟動子控制下表達時，單鏈胰島素能夠在streptocozin誘導的糖尿病大鼠和自體免疫的糖尿病小鼠中導致糖尿病的緩解而沒有副作用(Lee et al.(2000)Nature 408483-488)。這種單鏈胰島素通過用短的轉角-形成七肽(Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg)取代胰島素的C-肽的35個胺基酸殘基得以產生。
d)抗生血管基因抗-生血管基因能夠抑制新血管化。這些基因對於治療那些癌症特別有用，在所述癌症中血管發生在疾病的病理發展中具有作用。抗-生血管基因的實例包括，但不限於，內皮抑制素(見例如，美國專利號6,174,861)，制管張素(見，例如，美國專利號5,639,725)，和VEGF-R2(見例如，Decaussin et al.(1999)J.Pathol.188(4)369-737)。
e)細胞毒性/自殺基因細胞毒性/自殺基因是在細胞周期中能夠直接或間接殺死細胞，導致調亡，或停滯細胞的那些基因。這些基因包括，但不限於，免疫毒素基因，單純皰疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)基因，胞嘧啶脫氨酶基因，黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因，p53基因，嘌呤核苷磷酸化酶基因，羥酸酯酶基因，脫氧胞苷激酶基因，硝基還原酶基因，胸苷磷酸化酶基因，和細胞色素P450 2B1基因。
在基因療法中，已知為基因遞送酶前藥療法(″GDEPT″)的技術或，備選地，「自殺基因/前藥」系統，試劑諸如無環鳥苷和鳥嘌呤(對於胸苷激酶)，環磷醯胺(cyclophosphoamide)(對於細胞色素P450 2B1)，5-氟胞苷(對於胞嘧啶脫氨酶)典型地與表達盒組合(例如，同時地或非同時地，例如順序地)進行全身施用從而獲得所需的細胞毒性或抑制細胞效應(見，例如，Moolten，F.L.，Cancer Res.，465276-5281(1986))，所述表達盒編碼本發明的自殺基因組成。關於GDEPT系統的綜述，見，例如Moolten，F.L.，TheInternet Book of Gene Therapy，Cancer Therapeutics，Chapter 11(Sobol，R.E.，Scanlon，NJ(Eds)AppeltonLange(1995))。在該方法中，異源基因在表達盒中被遞送到細胞中，所述表達盒包含RNAP啟動子，所述異源基因編碼促進細胞較不敏感的第一化合物(即，「前藥」)代謝為細胞更敏感的第二化合物的酶。所述前藥與基因一起或在基因傳遞之後被遞送到細胞中。所述酶將前藥處理為第二化合物並據此響應。由Moolten提出的適合的系統是單純皰疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)基因和前藥鳥嘌呤。最近Zerrouqui，etal.，Can.Gen.Therapy，3(6)385-392(1996)；Sugaya，et al.，Hum.Gen.Ther.，7223-230(1996)和Aoki，et al.，Hum.Gen.Ther.，81105-1113(1997)使用陽離子-脂質核酸團聚體進行局部遞送(即，直接腫瘤內注射)，或區域性遞送(即，腹膜內)TK基因到小鼠腫瘤中來應用了該方法。已經提出了使用應用病毒載體的GDEPT系統的人臨床試驗(見，Hum.Gene Ther.，8597-613(1997)，和Hum.Gene Ther.，7255-267(1996))並且其正在進行。
對於關於本發明的使用，最優選的治療性產物是用在基因遞送酶前藥療法(″GDEPT″)中有用的那些。任何自殺基因/前藥組合可以按照本發明進行使用。適合用於本發明的數種自殺基因/前藥組合在Sikora，K.OECDDocuments中，Gene Delivery Systems at pp.59-71(1996)被引用，將其併入本文作為參考，包括，但不限於下列各項
如果被異源基因產物代謝為細胞更敏感的化合物，任何前藥可以進行使用。優選地，細胞對於代謝物的敏感性至少是對於前藥敏感性的10倍。
可以有用於本發明的GDEPT系統的修飾，包括，例如，使用修飾的TK酶構建物，其中TK基因已經被突變從而導致前藥更快地轉變為藥物(見例如，Black，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.，933525-3529(1996))。或者，TK基因可以在二順反子構建物中與增加其效果的另一個基因一起進行遞送。例如，為了增加還被稱作「鄰近效應」的「旁觀者效應」(其中在被轉染的細胞附近中的細胞也被殺死)，TK基因可以與縫隙連接蛋白，諸如連接蛋白43的基因一起進行遞送。連接蛋白容許TK酶的毒性產物從一個細胞擴散到另一個細胞。TK/連接蛋白43構建物具有CMV啟動子，所述CMV啟動子通過內部核糖體進入序列和編碼連接蛋白43的核酸與TK基因可操作地進行連接。
B.SPLP和SNALP的製備及其應用可以使用許多不同方法中的任一種來製備本發明的SPLPs和SNALPs，即包含PEG-DAA綴合物的那些SPLPs和SNALPs。在一個實施方案中，本發明提供通過疏水核酸-脂質中間體複合體製備的脂質-核酸顆粒。所述複合體優選地是電荷中和的。在基於去汙劑或基於有機溶劑的系統中的這些複合體的操作可以導致顆粒形成，其中核酸被保護。
本發明提供製備血清穩定性核酸脂質顆粒的方法，其中核酸被包封在脂雙層中並且被保護免於降解。另外，本發明中形成的顆粒在生理pH下優選地是中性或帶負電荷。對於體內應用，中性顆粒是有利的，而對於體外應用，所述顆粒更優選帶負電荷的。這提供來另外的優勢，即與其中核酸可以被包封在陽離子脂質中的帶正電荷的脂質體製劑比較，聚集減少。
通過本發明的方法製備的SNALPs大小是約50-約150nm，其中大部分顆粒具有約65-約85nm的大小。通過去汙劑透析方法或通過改進的反相方法可以形成所述顆粒，所述反相方法利用有機溶劑來在混和成分的過程中提供單相。不傾向於被任何具體形成機制所束縛，質粒或其它核酸與陽離子脂質的去汙劑溶液接觸從而形成被包被的質粒複合體。這些被包被的質粒可以聚集並沉澱。然而，去汙劑的存在減少了這種聚集並且使被包被的質粒與過量脂質(典型地，非陽離子脂質)反應從而形成顆粒，在所述顆粒中，質粒或其它核酸被包封在脂雙層中。下面描述的使用有機溶劑形成質粒-脂質顆粒的方法按照相似的方案。
在一些實施方案中，使用去汙劑透析來形成所述顆粒。因此，本發明提供製備血清穩定性核酸-脂質顆粒的方法，所述方法包括(a)在去汙劑溶液中使核酸與陽離子脂質結合從而形成被包被的質粒-脂質複合體；(b)使非陽離子脂質與被包被的核酸-脂質複合體接觸從而形成包括質粒-脂質複合體和非陽離子脂質的去汙劑溶液；和(c)透析步驟(b)中的去汙劑溶液從而提供血清穩定性核酸-脂質顆粒的溶液，其中所述核酸被包封在脂雙層中，所述顆粒是血清穩定性的並具有約50-約150nm之間的大小。
通過在去汙劑溶液中使質粒與陽離子脂質結合來形成被包被的核酸-脂質複合體的起始溶液。
在這些實施方案中，所述去汙劑溶液優選地是具有臨界膠束濃度為15-300mM，更優選地為20-50mM的中性去汙劑的水溶液。合適的去汙劑的實例包括，例如，N，N』-((辛醯基亞氨基)-二-(1，3-亞丙基))-二-(D-葡糖醯胺(gluconamide))(BIGCHAP)；BRIJ 35；脫氧-BIGCHAP；十二烷基聚(乙二醇)醚；吐溫20；吐溫40；吐溫60；吐溫80；吐溫85；Mega 8；Mega9；Zwittergent3-08；Zwittergent3-10；Triton X-405；己基-，庚基-，辛基-和壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷；和庚基硫代吡喃葡萄糖苷；其中辛基β-D-吡喃葡萄糖苷和吐溫20是最優選的。去汙劑在去汙劑溶液中的濃度典型地是約100mM-約2M，優選地是約200mM-約1.5M。
將陽離子脂質和核酸典型地進行結合從而產生約1∶1-約20∶1比率，優選地約1∶1-約12∶1比率，以及更優選地約2∶1-約6∶1比率的電荷比率(+/-)。另外，在溶液中的質粒總濃度將典型地是約25μg/mL-約1mg/mL，優選地是約25μg/mL-約500μg/mL，並且更優選地是約100μg/mL-約250μg/mL。在一段時間內，在去汙劑溶液中使核酸與陽離子脂質的結合典型地保持在室溫，所述時間足夠被包被的複合體形成。或者，核酸和陽離子脂質可以在去汙劑溶液中結合併被加熱到達到約37℃的溫度。對於對溫度特別敏感的核酸，被包被的複合體可以在更低的溫度形成，所述溫度典型地低至約4℃。
在一個優選的實施方案中，在形成的SPLP或SNALP中的核酸與脂質的比率(質量/質量比率)的範圍在約0.01-約0.08之間。起始物質的比率也在這個範圍內，因為純化步驟典型地將未被包封的核酸以及空脂質體去除。在另一個優選的實施方案中，所述SPLP或SNALP製劑使用每10mg總脂質約約400μg核酸，或約0.01至約0.08，更優選地約0.04的核酸與脂質比率，比率對應於每50μg核酸，1.25mg的總脂質。
接著，使被包被的核酸-脂質複合體的去汙劑溶液與非陽離子脂質接觸從而提供核酸-脂質複合體和非陽離子脂質的去汙劑溶液。有效用在該步驟中的非陽離子脂質包括，二醯基磷脂醯膽鹼，二醯基磷脂醯乙醇胺，神經醯胺，神經鞘磷脂，腦磷脂，心磷脂和腦苷脂。在優選的實施方案中，所述非陽離子脂質是二醯基磷脂醯膽鹼，二醯基磷脂醯乙醇胺，神經醯胺或神經鞘磷脂。在這些脂質中的醯基基團優選地是衍生自具有C10-C24碳鏈的脂肪酸的醯基基團。更優選地，所述醯基基團是月桂醯、肉豆蔻醯、棕櫚醯、硬脂醯或油醯。在特別優選的實施方案中，所述非陽離子脂質將是1，2-sn-二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)，棕櫚醯油醯磷脂醯膽鹼(POPC)，卵磷脂醯膽鹼(EPC)，二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)，膽甾醇，或其混合物。在最優選的實施方案中，所述核酸-脂質顆粒將是在體內具有提高特性的融合顆粒，所述非陽離子脂質將是DSPC或DOPE。如上所闡釋，本發明的核酸-脂質顆粒將還包含PEG-DAA綴合物。此外，本發明的核酸-脂質顆粒還可包含膽甾醇。
