日本血吸蟲蛋白質及其應用的製作方法
2023-10-11 05:29:54
專利名稱：日本血吸蟲蛋白質及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種日本血吸蟲蛋白質及其應用。
背景技術：
血吸蟲病是一種人和動物都會受傳染的寄生蟲病，血吸蟲發育的不同階段，尾蚴、 童蟲、成蟲和蟲卵均可對宿主引起不同的損害和複雜的免疫病理反應，流行範圍廣，對人和 家畜均產生嚴重危害。目前，主要採用藥物，例如吡喹酮，對已經感染血吸蟲病的人或動物 進行治療，但是這不能解決再次感染的問題。要想更有效的防治血吸蟲病，比較可行的措施 是採用疫苗與藥物治療相結合的方式。因此，尋找新的疫苗候選抗原仍是當今血吸蟲疫苗 研究的重點之一。UDP-葡萄糖-4-差向異構酶(UDP-glucose-4-印imerase，GALE)主要參與半乳糖 代謝途徑，可以催化UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖的可逆反應，其重要性在於真核生物可以利 用UDP-葡萄糖來合成海藻糖、蔗糖、肝醣等多種糖類，為生物體的生長代謝提供能量供應。SjGALE是日本血吸蟲中編碼UDP-葡萄糖-4-差向異構酶的基因，目前尚沒有關於 該基因及其表達的蛋白質作為日本血吸蟲疫苗的相關報導。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種日本血吸蟲蛋白質，該蛋白質包含UDP-葡 萄糖-4-差向異構酶的部分胺基酸序列，具有免疫原性，可作為抗血吸蟲的疫苗候選抗原。此外，還需要提供一種日本血吸蟲蛋白質在製備預防或治療血吸蟲病的疫苗中的 應用。為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現在本發明的一個方面，提供了一種日本血吸蟲蛋白質，所述蛋白質具有免疫原性， 且包含SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列。在本發明的另一方面，提供了一種編碼上述日本血吸蟲蛋白質的核苷酸序列。優 選的，所述核苷酸序列為SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。在本發明的另一方面，還提供了一種抗血吸蟲疫苗，該疫苗包含上述日本血吸蟲 蛋白質。在本發明的另一方面，還提供了一種能與上述日本血吸蟲蛋白質特異性結合的抗 體。在本發明的另一方面，還提供了 一種包含上述核苷酸序列的重組載體。在本發明的另一方面，還提供了一種宿主細胞，包含上述重組載體，或已用上述核 苷酸序列轉化或轉染。在本發明的另一方面，還提供了上述日本血吸蟲蛋白質在製備預防或治療血吸蟲 病的疫苗中的應用。在本發明的另一方面，還提供了上述日本血吸蟲蛋白質在製備診斷血吸蟲病的產品中的應用。本發明具有免疫原性的日本血吸蟲蛋白質可以作為診斷抗原對血吸蟲病畜進行 診斷。在本發明的另一方面，還提供了上述日本血吸蟲核苷酸序列在製備預防或治療血 吸蟲病的疫苗中的應用。本發明日本血吸蟲蛋白質，在小鼠免疫保護性實驗中，使免疫組小鼠的減蟲率與 肝臟減卵率分別達到35. 7%和53% (與佐劑對照組相比)，表明本發明具有免疫原性的日 本血吸蟲蛋白質對血吸蟲病有良好的免疫預防效果，能有效降低宿主體內蟲體數目，更重 要的是肝臟內蟲卵數目的減少可以大大降低宿主肝臟的病理反應。
下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細的說明。圖1是本發明實施例1重組蛋白質表達與純化SDS-PAGE電泳圖；圖2是本發明實施例2重組蛋白質免疫原性Western blot檢測結果圖；圖3是本發明實施例4免疫動物血清特異性抗體水平檢測結果圖；圖4是本發明實施例5產生保護性的免疫反應類型分析圖。