用於本發明方法的非陽離子脂質的量典型地是約0.5-約10mg的總脂質比上50μg的核酸。優選地，總脂質的量是每50μg的核酸約1-約5mg。
形成核酸-脂質複合體和非陽離子脂質的去汙劑溶液後，優選地通過透析來去除去汙劑。去汙劑的去除導致圍繞核酸的脂質雙層的形成，從而提供血清穩定性的核酸-脂質顆粒，所述顆粒具有約50nm-約150nm的大小。因此形成的顆粒不聚集並且任選地以大小排列(size)以獲得均一顆粒大小。
可以通過任一可獲得的方法來對血清穩定性的核酸-脂質顆粒進行大小排列以獲得按粒度分級的脂質體。可以進行按粒度分級從而獲得理想的大小範圍並且相對較窄的顆粒大小分布。
可獲得一些技術從而對所述顆粒進行按大小排列到理想的大小。用於脂質體並等同地可應用於本發明顆粒的一個大小排列的方法描述於美國專利號4,737,323，將其併入本文作為參考。通過水浴或探針超聲波處理對顆粒混懸液進行超聲波處理來產生進行性的顆粒大小減少為少於約50nm的大小。勻漿法是依賴於剪切力將更大的顆粒斷裂為更小的顆粒的另一個方法。在一個典型的勻漿方法中，通過標準的乳狀液勻漿器使顆粒再循環直到觀察到典型地在約60和80nm之間的選定顆粒大小。在兩種方法中，顆粒大小分布可以通過常規雷射束顆粒大小辨別，或QELS來進行監測。
通過小孔聚碳酸酯膜或不對稱的陶瓷膜來擠壓顆粒也是將顆粒大小減少到相對充分定義的大小分布的有效方法。典型地，通過膜來將混懸液循環一次或數次直到獲得理想的顆粒大小分布。可以通過連續更小孔的膜來擠壓所述顆粒從而獲得大小的逐漸減少。
在另一組實施方案中，本發明提供製備血清穩定性核酸-脂質顆粒的方法，所述方法包括(a)在有機溶劑中製備包括陽離子脂質和非陽離子脂質的混合物；(b)使核酸的水溶液與步驟(a)中的所述混合物接觸從而提供清晰的單相；和(c)移去所述有機溶劑來提供核酸-脂質顆粒的混懸液，其中所述核酸被包封在脂雙層中，所述顆粒在血清中是穩定的並且具有約50-150nm的大小。
用於該組實施方案中的核酸(例如，質粒)，陽離子脂質和非陽離子脂質如對於上述去汙劑透析方法所描述的。
對於有機溶劑的選擇將典型地包括對溶劑極性和所述溶劑可在顆粒形成的後期被去除的容易性的考慮。也可被用作溶解劑的有機溶劑以足以提供質粒和脂質的清晰單相混合物的量存在。合適的溶劑包括，但不限於，氯仿、二氯甲烷、二乙醚、環己烷、環戊烷、苯、甲苯、甲醇或其它脂族醇諸如丙醇、異丙醇、丁醇、叔-丁醇、異丁醇、戊醇和己醇。兩種或更多溶劑的組合也可用在本發明中。
通過將核酸的第一溶液，其典型地是水溶液和脂質的第二有機溶液混和在一起來完成核酸與陽離子和非陽離子脂質的有機溶液接觸。本領域技術人員將理解可以通過許多方法，例如通過機械方式諸如通過使用渦旋混和器來使該混和發生。
在核酸已經與脂質的有機溶液接觸後，去除所述有機溶劑，因此形成血清穩定性核酸-脂質顆粒的水性混懸液。用於去除有機溶劑的方法將典型地包括在減壓下蒸發或將惰性氣體(例如，氮或氬氣)的氣流鼓風吹過所述混合物。
因此形成的血清穩定性核酸脂質顆粒將典型地大小在約50nm和150nm之間。為了獲得進一步的顆粒中大小減少或大小的均一性，可以按照如上所述進行按大小排列。
在其它的實施方案中，所述方法將還包括添加非脂質聚陽離子，其可用於利用本發明的組合物影響細胞的轉化。合適的非脂質聚陽離子的實例包括，但不限於，海地美溴銨(hexadimethrine bromide)(商標名POLYBRENE下，從Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，Wisconsin，USA購得)或其它heaxadimethrine的鹽。其它合適的聚陽離子包括，例如，聚-L-鳥氨酸，聚-L-精氨酸，聚-L-賴氨酸，聚-D-賴氨酸，聚烯丙胺和聚乙烯亞胺的鹽。
在一些實施方案中，在將核酸包封在SPLP或SNALP中之前，可以將聚陽離子用於壓縮核酸。例如，可以將聚陽離子(例如，聚乙烯亞胺)用作冷凝劑從而形成如在WO 00/03683中描述的PEI-濃縮的DNA複合體。
在某些實施方案中，可以在單相系統(例如，Bligh和Dyer單相或水性和有機溶劑的類似混合物)或兩相系統中進行核酸-脂質顆粒的形成，伴以合適的混和。
當在單相系統中進行複合體的形成時，陽離子脂質和核酸每個都溶解在一體積的單相混和物中。兩種溶液的組合提供單一混合物，複合體形成在所述混合物中。或者，所述複合體可以在兩相混合物中形成，在所述兩相混合物中，陽離子脂質與核酸(其出現在水相中)結合，並將其「推」到有機相中。
在另一個實施方案中，本發明提供製備核酸-脂質顆粒的方法，所述方法包括(a)使核酸與包括非陽離子脂質和去汙劑的溶液接觸以形成核酸-脂質混合物；(b)使陽離子脂質與核酸-脂質混合物接觸從而中和核酸的負電荷的部分並形成核酸和脂質的中和電荷的核酸的混合物；和(c)使去汙劑從電荷被中和的混合物中去除從而提供脂質-核酸顆粒，其中所述核酸被保護免於降解。
在一組實施方案中，非陽離子脂質和去汙劑的溶液是水溶液。通過將核酸的第一溶液與脂質和去汙劑的第二溶液混和在一起來典型地完成核酸與非陽離子脂質和去汙劑的溶液接觸。本領域技術人員將理解通過許多方法，例如通過機械方式諸如通過使用渦旋混合器該混和可以發生。優選地，所述核酸溶液還是去汙劑溶液。用在本發明方法中的非陽離子脂質的量典型地基於所用的陽離子脂質的量進行確定，並典型地是陽離子脂質的量的約0.2-5倍，優選地是所用的陽離子脂質的量的約0.5-約2倍。
將因此形成的核酸-脂質混合物與陽離子脂質接觸從而中和負電荷部分，其與存在的核酸(或其它聚陰離子物質)關聯。所用的陽離子脂質的量將典型地足以中和所述核酸的至少50％的負電荷。優選地，所述負電荷將至少有70％被中和，更優選地有至少90％被中和。有效用在本發明中的陽離子脂質包括，例如DODAC，DOTMA，DDAB，DOTAP，DC-Chol和DMRIE。這些脂質和相關的類似物已經在同時待審的USSN 08/316,399和美國專利號5,208,036，5,264,618，5,279,833和5,283,185中有所描述，將其說明書併入本文作為參考。另外，許多陽離子脂質的商業製劑是可獲得的並且可以使用在本發明中。這些包括，例如，LIPOFECTIN(可商購的陽離子脂質體，包括DOTMA和DOPE，來自GIBCO/BRL，Grand Island，NewYork，USA)；LIPOFECTAMINE(可商購的陽離子脂質體，其包括DOSPA和DOPE，來自GIBCO/BRL)；和TRANSFECTAM(可商購的陽離子脂質，其包括在乙醇中的DOGS，來自Promega Corp.，Madison，Wisconsin，USA)。
可以通過許多技術的任一個，優選地通過將陽離子脂質的溶液和包含所述核酸-脂質混合物的溶液混合在一起，來完成陽離子脂質與核酸-脂質混合物的接觸。在將兩種溶液混和(或以任一個其它方式接觸)後，與核酸關聯的負電荷部分被中和。但是，核酸仍舊保持在未壓縮的狀態並獲得親水特性。
在陽離子脂質已經與核酸-脂質混合物接觸後，將去汙劑(或去汙劑和有機溶劑的組合)去除，因此形成所述脂質-核酸顆粒。用於去除去汙劑的方法將典型地包括透析。當有機溶劑存在時，通過在減壓下蒸發或通過將惰性氣體(例如，氮氣或氬氣)的氣流鼓風吹過混合物來典型地成功去除它。
因此形成的顆粒將典型地從約100nm到數微米來按大小排列。為了進一步獲得在所述顆粒中大小減少或大小的均一性，可以將所述脂質-核酸顆粒進行超聲波處理、過濾或進行其它用在脂質體製劑中並且是本領域技術人員所熟知的大小排列技術。
在其它實施方案中，該方法將還包括添加非脂質聚陽離子，其可用於利用本發明的組合物影響細胞的脂質轉染。合適的非脂質聚陽離子的實例包括，海地美溴銨(商標名POLYBRENE下，從Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，Wisconsin，USA購得)或其它heaxadimethrine的鹽。其它合適的聚陽離子包括，例如，聚-L-鳥氨酸，聚-L-精氨酸，聚-L-賴氨酸，聚-D-賴氨酸，聚烯丙胺和聚乙烯亞胺的鹽。這些鹽的添加優選地在顆粒已經形成後進行。
在另一方面，本發明提供製備核酸-脂質顆粒的方法，所述方法包括(a)在溶液中使一定量的陽離子脂質與核酸接觸；所述溶液包括約15-35％的水和約65-85％的有機溶劑並且陽離子脂質的量足以產生從約0.85-約2.0的+/-電荷比率，從而提供疏水脂質-核酸複合體；(b)在溶液中使疏水，脂質-核酸複合體與非陽離子脂質接觸從而提供核酸-脂質混合物；和(c)從脂質-核酸混合物去除有機溶劑從而提供脂質-核酸顆粒，其中核酸被保護免於降解。
有效用在本發明該方面中的所述核酸、非陽離子脂質、陽離子脂質和有機溶劑與對於上面使用去汙劑的方法所述的那些相同。在一組實施方案中，步驟(a)的溶液是單相的。在另一組實施方案中，步驟(a)的溶液是兩相的。
在優選的實施方案中，所述陽離子脂質是DODAC，DDAB，DOTMA，DOSPA，DMRIE，DOGS或其組合。在其它優選的實施方案中，非陽離子脂質是ESM，DOPE，DOPC，DSPC，基於聚乙二醇的聚合物(例如，PEG2000，PEG 5000，PEG-修飾的二醯基甘油，或PEG修飾的二烷氧基丙基)，二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)，膽甾醇或其組合。在其它優選的實施方案中，有機溶劑是甲醇、氯仿、二氯甲烷，乙醇，二乙醚或其組合。
在一個特別優選的實施方案中，核酸是質粒；所述陽離子脂質是DODAC，DDAB，DOTMA，DOSPA，DMRIE，DOGS或其組合；所述非陽離子脂質是ESM，DOPE，PEGs-DAAs，二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)，膽甾醇，或其組合(例如DSPC和PEGs-DAAs)；並且所述有機溶劑是甲醇、氯仿，二氯甲烷、乙醇、二乙醚或其組合。
如上，優選地通過機械方式諸如通過使用渦旋混和器將核酸的第一溶液，和脂質的第二溶液混和在一起，來典型地完成所述核酸與陽離子脂質的接觸。得到的混合物包含如上所述的複合體。接著，通過添加非陽離子脂質和去除有機溶劑來將這些複合體轉化成顆粒。非陽離子脂質的添加通過簡單將非陽離子脂質的溶液添加到包含所述複合體的混合物中典型地完成。還可以使用反向添加。可以通過本領域那些技術人員已知的方法來完成有機溶劑的隨後的去除並也如上所述。
使用在本發明該方面中的非陽離子脂質的量典型地是用於提供電荷被中和的脂質-核酸複合體的陽離子脂質的量(基於摩爾基礎)的約0.2-約15倍。優選地，所述量是所用的陽離子脂質的量的約0.5-約9倍。
在另一方面中，本發明提供脂質-核酸顆粒，其通過如上所述的方法進行製備。在這些實施方案中，所述脂質-核酸顆粒是淨電荷中性的或攜帶總電荷，所述總電荷給所述顆粒提供更大的基因脂轉染活性。優選地，顆粒的核酸組分是編碼所需蛋白質或阻斷不需要蛋白質的產生的核酸。在一個優選的實施方案中，核酸是質粒，非陽離子脂質是卵神經鞘磷脂並且所述陽離子脂質是DODAC。在特別優選的實施方案中，所述核酸是質粒，所述非陽離子脂質是DSPC和膽甾醇的混合物，並且所述陽離子脂質是DOTMA。在其它特別優選的實施方案中，所述非陽離子脂質還可包括膽甾醇。
如本文所討論的進行多種製備SPLP-CPLs(包含CPL的SPLPs)或SNALP-CPL’s(包含CPL的SNALPs)的通用方法。兩種通用技術包括「插入後」技術，即將CPL插入，例如預形成的SPLP或SNALP中，和「標準」技術，其中在例如，SPLP或SNALP形成步驟中，CPL被包括在脂質混合物中。所述插入後技術導致這樣的SPLPs，所述SPLPs主要在SPLP或SNALP雙層膜的外面中具有CPLs，而標準技術提供這樣的SPLPs或SNALPs，其在內面和外面都具有CPLs。
具體而言，「插入後」包括在適合的條件下(優選地在60℃2-3小時)，在CPL存在的情況下，形成SPLPs或SNALPs(通過任何方法)，並溫育預形成的SPLPs或SNALPs。可以將介於60-80％之間的CPL插入接受小泡外小葉中，得到多達約5到10mol％(相對於總脂質)的最終濃度。所述方法尤其有用於由磷脂製成的小泡(其可以包含膽甾醇)，並且還有用於包含PEG-脂質(諸如PEG-DAAs)的小泡。
在「標準」技術的實例中，可以通過擠壓來形成本發明的CPL-SPLPs和CPL-SNALPs。在該實施方案中，包括CPL的所有的脂質被共同溶解在氯仿中，其接著在高真空後，在氮氣下被去除。所述脂質混合物在釋放的緩衝液中被水合，並通過兩個具有100nm孔大小的聚碳酸酯濾器進行擠壓。得到的SPLPs或SNALPs在內面和外面上都包含CPL。在另一個標準技術中，CPL-SPLPs或CPL-SNALPs的形成可以使用去汙劑透析或乙醇透析方法來成功完成，例如，如在美國專利號5,976,567和5,981,501中所討論的，將其都併入作為參考。
本發明的核酸-脂質顆粒可以單獨或在具有生理可接受的載體(諸如生理鹽水或磷酸鹽緩衝液)的混合物中進行施用，所述生理可接受的載體按照施用路徑和標準的藥用實踐來選擇。一般地，生理鹽水將被應用作為藥用載體。其它合適的載體包括，例如水，緩衝的水，0.4％的鹽水，0.3％的甘氨酸等，包括增加穩定性的糖蛋白，諸如白蛋白，脂蛋白，球蛋白等。
藥用載體通常是在顆粒形成後被添加的。因此，在顆粒形成後，所述顆粒可以被稀釋到藥用載體諸如普通鹽水中。
在藥用製劑中顆粒的濃度可以在廣泛範圍內變化，即從少於約0.05重量％，通常在或至少約2-5重量％到多至10-30重量％，並將按照選定的特定施用方式主要通過液體體積、粘度等進行選擇。例如，可以將濃度增加以降低與治療相關的流體負荷。這可以在患有與動脈粥樣硬化相關的充血性心力衰竭或嚴重高血壓病的患者中是特別理想的。或者，由刺激性脂質組成的顆粒可以被稀釋到低濃度從而在施用位點減少炎症。
如上所述，本發明的核酸-脂質顆粒包含PEG-DAA綴合物。包括其它組分通常是理想的，所述其它組分以與PEG-DAA綴合物相似的方式作用，並作用於阻止顆粒聚集和提供增加循環生存期限以及增加核酸-脂質顆粒到靶組織的傳遞的方式。這些組分包括，但不限於，PEG-脂質綴合物，諸如到顆粒中的PEG-神經醯胺或PEG-磷脂(諸如PEG-PE)，神經節苷脂GM1-修飾的脂質或ATTA-脂質。典型地，顆粒中成分的濃度將是約1-20％並且更優選地從約3-10％開始。
本發明的藥物組合物可以通過常規，眾所周知的滅菌技術進行滅菌。可以對水溶液進行包裝以進行使用或在無菌條件下進行過濾並冷凍乾燥，在施用前將所述冷凍乾燥的製劑與無菌水溶液結合。所述組合物可以如合適的生理條件所要求包含藥用輔助物質，所述輔助物質諸如pH調節劑和緩衝劑，毒性調節劑等，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀和氯化鈣。另外，所述顆粒混懸液可以包括脂質-保護性試劑，其在儲存時，保護脂質免於自由基和脂質-過氧化損傷。親脂性自由基猝滅劑，諸如α生育酚和水溶性鐵特異性螯合劑，諸如鐵草銨是合適的。
在其應用的另一個實例中，脂質-核酸顆粒可以被結合到廣泛的局部劑型中，所述劑型包括，但不限於，凝膠，油，乳劑等。例如，包含核酸-脂質顆粒的混懸液可以被配製並且被作為局部乳膏，糊，軟膏，凝膠，洗劑等進行施用。
一旦形成，本發明的血清穩定性核酸-脂質顆粒用於將核酸引入細胞中。因此，本發明還提供將核酸(例如，質粒)引入細胞的方法。所述方法通過首先如上所述形成顆粒，接著使顆粒與細胞接觸一段時間來在體外或在體內進行，所述時間足以使轉染發生。
本發明的核酸-脂質顆粒可以被吸附於幾乎任何與它們那混和或接觸的細胞類型。一旦被吸附，所述顆粒可以被所述細胞的部分所胞吞，與細胞膜交換脂質，或與細胞融合。顆粒的核酸部分的轉移或結合可以通過這些途徑的任何一種發生。具體而言，當發生融合時，顆粒的膜被整合到細胞膜中並且所述顆粒的內容物與細胞內流體結合。
使用本發明的ERP測定，可以對SPLP或其它的基於脂質的載體系統的轉染效率進行優化。更具體地，ERP測定的目的是基於它們對內體膜的結合/吸收或與其的融合/不穩定化的相對影響來區分各種陽離子脂質和SNALPs的輔助脂質成分的作用。該測定可從數量上確定SPLP的每個組分或其它基於脂質的載體系統怎樣實現轉染效率，由此使SPLP或其它的基於脂質的載體系統優化。如上解釋，內體釋放參數，或備選地，ERP被定義為受體基因表達/細胞SPLP吸收/細胞將容易對於本領域那些技術人員而言是顯而易見的是可以使用任何報告基因(例如，螢光素酶、β-半乳糖苷酶、綠色螢光蛋白等)。此外，可以用任何可檢測的標記來標記脂質成分(或，備選地，SPLP的任何組分或基於脂質的製劑)，提供抑制或對吸收到細胞中的幹擾。使用本發明的ERP測定，本領域技術人員可以評價各種脂質成分(例如，陽離子脂質，非陽離子脂質，PEG-脂質衍生物，PEG-DAA綴合物，ATTA-脂質衍生物，鈣，CPLs，膽甾醇，等)對細胞吸收和轉染效率的影響，由此優化SPLP或其它基於脂質的載體系統。通過比較各種SPLPs的每種或其它基於脂質的製劑，可以容易地確定優化的系統，例如，SPLP或其它基於脂質的製劑，其在細胞中具有最大的吸收，伴對最大的轉染效率。
進行本發明的ERP測定的合適的標記包括，但不限於，光譜標記，諸如螢光染料(例如，螢光素和衍生物，諸如異硫氰酸螢光素(FITC)和OregonGreenθ；若丹明和衍生物，諸如德克薩斯紅，四若丹明異硫氰酸酯(tetrarhodimine isothiocynate)(TRITC)，等，洋地黃毒苷，生物素，藻紅蛋白，AMCA，CyDyesθ等；放射性標記，諸如3H，125I，35S，14C，32P，33P，等；酶諸如辣根過氧化物酶，鹼性磷酸酶等；光譜比色標記諸如膠態金或有色玻璃或塑料珠，諸如聚苯乙烯，聚丙烯，膠乳等。使用本領域眾所周知的方法，可以將標記直接或間接與SPLP的組分或其它的基於脂質的載體系統進行偶聯。如上指出，可以使用廣泛種類的標記，其中取決於所需的敏感性，與SPLP的組分綴合的容易性，穩定性需求和可獲得的使用儀器和處理方案來選擇標記。
V.包含PEG-DAA綴合物的脂質體除了上述的SPLP製劑之外，本發明的PEG-DAA綴合物可以用在空脂質體或如本文所述的包含一種或多種生物活性劑的脂質體的製劑中，包括，例如本文所述的治療性產物。脂質體還典型地包括陽離子脂質和非陽離子脂質。在一些實施方案中，脂質體還包含甾醇(例如，膽甾醇)。
A.脂質體製劑可以用於製備脂質體的多種方法描述在，例如Szoka，et al.，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.，9467(1980)，美國專利號4,186,183，4,217,344，4,235,871，4,261,975，4,485,054，4,501,728，4,774,085，4,837,028，4,946,787，PCT公開號WO 91/17424，Deamer和Bangham，Biochim.Biophys.Acta，443629-634(1976)；Fraley，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，763348-3352(1979)；Hope，et al.，Biochim.Biophys.Acta，81255-65(1985)；Mayer，et al.，Biochim.Biophys.Acta，858161-168(1986)；Williams，et al.，Proc.Natl.AcadSci.，85242-246(1988)，the text Liposomes，Marc J.Ostro，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1983，Chapter 1，和Hope，et al.，Chem.Phys.Lip.，4089(1986)中，將它們全部都併入作為參考。適合的方法包括，但不限於，超聲波，擠壓，高壓/勻漿，微觀流體化(microfluidization)，去汙劑透析，小脂質體小泡的鈣誘導的融合，和醚-浸入方法，這些方法都是本領域眾所周知的。
一種方法產生多層的非均質大小的小泡。在該方法中，小泡-形成脂質被溶解在適合的有機溶劑或溶劑系統中並且在真空下或惰性氣體下被乾燥從而形成薄的脂質薄膜。如果需要，所述薄膜可以被再次溶解在適合的溶劑中，諸如叔丁醇，並接著被冷凍乾燥從而形成更均一的脂質混合物，其以更容易水合的粉末樣形式存在。該薄膜被覆蓋以水性緩衝溶液並且容許水合，典型地在15-60分鐘的時期內，伴隨攪拌。得到的多層小泡的大小分布可以通過在更劇烈的攪拌條件下使脂質水合或通過添加增溶去汙劑，諸如脫氧膽鹽(酯)來向更小的尺寸進行轉變。
可以通過超聲波或擠壓法來製備單層的小泡。通常用尖端(tip)超聲波儀，諸如Branson尖端(tip)超聲波儀在冰浴中來進行聲波振蕩。典型地，所述混懸液進行強烈的聲波振蕩循環。擠壓可以在生物膜擠壓機諸如Lipex Biomembrane Extruder上進行。在擠壓濾器中的限定的孔大小可以產生具體大小的單層的脂質體小泡。通過不對稱陶瓷濾器，諸如商購自Norton Company，Worcester MA的Ceraflow Microfilter進行的擠壓也可以形成脂質體。還可以通過將磷脂溶解在乙醇中並接著將脂質注射到緩衝液中，導致脂質同時形成單層小泡來製備單層小泡。此外，磷脂可以溶解在去汙劑，例如膽酸酯(鹽)，Triton X，或正烷基葡糖苷中。將所述藥物添加到被溶解的脂質-去汙劑膠束中後，通過許多可能的方法中的任一種來去除去汙劑，所述方法包括，透析，凝膠過濾，親和色譜法，離心和超濾。
在製備脂質體後，在配置過程中沒有經過大小篩分的脂質體可以被按照大小排列從而獲得理想的大小範圍和相對較窄的脂質體大小分布。約0.2-0.4微米的大小範圍使脂質體混懸液通過常規濾器以過濾方法進行滅菌。如果，所述脂質體已經被按大小篩分到約0.2-0.4微米，過濾滅菌方法可以在高通量基礎上進行。
可以獲得數種將脂質體篩分到所需大小的技術。一種篩分方法描述在美國專利號4,737,323中，將其併入作為參考。通過水浴或探測器聲波振蕩來對脂質體混懸液進行聲波處理將大小逐漸減少到少於約0.05微米大小的小單層小泡。勻漿法是依賴於剪切力將大脂質體斷裂為更小脂質體的另一種方法。在典型的勻漿方法中，通過標準的乳劑勻漿器將多層小泡進行再循環直到觀察到選定的脂質體大小，典型地介於約0.1和0.5微米之間。通過準電子光散射(QELS)來確定脂質體小泡的大小，如在Bloomfield，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.，10421-450(1981)中所描述的，將其併入作為參考。通過聲波處理形成的脂質體，可以減少平均的脂質體直徑。不連續的聲波振蕩循環可以與QELS評價交替進行從而指導有效的脂質體合成。
通過小孔聚碳酸酯膜或不對稱的陶瓷膜來擠壓脂質體也是將脂質體大小減少到相對充分限定的大小分布的有效方法。典型地，所述混懸液通過膜循環一次或多次直到獲得所需的脂質體大小分布。所述脂質體可以通過連續地更小孔的膜進行擠壓從而獲得脂質體大小的之間減少。對於在本發明中的使用，具有約0.05微米到約0.40微米範圍內大小的脂質體是優選的。在特別優選的實施方案中，脂質體介於約0.05和約0.2微米之間。
在優選的實施方案中，使用本領域那些技術人員已知的常規方法來製備空的脂質體。
B.將脂質體用作遞送載體本發明的藥物遞送組合物(例如，脂質體，膠束，脂質-核酸顆粒，病毒體等)對於治療劑或生物活性劑的全身或局部遞送是有用的，並且在診斷分析中也是有用的。
下列討論通常關於脂質體；然而，對於本領域技術人員而言將容易變得顯而易見的是這種相同的討論對於本發明的其它藥物遞送系統(例如，膠束，病毒體，核酸-脂質顆粒(例如，SNALP和SPLP)，等，使用本發明的PEG-DAA綴合物，它們都可以被有利地形成)是可以充分應用的。
對於治療劑或生物活性劑的遞送，包含PEG-DAA的脂質體組合物可以加載以治療劑並被施用於需要治療的受試者。使用本發明的組合物和方法進行施用的治療劑可以是被選擇用於待治療的疾病的適合治療的多種藥物的任一種。通常，藥物將是抗腫瘤藥，諸如長春新鹼(以及其它的長春花屬生物鹼)，多柔比星，米託蒽醌，喜樹鹼，順鉑，博來黴素，環磷醯胺，甲氨蝶呤，鏈佐星等。尤其優選的抗腫瘤藥包括，例如，放線菌素D，長春新鹼，長春花鹼，胱氨酸阿拉伯糖苷，蒽環黴素，烷化劑，鉑化合物，抗代謝藥，和核苷類似物，諸如甲氨蝶呤和嘌呤和嘧啶類似物。使用本發明的化合物和方法來將抗感染藥遞送到具體組織中也可以是理想的。本發明的組合物還可以用於選擇性地遞送其它藥物，包括，但不限於，局部麻醉藥，例如，地布卡因和氯丙嗪；β-腎上腺素阻斷藥，例如，普萘洛爾，噻嗎洛爾和拉貝洛爾；抗高血壓藥，例如可樂定和肼屈嗪；抗抑鬱藥，例如，丙米嗪，阿米替林和多塞平；anti-conversants，例如，苯妥英；抗組胺藥，例如苯海拉明，chlorphenirimine和異丙嗪；抗生素/抗菌劑，例如，慶大黴素，環丙沙星，和頭孢西丁；抗真菌劑，例如，咪康唑，特康唑，益康唑，異康唑，butaconazole，克黴唑，伊曲康唑，制黴菌素，nafiifine和兩性黴素B；殺寄生蟲藥，激素，激素拮抗劑，免疫調節劑，神經遞質拮抗劑，抗青光眼藥，維生素，麻醉劑和顯象劑。
如上提及，陽離子脂質可以用在治療基因或寡核苷酸的遞送中，其意欲在細胞中誘導或阻斷一些蛋白質的產生。核酸是帶負電荷的並且可以與帶正電荷的本體結合從而形成SPLP，其適合於製劑和如上所述的核酸的細胞遞送。
本發明的PEG-DAA綴合物的另一個臨床應用是作為佐劑用於對動物和人的免疫。出於免疫目的，可以將蛋白質抗原，諸如白喉類毒素，霍亂毒素，寄生抗原，病毒抗原，免疫球蛋白，酶和組織相容性抗原結合到包含本發明的PEG-DAA綴合物的脂質體中或附著於其上。
包含本發明的PEG-DAA綴合物的脂質體作為疫苗的載體也是特別有用的，其將靶向適合的淋巴器官以刺激免疫應答。
包含本發明的PEG-DAA綴合物的脂質體還可以被用作載體，其將免疫抑制劑或免疫刺激劑選擇性地遞送到巨噬細胞。具體而言，使用本發明的脂質體，可以將用於抑制巨噬細胞活性的糖皮質激素和激活巨噬細胞的淋巴因子進行遞送。
可以將包含本發明的PEG-DAA綴合物和包含靶分子的脂質體用於刺激或抑制細胞。例如，結合具體抗原的脂質體可以用於刺激特異性結合抗原的B細胞群體展示表面抗體。在脂質體表面上結合生長因子或淋巴因子的脂質體可以定向於刺激表達這些因子的適合受體的細胞。使用這種方法，骨髓細胞可以作為癌症患者的治療的部分被刺激增殖。
可以將包含本發明的PEG-DAA綴合物的脂質體用於遞送任何產物(例如，治療劑，診斷用藥，標記或其它化合物)，所述產物包括目前被配製在PEG-衍生的脂質體中的那些。
在某些實施方案中，理想的是使用特異於細胞類型或組織的靶向部分來靶向本發明的脂質體。使用多種靶向部分，諸如配體，細胞表面受體，糖蛋白，維生素(例如核黃素)和單克隆抗體靶向脂質體在以前已經進行了描述(見，例如，美國專利號4,957,773和4,603,044，將其教導併入本文作為參考)。所述靶向部分可以包括完整的蛋白或其部分。
靶向機制通常需要靶向試劑以這樣的方式定位在脂質體的表面上，從而使靶向部分能夠與所述靶，例如，細胞表面受體相互作用。在一個實施方案中，所述脂質體被設計為將連接體部分在脂質體形成的時候結合到膜中。所述連接體部分必須具有被牢固包埋和錨定在膜中的親脂性部分。其必須還具有在脂質體的水性表面上的可通過化學方法獲得的親水性部分。對所述親水性部分進行選擇從而在化學上適合於靶向試劑，從而使所述部分和試劑形成穩定的化學鍵。因此，連接體部分通常延伸出脂質體的表面，並且被進行構造以正確定位靶向試劑。在某些情形中，可能的是將靶向試劑直接連接於連接體部分，但是在許多情形中，其必須更適合於使用第三分子來充當「分子橋」。所述橋連接連接體部分和離開脂質體表面的靶向試劑，由此使靶向試劑可自由地獲得與細胞靶相互作用。
可以使用偶聯靶向試劑的標準方法。例如，可以使用磷脂醯乙醇胺，其可以被激活從而連接靶向試劑，或使用衍生化的親脂性化合物，諸如脂質-衍生的博來黴素。使用，例如，結合蛋白質A的脂質體可以構建抗體-靶向的脂質體(見，Renneisen，et al.，J.Bio.Chem.，26516337-16342(1990)I和Leonetti，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，872448-2451(1990))。靶向部分的實例還可以包括，特異於細胞組分的其它蛋白質，包括與贅生物或腫瘤相關的抗原。可以通過共價鍵來將用作靶向部分的蛋白質連接於脂質體。見，Heath，Covalent Attachment of Proteins to Liposomes，149 Methodsin Enzymology 111-119(Academic Press，Inc.1987)。其它靶向方法包括生物素-抗生物素蛋白系統。
在某些情形中，脂質體的診斷靶向可以隨後用於治療被靶向的細胞或組織。例如，當毒素與被靶向的脂質體偶聯時，所述毒素可以接著有效破壞被靶向的細胞，諸如腫瘤細胞。
C.將脂質體用作診斷用藥可以用標誌物對使用本發明的PEG-DAA綴合物製備的藥物遞送組合物，例如脂質體進行標記，所述標誌物將促進各種疾病狀態的診斷成像，所述疾病包括腫瘤，發炎的關節，病變等。典型地，儘管還可以使用螢光標記，這些標記將是放射性標誌物。使用γ-輻射放射性同位素是特別有利的，因為它們可以容易地在井式閃爍計數器中進行計數，在計數前不需要組織勻漿並且可以用γ照相機成像。
典型地使用γ-或正子輻射的放射性同位素，諸如作為γ-輻射的.99Tc，24Na，51Cr，59Fe，67Ga，86Rb，111In，125I，和195pt；諸如作為正子輻射的68Ga，82Rb，22Na，75Br，122I和18F。出於體內診斷的目的，還可以用順磁同位素來標記脂質體，如通過使用磁共振成像(MRI)或電子自旋共振(ESR)。見，例如，美國專利號4,728，575，將其的教導併入本文作為參考。
D.脂質體的加載將常規藥物加載到脂質體中的方法包括，例如，包封技術，加載到雙層和跨膜電勢加載方法。
在一個包封技術中，藥物和脂質體組分溶解在有機溶劑中，其中所有的種類是可混合的並且被濃縮以形成乾燥的薄膜。接著，將緩衝液加入乾燥的薄膜中並且形成藥物被結合到小泡的壁中的脂質體。備選地，將所述藥物置於緩衝液中並且加入僅有脂質成分的乾燥的薄膜中。以這種方式，藥物將被包封在脂質體的水性內部。用在形成脂質體中的緩衝液可以是任何生物相容性的緩衝溶液，例如等滲鹽水，磷酸鹽緩衝液，或其它低離子強度的緩衝液。通常，藥物將以從約0.01ng/mL到約50mg/mL的量存在。接著將得到的脂質體如上所述任選地進行按大小排列，所述脂質體具有結合在水性內部或在膜中的藥物。
跨膜電勢加載方法已經詳細描述在美國專利號4,885,172，5,059,421，和5,171,578中，將其內容併入本文作為參考。簡而言之，跨膜電勢加載方法可以用於基本上任何常規藥物，所述藥物當溶解在適合的水性介質中時，可以以帶電狀態存在。優選地，藥物將是相對親脂性的從而將分配到脂質體膜中。跨膜電勢通過脂質體或蛋白質-脂質體復活體的雙層產生，並且所述藥物以跨膜電勢的方式被加載。跨膜電勢通過穿過膜產生對於一個或多個帶電種類(例如，Na+，K+和/或H+)的濃度梯度來產生。該濃度梯度通過產生具有不同的內部和外部介質的脂質體來產生並且具有相關的質子梯度。藥物累積可以接著以通過Henderson-Hasselbach方程預期的方式發生。
可以按照標準技術來將本發明的脂質體組合物施用於受試者。優選地，脂質體組合物的藥物組合物經腸胃外，即腹膜內地，靜脈內地，皮下地或肌內地進行施用。更優選地，所述藥物組合物通過推注注射來靜脈內地進行施用。用在本發明中的適合的製劑見於Remington′s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Company，Philadelphia，Pa.，17th ed.(1985)。可以將藥物組合物用於，例如診斷多種疾病，或治療多種疾病狀態(諸如炎症，感染(病毒性和細菌性感染)，贅生物，癌症等)。
優選地，將藥物組合物進行靜脈內施用。因此，本發明提供用於靜脈內施用的組合物，其包括脂質體懸浮在可接收的載體，優選地水性載體中的溶液。可以使用多種水性載體，例如，水，緩衝的水，0.9％的等滲鹽水，等。這些組合物可以通過常規，眾所周知的滅菌技術進行滅菌，或可以過濾除菌。可以將得到的水溶液原樣使用或進行冷凍乾燥，所述冷凍乾燥的製劑在施用前與滅菌的水溶液進行組合。根據大致生理條件，所述組合物可以包含藥用輔助物質，諸如pH調節和緩衝劑，毒性調節劑，溼潤劑等，例如，乙酸鈉，乳酸鈉，氯化鈉，氯化鉀，氯化鈣，脫水山梨醇單月桂酸酯，三乙醇胺油酸酯等。
根據選定的施用的具體模式，在藥物製劑中的脂質體組合物的濃度可以在廣泛範圍內變化，即，從少於約0.05重量％，通常在或至少約2-5重量％到多至10到30重量％並將主要根據流體體積，粘度等進行選擇。對於診斷，施用的組合物的量將取決於所用的具體標記(即，放射性標記，螢光標記，等)，被診斷的疾病狀態和臨床醫師的判斷，但是將通常在每公斤體重約1和約5mg之間。
本發明將通過具體實施例的方式更詳細地進行描述。下列實施例是出於舉例說明的目的進行提供，並且不意欲以任何方式限制本發明。那些本領域技術人員將容易地認識到可以被改變或修改從而產生基本上相同的結果的多種非關鍵參數。
實施例實施例1PEG-二烷氧基丙基(PEG-DAA′s)的合成隨後的實施例舉例說明了三種PEG-脂質，PEG-A-DMA(7)，PEG-C-DMA(8)，和PEG-S-DMA(9)的合成。它們具有共同的前體，胺脂質1，2-肉豆蔻基氧基丙胺(5)。該脂質具有烷基鏈14碳單元(C14)的長度。適合於本發明的其它的PEG DAAs可以使用相似的方案進行合成。例如，使用(5)的C18類似物可以合成PEG-A-DSA和PEG-C-DSA。在起初步驟中(化合物(1)的合成)可以通過簡單用等克分子量的硬脂醯溴化物取代肉豆蔻基溴化物來合成C18類似物。
1.1，2-二肉豆蔻基氧基-3-烯丙氧基丙(1)的製備 將苯(250ml)加入95％的氫化鈉(11.4g，450.0mmol)，用氮氣衝洗燒瓶，並進行密封。將3-烯丙氧基-1，2-丙二醇(6.6g，50.0mmol)的苯(75ml)溶液加入燒瓶中。使用注射器，將97％的1-溴四癸烷(36.7ml，120.0mmol)加入燒瓶中並在持續的氮氣流下使反應留待回流過夜。一旦被冷卻到室溫，將過量的氫化鈉用乙醇緩慢淬火直到沒有觀察到進一步的泡騰。將溶液轉移到具有苯(250ml)的分液漏鬥中，並用蒸餾水洗滌(3×200ml)。用硫酸鎂對有機層進行乾燥並在旋轉蒸發儀上去除溶劑從而產生無色的油。TLC(5％醚-己烷，在鉬酸鹽中顯影)說明大多數起始材料已經反應形成了產物。通過快速柱層析法(1-5％醚-己烷)對得到的產物進行進一步的純化以產生15.0g(57.3％)的1，2-二肉豆蔻基氧基-3-烯丙氧基丙烷(1)。
2.1，2-二肉豆蔻基氧基丙烷3-醇(2)的製備 將1，2-二肉豆蔻基氧基-3-烯丙氧基丙烷1(15.0g，28.6mmol)溶解在乙醇(250ml)中。加入三氟乙酸(20ml)，隨後加入四(三苯基膦)鈀(0)(4.5g，3.9mmol)。用錫紙包裹燒瓶並用氮氣衝洗它以減少與光和空氣的接觸，然後在80℃攪拌過夜。在旋轉蒸發儀上去除乙醇。TLC(100％CHCl3，在鉬酸鹽中顯影)說明大多數起始材料已經反應形成了產物。通過快速柱層析法(100％DCM)對得到的產物進行進一步的純化以產生11.5g(83.1％)的1，2-二肉豆蔻基氧基-丙烷-3-醇2。
3.O-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)甲磺酸(methanesulphonate)(3)的製備
用氮氣洗滌包含97％甲磺酐(methanesulphonic anhydride)(8.4g，48.0mmol)的燒瓶並溶解在無水二氯甲烷(50ml)中。緩慢加入無水吡啶(3.9ml，48.0mmol)，形成白色沉澱。將1，2-二肉豆蔻基氧基丙烷-3-醇15(11.5g，24.0mmol)的無水二氯甲烷(100ml)溶液加入，並於室溫將反應攪拌過夜。將溶液轉移到轉移到具有二氯甲烷(100ml)的分液漏鬥中，用蒸餾水洗滌(3×100ml)。接著用二氯甲烷(100ml)將合併的水性洗滌物進行反萃取。用硫酸鎂對合併的有機層進行乾燥並在旋轉式氣化氣上去除二氯甲烷以產生無色的油。TLC(100％CHCl3，在鉬酸鹽中顯影)說明起始材料都已經反應形成了產物。該反應產生了11.9g的粗製O-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)甲磺酸(3)。
4.N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)苯鄰二甲醯亞胺的製備(4) 將粗製O-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)甲磺酸3(14.2g，25.3mmol)和苯鄰二甲醯亞胺鉀(13.9g，75.0mmol)用氮衝洗並溶解在無水N，N-二甲基甲醯胺(250ml)中。將所述反應於70℃在穩定的氮氣流下攪拌過夜。使用高真空泵取代通常的吸氣器在旋轉蒸發儀上去除N，N-二甲基甲醯胺。將殘餘物溶解在氯仿(300ml)中並將其轉移到用氯仿漂洗(50ml)的分液漏鬥中，接著用蒸餾水和乙醇(3×300ml蒸餾水，50ml乙醇)洗滌。用氯仿對合併的水性洗滌物進行反萃取(2×100ml)。用硫酸鎂對合併的有機層進行乾燥並在旋轉蒸發儀上去除氯仿。TLC(30％醚-己烷，在鉬酸鹽中顯影)顯示起始物質已經反應形成產物。該反應產生13.5g的粗製N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)苯鄰二甲醯亞胺4。
5.1，2-二肉豆蔻基氧基丙胺(5)的製備
將粗製N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)苯鄰二甲醯亞胺4(20.0g，25.0mmol)溶解於乙醇(300ml)。加入一水合肼(20ml，412.3mmol)並將所述反應回流過夜。在旋轉蒸發儀上去除所述乙醇並將所述殘餘物溶解在氯仿中(200ml)。過濾所述沉澱物並在旋轉蒸發儀上去除氯仿。TLC(10％MeOH-CHCl3，在鉬酸鹽中顯影)說明大多數起始物質已經反應以形成產物。通過快速柱層析法(0-5％MeOH-CHCl3)對該得到的產物進行進一步的純化以產生10.4g(89.7％，來自1，2-二肉豆蔻基氧基丙烷-3-醇2的三個步驟)的1，2-二肉豆蔻基氧基丙胺(5)。
6.甲氧基PEG2000乙酸(6)的製備 將10％的濃縮的硫酸(20ml)水(180ml)溶液加入重鉻酸鈉(3.0g，10mmol)。將PEG2000甲醚(20.0g，10mmol)溶解在這種鮮橙色溶液中，並將反應在室溫進行攪拌過夜。接著，用氯仿(3×250ml)對所述產物進行抽提，將深藍色留在水層中。在旋轉蒸發儀上去除氯仿溶劑，得到淡藍色蠟。TLC(13％MeOH-CHCl3，在碘中顯影)顯示大多數起始物質已經反應形成產物。接著，通過快速柱層析法(0-15％MeOH-CHCl3)對這種粗製物質進行進一步的純化。接著，將得到的產物在醚中進行結晶以產生5.6g(27.1％)的白色固體形式的甲氧基PEG2000乙酸6。
7.N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)醯胺PEG2000甲醚(7)的製備 對於N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)醯胺PEG2000甲醚(即，PEG-A-DMA)的製備，將甲氧基PEG2000乙酸6(3.4g，1.7mmol)溶解在苯(40ml)中並用氮氣衝洗。通過注射器和針穿過subaseal將草醯氯(1.7ml.2.5g，20mmol)緩慢加入。將該反應攪拌2小時，接著在旋轉蒸發儀上將苯溶劑去除。將2，3-肉豆蔻基基氧基丙胺5(0.87g，1.8mmol)加入燒瓶中，隨後加入無水二氯甲烷(40ml)和三乙胺(1.5ml，10mmol)。將反應攪拌48小時。加入蒸餾水(250ml)，用鹽酸(1.5ml)對所述溶液進行酸化並進行搖動，收集有機層。用氯仿(2×65ml)從水層中抽提產物。用硫酸鎂對合併的有機層進行乾燥。在旋轉蒸發儀上去除氯仿從而產生黃色固體。TLC(10％MeOH-CHCl3，在硫酸銅和碘中顯影)說明大多數起始物質已經反應以形成產物。通過快速柱層析法(0-7％MeOH-CHCl3)對粗製物質進行進一步的純化。接著通過加入活性炭(2g)和乙醇(100ml)對其進行漂白並將所述混合物在旋轉蒸發儀上於55℃旋轉30分鐘。將炭濾去並在旋轉蒸發儀上去除乙醇。將所述產物進行冷凍乾燥以產生1.7g蓬鬆白色粉末形式的(38.1％)的N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)醯胺PEG2000甲醚7。
8.N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)氨基甲酸酯PEG2000甲醚(8)的製備
對於N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)氨基甲酸酯PEG2000甲醚(即PEG-C-DMA)的製備，按照上述1-5步驟進行。接著用氮氣衝洗PEG2000甲醚(2.0g，1.0mmol)並將其溶解在無水二氯甲烷(15ml)中。加入雙光氣(300μl，2.5mmol)並將所述反應在室溫攪拌3小時。在旋轉蒸發儀上去除二氯甲烷並使用高真空泵將任何殘餘的雙光氣去除。用氮氣衝洗所述燒瓶並加入2，3-二肉豆蔻基氧基丙胺5(0.7g，1.5mmol)。將此溶解在無水二氯甲烷(15ml)中，並加入三乙胺(280μl)，將該反應在室溫攪拌過夜。將該溶液轉移到具有二氯甲烷(5ml)的分液漏鬥中並用蒸餾水洗滌(2×20ml)。用硫酸鎂乾燥有機層並在旋轉蒸發儀上去除二氯甲烷。TLC(3％MeOH-CHCl3，在鉬酸鹽和碘中顯影)顯示大多數起始物質已經反應形成了產物。通過快速柱層析法(1.5-10％MeOH-CHCl3)對得到的產物進行進一步的純化以得到1.2g(46.5％)的N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)氨基甲酸酯PEG2000甲醚8。
9.N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)琥珀醯胺PEG2000甲醚(13)的製備對於N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)琥珀醯胺PEG2000甲醚(13)的製備，按照上述1-5步驟進行。剩下的步驟按照」a.PEG2000甲磺酸酯(9)的製備 甲磺醯酐(8.2g，47.1mmol)溶解在無水氯仿(80ml)中。將吡啶(3.8ml，47.0mmol)加入所述溶液中並觀察到發煙同時有白色沉澱物形成。將PEG2000甲醚(31.5g，15.5mmol)的無水氯仿(70ml)溶液加入，將該反應攪拌3小時。將已經形成的白色沉澱物濾去並在旋轉蒸發儀上去除過濾物的氯仿溶劑。TLC(5％MeOH-CHCl3，在碘中顯影)顯示大多數起始物質已經反應以形成產物。通過快速柱層析法(0-10％MeOH-CHCl3)對該產物進行進一步的純化以產生白色固體形式的30.1g(92.8％)的PEG2000甲磺醯9。
b.PEG2000苯鄰二甲醯亞胺(10)的製備 將苯鄰二甲醯亞胺鉀(11.1g，59.7mmol)溶解在無水N，N-二甲基甲醯胺(400ml)中。將PEG2000甲磺醯9(35.0g，16.7mmol)的無水N，N-二甲基甲醯胺溶液(100ml)加入燒瓶中並使該反應於75℃攪拌過夜。使用高真空泵取代通常的吸氣器來在旋轉蒸發儀上去除N，N-二甲基甲醯胺溶劑。將得到的產物溶解在二氯甲烷(250ml)中並用蒸餾水(2×250ml)和鹽水(250ml)進行洗滌。將二氯甲烷溶劑的合併有機層在旋轉蒸發儀上進行去除。TLC(7％MeOH-CHCl3，用UV光和Mary’s試劑觀察)顯示大多數起始物質已經反應形成產物。通過快速柱層析法(0-10％MeOH-CH2Cl2)對得到的產物進行進一步的純化。將該產物從醚中進行結晶以產生19.4g(54.1％)的PEG2000苯鄰二甲醯亞胺10。
c.PEG2000胺(11)的製備
將PEG2000苯鄰二甲醯亞胺10(10.3g，4.8mmol)溶解在乙醇(200ml)中。將一水合肼(6.0ml，123.7mmol)緩慢加入並將反應在100℃回流過夜。將白色沉澱物濾去並在旋轉蒸發儀上去除乙醇溶劑。將得到的產物溶解在氯仿中並將在氯仿中不溶的剩餘白色固體濾去，再次將氯仿在旋轉蒸發儀上去除。TLC(10％MeOH-CHCl3，在碘，鉬酸鹽和Mary’s試劑中顯影)說明所有的起始物質已經反應以形成產物。接著，將該產物從醚中結晶以產生白色粉末形式的9.0g(93.0％)的PEG2000胺11。
d.PEG2000琥珀醯胺(12)的製備 將PEG2000胺11(9.0g，4.4mmol)和琥珀酐(3.8g，38.1mmol)溶解在吡啶(100ml)中並將該反應攪拌過夜。將吡啶溶劑在旋轉蒸發儀上於60℃進行去除。將所述殘餘物溶解在蒸餾水(100ml)中，並用鹽酸進行酸化，用二氯甲烷進行抽提(100ml，2×70ml)，用硫酸鎂進行乾燥。TLC(10％MeOH-CHCl3，在碘中顯影)說明大多數起始物質已經反應形成了產物。通過快速柱層析法(0-10％MeOH-CHCl3)對該產物進行進一步的純化以產生5.2g(55.9％)的PEG2000琥珀醯胺12。
e.N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)琥珀醯胺PEG2000甲醚(13)的製備
將PEG2000琥珀醯胺(2.0g，0.9mmol)和N-羥基琥珀醯胺(0.2g，2.0mmol)溶解在無水氯仿(10ml)中。接著，將1，3-二環己基-碳二亞胺(0.3g，1.5mmol)的無水氯仿(5ml)溶液加入，並將所述反應攪拌1小時。加入1，2-二肉豆蔻基氧基丙胺5(0.48g，1.0mmol)的無水氯仿(5ml)和三乙胺(0.6ml，4mmol)的溶液中，將反應攪拌1小時。TLC(12％MeOH-CHCl3，在鉬酸鹽中顯影)說明大多數起始物質已經反應形成了產物。將溶液通過具有二氯甲烷的硅藻土進行過濾，用鹽酸進行酸化，並用蒸餾水(2×50ml)和鹽水(50ml)進行洗滌。將水層用二氯甲烷(50ml)進行反萃取，並在硫酸鎂上來乾燥合併的有機層。通過(my)快速柱層析法(0-7％MeOH-CHCl3)來對所述產物進行進一步的純化以產生1.8g(69.0％)的N-(2，3-二肉豆蔻基氧基丙基)琥珀醯胺PEG2000甲醚13。
為了檢驗它們的穩定性，將C18PEG-脂質的每個配製在空的脂質體中並貯存於37℃恆溫箱達42天。所述脂質體以括號中的相關摩爾比率包含下列脂質膽甾醇(55％)，1，2-二油基氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷(15％)，1，2-二硬脂醯-sn-甘油-3-膽鹼磷酸(20％)，PEG-脂質(10％)。此外，配製PEG-CerC20和商業生產的PEG-DSPE，同時配製PEG-DSG作為對照。在不同時間點，從恆溫箱中移出每個樣品的等份試樣，用乙醇稀釋並用HPLC進行分析從而確定存在的具體PEG2000脂質的濃度。將蒸發光散射檢測器用作檢測的方法。將結果顯示於圖2。
實施例2.被包封在SPLP中的核酸的表達，所述SPLP包括PEG-二烷氧基丙基綴合物該實施例描述這樣的實驗，所述實驗比較被包封在包含PEG-二醯基甘油綴合物的SPLP中的核酸對比被包封在包含PEG-二烷氧基丙基綴合物的SPLP中的核酸的表達。所有的SPLP製劑包括在CMV啟動子控制下編碼螢光素酶的質粒(pLO55)。
所有的SPLP製劑包含pL055和DSPC∶Chol∶DODMA∶PEG-脂質(20∶55∶15∶10)。下列製劑由APBS(pH 7.4).
BL055PEG-DSG SPLP，0.50mg/ml.
CL055PEG-DSPE SPLP，0.50mg/ml.
DL055PEG-神經醯胺C20SPLP，0.50mg/ml.
EL055PEG-A-DSA SPLP，0.50mg/ml.
FL055PEG-C-DSA SPLP，0.50mg/ml.
GL055PEG-S-DSA SPLP，0.50mg/ml製作。
在第0天，將在50μl PBS中的1.5×106Neuro2A細胞皮下施用給每隻小鼠。在第13天，小鼠被隨機安排並通過靜脈內(IV)注射用1劑量的SPLP製劑或PBS進行處理。劑量的量基於在給藥日每天進行的體重測量。在SPLP施用後48小時，將小鼠稱重並進行處死，並收集它們的血液，收集下列組織腫瘤，肝(切成兩半)，肺，脾和心臟，進行稱重，立即冷凍並貯存於-80℃直到進一步分析。
通過測定被表達的螢光素酶報告蛋白的酶促活性來確定在收集的組織中的基因表達。將結果顯示於圖3和4中。
結果證明在i.v.注射SPLP後48小時，包含PEG-二烷氧基丙基綴合物的SPLP在腫瘤中的轉染水平與那些包含PEG-二醯基甘油綴合物的SPLP的轉染水平基本相似。用包含PEG-二烷氧基丙基綴合物的SPLP注射的小鼠和用包含PEG-二醯基甘油綴合物的SPLP注射的小鼠的器官(肝，肺，脾和心臟)中的基因表達的量基本相似。
實施例3.被包封在SPLP中的核酸的表達，所述SPLP包括PEG-二烷氧基丙基綴合物該實施例描述這樣的實驗，所述實驗比較被包封在SPLP中的核酸的表達，所述SPLP包括PEG-二烷氧基丙基綴合物。所有的SPLP製劑包括在CMV啟動子控制下編碼螢光素酶的質粒(pLO55)。
所述脂質(DSPC∶CHOL∶DODMA∶PEG-脂質)在SPLP中以隨後的摩爾比(20∶55∶15∶10)存在。下列的製劑由A無菌過濾的PBS，5mL.
B具有PEG-DSG的pL055-SPLP，2mL，0.50mg/mL.
C具有PEG-A-DSA的pL055-SPLP，2mL，0.50mg/mL.
D具有PEG-A-DPA的pL055-SPLP，2mL，0.50mg/mL.
E具有PEG-A-DMA的pL055-SPLP，2mL，0.50mg/mL.製作。
在第0天，將1.5×106Neuro2A細胞施用給每隻小鼠。當腫瘤是合適天小(200-400mm3)時，小鼠被隨機安排並通過靜脈內(IV)注射用1劑量的SPLP製劑或PBS進行處理。劑量的量基於在給藥日每天進行的體重測量。在SPLP施用後48小時，將小鼠處死，並收集它們的血液，收集下列組織腫瘤，肝(切成兩半)，肺，脾心臟，進行稱重，立即冷凍並貯存於-80℃直到進一步分析。
通過測定被表達的螢光素酶報告蛋白的酶促活性來確定在收集的組織中的基因表達。將結果顯示於圖5和6中。
結果說明包括PEG-二烷氧基丙基(即，PEG-DAA)的SPLP可以方便地用於將遠端腫瘤轉染到與包括PEG-二醯基甘油的SPLP相同的程度。而且，用包含PEG-二烷基甘油的SPLP所見的轉染水平與用包含PEG-二醯基甘油(例如，PEG-DSG)的SPLP所見的那些相似。結果還說明在非腫瘤組織中發生非常低的轉染。而且，與其它SPLP製劑相比，包括PEG-二烷氧基丙基的SPLP顯示減少的毒性。
實施例4被包封在包含PEG-二烷氧基丙基綴合物的SPLP和pSPLP中的核酸的表達該實施例描述這樣的實驗，所述實驗比較了被包封在包含PEG-二烷氧基丙基的SPLP中的核酸對比與SPLP比較的PEI濃縮的DNA(pSPLP)中的核酸的表達。
所有製劑含有DSPC∶Chol∶DODMA∶PEG-DAG(20∶55∶15∶10)。製備下列製劑APBS(pH 7.4)
BL055PEG-DSG pSPLP，0.5mg/mlCL055PEG-DPG pSPLP，0.43mg/mlDL055PEG-DMG pSPLP，0.5mg/mlEL055PEG-A-DSA pSPLP，0.5mg/mlFL055PEG-A-DPA pSPLP，0.5mg/mlGL055PEG-A-DMA pSPLP，0.5mg/mlHL055PEG-A-DSA SPLP，0.5mg/mlIL055PEG-A-DPA SPLP，0.5mg/mlJL055PEG-A-DMA SPLP，0.5mg/mlKL055PEG-A-DMA SPLP，2.1mg/ml在第0天，將在50μl PBS中的1.5×106Neuro2A細胞皮下施用給每隻小鼠。在第13天，小鼠被隨機安排並通過靜脈內(IV)注射用1劑量的SPLP製劑或PBS進行處理。劑量的量基於在給藥日當天進行的體重測量。在SPLP施用後48小時，將小鼠稱重並進行處死，並收集它們的血液，收集下列組織腫瘤，肝(切成兩半)，肺，脾和心臟，進行稱重，立即冷凍並貯存於-80℃直到進一步分析。
通過測定被表達的螢光素酶報告蛋白的酶促活性來確定在收集的組織中的基因表達。將結果顯示於圖7和8中。
結果說明與長鏈形式(即，PEG-DSG和PEG-A-DSA)比較，在pSPLP中的短鏈PEG-脂質(即，PEG-DMG和PEG-A-DMA)的存在在腫瘤轉染上導致了約5-10倍的減少。這些結果在一起說明，當pSPLP包含C14PEG-脂質時，觀察到的pSPLP(C18PEG-脂質)對腫瘤轉染超過SPLP的提高被完全取消。這可以是由於許多因素(1)當PEG-脂質離開pSPLP的雙層時，pSPLP穩定性的增加，(2)在PEG-脂質去除後電荷的增加，或(3)C14PEG-脂質的條件沒有被優化(例如，在雙層中陰離子脂質的量)。如果這些中的任何一種在組織中，還需要進行其它的實驗來確定是那一種。此外，對於所有的系統而言，在其它被測試的器官中的活性是相當低的。有趣的是，20mg/kg劑量的PEG-A-DMA SPLP給出的腫瘤中的螢光素酶基因表達的水平與5mg/kg劑量所給出的腫瘤中的螢光素酶基因表達水平相當，但是與相同的5mg/kg劑量相比，在肝中的基因表達高得多。
實施例5用SNALPS使基因表達沉默該實施例舉例說明在共施用SPLPs和SNALPs後，在具有Neuro 2A腫瘤的小鼠中的基因表達的沉默，所述SPLPs包含在CMV啟動子控制下編碼螢光素酶的質粒，所述SNALPs包含抗-螢光素酶siRNA。
在第0天，以在50μL磷酸鹽緩衝溶液總體積中1.5×106細胞的劑量，用Neuro 2A細胞對36隻雄性A/J小鼠(Jackson Laboratories)進行皮下接種。一旦腫瘤達到合適大小後(典型地在第9天或其後)，將200-240μl的PBS或如上述實施例6描述所製備的SPLP，SNALP製劑(總共100μg核酸)進行靜脈內施用。在施用PBS，SPLP或SPLP和SNALP的混合物24，48或72小時後，將小鼠處死，收集器官(例如，肝、肺、脾、腎、心臟)和腫瘤並進行螢光素酶活性的評價。
在單一iv給藥後48小時，pL055 SPLP和抗-luc siRNA SNALP(都包含PEG-A-DMA)的共施用最大地減少螢光素酶基因表達達40％。結果顯示於圖13中。
實施例6包含PEG-DAA綴合物的SPLP的吸收該實施例舉例說明在體外，哺乳動物細胞對包含PEG-DAA綴合物的SPLP的吸收。下表提出的SPLP製劑用3H-CHE進行標記，並且在4℃或37℃被溫育於細胞上達24小時。SPLP包含2，4，或10mol％PEG-C-DMA。
SPLP的吸收在37℃發生的效率更高，並且PEG-C-DMA的量減少。將數據舉例說明於圖14。
實施例7包含PEG-DAA綴合物的SPLP的生物分布和血液清除率該實施例舉例說明包含PEG-DAA綴合物的SPLP的生物分布和血液清除率。包含PEG-C-DMA或PEG-C-DSA的3H-CHE-標記的SPLP被靜脈內施用於攜帶Neuro-2a腫瘤的雄性A/J小鼠中。如下配製SPLP
在SPLP施用48小時後確定SPLP在肝，脾，肺和腫瘤中的生物分布。將結果顯示於圖15中。
在SPLP施用後1，2，4和24小時後確定SPLP的血液清除率。將結果顯示於圖16中。
實施例8包含PEG-DAA綴合物的SPLP和SNALP的生物分布和血液清除率該實施例舉例說明包含PEG-DAA綴合物的SPLP和SNALP的生物分布和血液清除率。包含PEG-C-DMA或PEG-C-DSA的3H-CHE-標記的SPLP或SNALP被靜脈內施用於攜帶Neuro-2a腫瘤的雄性A/J小鼠中。SPLP包括被包封的編碼螢光素酶的質粒，SNALP包括被包封的抗螢光素酶siRNA序列。SPLP和SNALP製劑都具有下列脂質比率DSPC 20％膽甾醇55％PEG-脂質10％DODMA 15％。
在SPLP或SNALP施用後24小時，確定SPLP或SNALP在肝，脾，腎上腺，腫瘤，小腸，淋巴結，腎，大腸，股骨，心臟，胸腺，睪丸和腦中的生物分布。將結果顯示於圖17。
在施用SPLP和SNALP後1，2，4，8，和24小時確定包含PEG-C-DMA或PEG-C-DSA的SPLP和SNALP的血液清除率。將結果顯示於圖18中。
實施例9包含PEG-DAA綴合物的SPLP和pSPLP對細胞的轉染該實施例描述了三個單獨的實驗，進行所述實驗來評價在用各種包封了質粒的SPLP製劑體內轉染後，在器官和腫瘤中的基因表達，所述質粒在CMV啟動子的控制下編碼螢光素酶。
第一個實驗評價在靜脈內施用SPLP和pSPLP後，在攜帶Neuro2A腫瘤的雄性A/J小鼠中的螢光素酶基因表達。比較包含C14和C18PEG-C-DAAs的製劑與等價的PEG-DAGs。PEG部分具有2000道爾頓的分子量。DODMA被用作SPLP中的陽離子脂質。將POPG或DOP用作pSPLP中的陰離子脂質。如下配製SPLP和pSPLP
在靜脈內施用SPLP和pSPLP後48小時，在肝，肺，脾，心臟和腫瘤中測量螢光素酶基因表達。對於所有測試的SPLP和pSPLP製劑而言，相對於其它組織類型，螢光素酶的表達在腫瘤中最高。將結果顯示於圖19。
第二個實驗評價在靜脈內施用SPLP後，在攜帶Neuro2A腫瘤的雄性A/J小鼠中的螢光素酶基因表達，所述SPLP包括不同百分比(即，15％，10％，5％，或2.5％)的PEG-C-DMA。
在施用SPLP後48小時，測量在腫瘤中的螢光素酶的表達。將結果顯示於圖20。
第三組實驗評價在靜脈內施用SPLP後，在攜帶Neuro2A腫瘤的雄性A/J小鼠中的螢光素酶基因表達，所述SPLP包括具有不同大小的PEG部分的PEG-C-DMA綴合物(即，2000或750道爾頓)。
在施用SPLP後48小時，在肝，肺，脾，心臟和腫瘤中測量螢光素酶基因表達。對於所有測試的SPLP製劑而言，相對於其它組織類型，螢光素酶表達在腫瘤中最高。將結果顯示於圖21中。
實施例10在體外用包含PEG-DAA綴合物的SNALPs使基因表達沉默該實施例描述在體外在遞送包封siRNA的SNALP後，基因表達的沉默。在存在或缺乏氯喹的情況下，使表達螢光素酶的Neuro2A-G細胞與包封抗螢光素酶siRNA(即，siRNA，其包括下列序列GAUUAUGUCCGGUUAUGUAUU 並靶向DNA序列GATTATGTCCGGTTATGTATT)的SNALP製劑接觸達48小時。所述SNALP製劑包含不同量的PEG-C-DMA(C14)，即，1％，2％，4％，或10％。陽離子脂質是DODMA。
將結果顯示於圖22。
實施例11在體內用包含PEG-DAA綴合物的SNALPs使基因表達沉默該實施例描述這樣的實驗，其說明在體內，在施用包封siRNA的SNALP後，基因表達的沉默。
該實驗說明包封siRNA的SNALP的施用，可以使在轉移瘤中的基因表達沉默。用包含PEG-DAA綴合物和包封抗螢光素酶siRNA(即，siRNA包含下列序列GAUUAUGUCCGGUUAUGUAUU並靶向DNA序列GATTATGTCCGGTTATGTATT)的SNALPs處理攜帶Neuro-2a腫瘤的雄性A/J小鼠，所述小鼠表達螢光素酶，具有轉移性肝腫瘤。所有的SNALPs具有如下配製DSPC 20％∶膽甾醇55％∶PEG-C-DMA 10％∶DODMA15％。小鼠接受SNALP的單一靜脈內施用。在SNALP注射後48小時測定腫瘤中的螢光素酶表達。所述結果證明SNALP的施用可以在體內在SNALP施用的位點的遠端位點使基因表達沉默。將這些結果顯示於圖23中。
要理解的是上述描述意欲舉例說明而不是限制性的。在閱讀上述描述後，許多實施方案將對於本領域那些技術人員而言是顯而易見的。因此，本發明的範圍應該不是參考上述描述來確定，而是應該參考後附的權利要求連同被授予這些權利要求的等價物的充分範圍來確定。出於所有的目的，將所有的文章和參考文獻，包括專利申請，專利和PCT出版物的內容併入本文作為參考。
權利要求
1.一種式I的化合物，其具有如下結構 其中R1和R2被獨立地選擇並且是具有約10到約20個碳原子的烷基基團；PEG是聚乙二醇；和L是包含非酯的接頭部分。
2.按照權利要求1的化合物，其中所述烷基基團選自由月桂基(C12)，肉豆蔻基(C14)，棕櫚基(C16)，硬脂基(C18)和二十碳烷基(C20)組成的組。
3.按照權利要求1的化合物，其中R1和R2是相同的。
4.按照權利要求3的化合物，其中R1和R2都是肉豆蔻基(C14)。
5.按照權利要求3的化合物，其中R1和R2都是棕櫚基(C16)。
6.按照權利要求3的化合物，其中R1和R2都是硬脂基(C18)。
7.按照權利要求1的化合物，其中所述烷基基團是飽和的。
8.按照權利要求1的化合物，其中所述烷基基團是不飽和的。
9.按照權利要求1的化合物，其中所述PEG具有約550道爾頓到約10,000道爾頓的平均分子量。
10.按照權利要求9的化合物，其中所述PEG具有約750到約5,000道爾頓的平均分子量。
11.按照權利要求9的化合物，其中所述PEG具有約1,000到約5,000道爾頓的平均分子量。
12.按照權利要求9的化合物，其中所述PEG具有約1,500到約3,000道爾頓的平均分子量。
13.按照權利要求9的化合物，其中所述PEG具有約2,000道爾頓的平均分子量。
14.按照權利要求1的化合物，其中所述包含非酯的接頭部分是選自由醯氨基接頭部分，氨基接頭部分，羰基接頭部分，氨基甲酸酯接頭部分，脲接頭部分，醚接頭部分，二硫化物接頭部分，琥珀醯胺基接頭部分和其組合組成的組的成員。
15.按照權利要求1的化合物，其中所述包含非酯的接頭部分是氨基甲酸酯接頭部分。
16.按照權利要求1的化合物，其中所述包含非酯的接頭部分是醯氨基接頭部分。
17.按照權利要求1的化合物，其中所述包含非酯的接頭部分是琥珀醯胺基接頭部分。
18.一種脂質體，所述脂質體包含式I的聚乙二醇-二烷氧基丙基(PEG-DAA)綴合物，式I具有如下的結構 其中R1和R2被獨立地選擇並且是具有約10到約20個碳原子的烷基基團；PEG是聚乙二醇；和L是包含非酯的接頭部分。
19.按照權利要求18的脂質體，其還包含生物活性劑。
20.按照權利要求19的脂質體，其中所述生物活性劑是選自由抗腫瘤藥，抗生素，免疫調節劑，抗炎藥和作用在中樞神經系統上的藥劑組成的組的成員。
21.按照權利要求19的脂質體，其中所述生物活性劑是蛋白質或肽。
22.按照權利要求19的脂質體，其中所述生物活性劑是核酸。
23.一種將生物活性劑遞送給細胞的方法，所述方法包括將所述細胞與權利要求18的脂質體接觸，其中所述生物活性劑被包封在所述脂質體中。
24.一種將生物活性劑遞送給患者的方法，所述方法包括將權利要求18的脂質體施用於所述患者，其中所述生物活性劑被包封在所述脂質體中。
25.一種核酸-脂質顆粒，其包含核酸；陽離子脂質；非陽離子脂質；和式I的聚乙二醇-二烷氧基丙基(PEG-DAA)綴合物，其具有如下的結構 其中R1和R2被獨立地選擇並且是具有約10到約20個碳原子的烷基基團；PEG是聚乙二醇；和L是包含非酯的接頭部分。
26.按照權利要求25的核酸-脂質顆粒，其中所述陽離子脂質是選自由N，N-二油基-N，N-氯化二甲銨(DODAC)，N，N-二硬脂基-N，N-溴化二甲銨(DDAB)，N-(1-(2，3-二油醯氧基)丙基)-N，N，N-氯化三甲銨(DOTAP)，N-(1-(2，3-二油基氧基)丙基)-N，N，N-氯化三甲銨(DOTMA)，和N，N-二甲基-2，3-二油基氧基)丙胺(DODMA)，及其混合物組成的組的成員。
27.按照權利要求25的核酸-脂質顆粒，其中所述非陽離子脂質是選自由二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)，棕櫚醯油醯磷脂醯膽鹼(POPC)，卵磷脂醯膽鹼(EPC)，二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)，棕櫚醯油醯磷脂醯甘油(POPG)，膽甾醇，及其混合物組成的組的成員。
28.按照權利要求25的核酸-脂質顆粒，其中所述非陽離子脂質是陰離子脂質。
29.按照權利要求25的核酸-脂質顆粒，其中所述非陽離子脂質是中性脂質。
30.按照權利要求25的核酸-脂質顆粒，其中所述PEG-DAA綴合物是選自由PEG-二月桂基氧基丙基(C12)，PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(C14)，PEG-二棕櫚基氧基丙基(C16)，和PEG-二硬脂基氧基丙基(C18)組成的組的成員。
31.按照權利要求25的核酸-脂質顆粒，其中所述陽離子脂質構成存在於所述顆粒中的總脂質的約2％到約60％。
32.按照權利要求25的核酸-脂質顆粒，其中所述陽離子脂質構成存在於所述顆粒中的總脂質的約5％到約45％。
33.按照權利要求25的核酸-脂質顆粒，其中所述陽離子脂質構成存在於所述顆粒中的總脂質的約5％到約15％。
34.按照權利要求25的核酸-脂質顆粒，其中所述陽離子脂質構成存在於所述顆粒中的總脂質的約40％到約50％。
35.按照權利要求25的核酸-脂質顆粒，其中所述非陽離子脂質構成存在於所述顆粒中的總脂質的約5％到約90％。
36.按照權利要求25的核酸-脂質顆粒，其中所述非陽離子脂質構成存在於所述顆粒中的總脂質的約20％到約85％。
37.按照權利要求25的核酸-脂質顆粒，其中所述PEG-DAA綴合物構成存在於所述顆粒中的總脂質的1％到約20％。
38.按照權利要求25的核酸-脂質顆粒，其中所述PEG-DAA綴合物構成存在於所述顆粒中的總脂質的2％到約15％。
39.按照權利要求25的核酸-脂質顆粒，其中所述PEG-DAA綴合物構成存在於所述顆粒中的總脂質的4％到約10％。
40.按照權利要求25的核酸-脂質顆粒，其中所述非陽離子脂質是DSPC。
41.按照權利要求25的核酸-脂質顆粒，其還包含膽甾醇。
42.按照權利要求41的核酸-脂質顆粒，其中所述膽甾醇構成存在於所述顆粒中的總脂質的約10％到約60％。
43.按照權利要求41的核酸-脂質顆粒，其中所述膽甾醇構成存在於所述顆粒中的總脂質的約20％到約45％。
44.按照權利要求25的核酸-脂質顆粒，其中所述PEG-DAA綴合物是PEG-二月桂基氧基丙基(C12)。
45.按照權利要求25的核酸-脂質顆粒，其中所述PEG-DAA綴合物是PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(C14)。
46.按照權利要求25的核酸-脂質顆粒，其中所述PEG-DAA綴合物是PEG-二棕櫚基氧基丙基(C16)。
47.按照權利要求25的核酸-脂質顆粒，其中所述PEG-DAA綴合物是PEG-二硬脂基氧基丙基(C18)。
48.按照權利要求25的核酸-脂質顆粒，其中所述核酸是DNA。
49.按照權利要25的核酸-脂質顆粒，其中所述核酸是質粒。
50.按照權利要求25的核酸-脂質顆粒，其中所述核酸是反義寡核苷酸。
51.按照權利要求25的核酸-脂質顆粒，其中所述核酸是核酶。
52.按照權利要求25的核酸-脂質顆粒，其中所述核酸是小幹擾RNA(siRNA)。
53.按照權利要求25的核酸-脂質顆粒，其中所述核酸編碼目標治療性產物。
54.按照權利要求53的核酸-脂質顆粒，其中所述目標治療性產物是肽或蛋白質。
55.按照權利要求53的核酸-脂質顆粒，其中所述目標治療性產物是小幹擾RNA(siRNA)。
56.按照權利要求25的核酸-脂質顆粒，其中在所述核酸-脂質顆粒於37℃暴露於核酸酶20分鐘後，在所述顆粒中的核酸基本上沒有被降解。
57.按照權利要求25的核酸-脂質顆粒，其中在將所述核酸-脂質顆粒在血清中於37℃溫育30分鐘後，在所述顆粒中的核酸基本上沒有被降解。
58.按照權利要求25的核酸-脂質顆粒，其中所述核酸被完全包封在所述核酸-脂質顆粒中。
59.一種藥物組合物，其包含按照權利要求25的核酸-脂質顆粒和藥用載體。
60.按照權利要求59的藥物組合物，其中所述PEG-DAA綴合物是PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(C14)。
61.按照權利要求59的藥物組合物，其中所述PEG-DAA綴合物是PEG-二硬脂基氧基丙基(C18)。
62.一種將核酸引入細胞的方法，所述方法包括使所述細胞與核酸-脂質顆粒接觸，所述核酸-脂質顆粒包含陽離子脂質、非陽離子脂質、PEG-DAA綴合物和核酸。
全文摘要
本發明公開了聚乙二醇(PEG)二烷氧基丙基(DAA)脂質綴合物，與常用的PEG－脂質綴合物相比，其具有增加的穩定性。描述了包含所述PEG－DAA綴合物的脂質體組合物、穩定的質粒－脂質顆粒(SPLP)和穩定的核酸－脂質顆粒(SNALP)，其用於將生物活性劑遞送到細胞或患者中。
文檔編號C07C235/08GK1882693SQ200480033616
公開日2006年12月20日 申請日期2004年9月15日 優先權日2003年9月15日
發明者J·海斯, I·麥克拉克倫, 埃倫格雷絲·安貝吉亞 申請人:普洛體維生物治療公司