具體實施例方式下列實施例中，未註明具體條件的實驗方法，通常按常規條件，如《分子克隆實驗 指南》(J.薩姆布魯克，D. W.拉塞爾著，黃培堂，汪嘉璽，朱厚礎，等譯.第3版，北京科學 出版社，200 中所述的方法進行。本發明對日本血吸蟲UDP-葡萄糖-4-差向異構酶基因(SjGALE)編碼的蛋白質進 行重組表達和純化，並將重組蛋白質進行免疫保護性實驗，驗證其對宿主的免疫保護效果， 為開發抗血吸蟲新疫苗和藥物提供候選抗原分子。實施例IrSjGALE重組蛋白質的表達和純化將日本血吸蟲UDP-葡萄糖-4-差向異構酶基因(SjGALE)的編碼序列(SEQ ID NO 2)插入原核表達載體pET28a(+)的多克隆酶切位點，構建成pET28a_SjGALE重組表達載體， 該重組表達載體經測序鑑定正確後進行下面的表達和純化步驟。1.重組蛋白質的原核表達1)取含有重組質粒單克隆菌落接種於含有相應抗生素的LB培養液中，37°C振蕩 培養過夜。2) 37°C振蕩培養至0D600達0.4-0. 6，加入IPTG至終濃度為ImM進行誘導表達。3)分別收集誘導前及誘導後的菌液，用SDS-PAGE電泳分析驗證，結果如圖1所 示，在圖1中，M 蛋白質分子量標準；1-5標註的泳道依次分別是大腸桿菌誘導前裂解 物，IPTG誘導蛋白表達後菌體裂解物，誘導表達的菌體裂解後上清，誘導表達的菌體裂解 後沉澱，過柱純化的融合蛋白。約39KD大小的條帶為目的蛋白(日本血吸蟲UDP-葡萄 糖-4-差向異構酶基因所編碼的蛋白質胺基酸序列如SEQ ID NO :1所示，重組載體表達出 的產物為包含部分載體序列6個組氨酸標籤和SEQ ID NO :1所示胺基酸序列的重組蛋白質 rSjGALE)。
2.可溶性蛋白的純化1)加有樹脂的His結合層析柱，依次用3倍柱床體積的無菌去離子水，5倍柱床體 積的IX離子化緩衝液(Charge buffer)，3倍體積的IX結合緩衝液洗滌柱子。2)將蛋白上柱。3)用10倍柱床體積的1 X結合緩衝液平衡柱子。4)用6倍柱床體積的1 X衝洗緩衝液洗滌。5)用6倍柱床體積的1 X洗提緩衝液洗脫目的蛋白。6)用6倍柱床體積的IX洗脫緩衝液洗滌柱子，用20%的酒精保存樹脂。7) SDS-PAGE檢測純化的蛋白。結果如圖1所示，表達的重組蛋白得到了純化(見圖1第「5」泳道箭頭所指的條 帶)，且純度較高。 實施例2重組蛋白質的免疫原性檢測1)將表達純化後的重組蛋白質跑SDS-PAGE電泳。2)剪與膠塊同樣大小硝酸纖維素膜和六層濾紙，並將硝酸纖維素膜和濾紙放入緩 衝液中侵泡；負極向正極依次放置三層濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜、三層濾紙；在槽中加滿 轉移緩衝液和冰袋，280mA，轉移池；3)電泳轉移結束後，將轉移好的硝酸纖維素膜放入3%牛血清白蛋白中4°C封閉 過夜；4)棄去封閉液，用TBST洗三次，每次IOmin ；5)加入1 200稀釋的抗日本血吸蟲成蟲可溶性抗原抗體(實驗室保存)作為一 抗，室溫孵育Ih;6) TBST 洗三次，每次 IOmin ；7)加入1 5000稀釋的HRP標記的羊抗兔抗體，室溫孵育Ih ；8) TBST 洗三次，每次 IOmin ；9)把濾膜放入增強型DAB底物顯色液中顯色，室溫下輕搖，蛋白條帶的顏色深度 達到要求後，立即用水漂洗，拍照、記錄實驗結果。Western blot檢測結果如圖2所示，在圖2中，M 蛋白質分子量標準；1 :rSjGALE 重組蛋白質。由圖2可知，rSjGALE重組蛋白質具有免疫原性。實施例3免疫保護性實驗1.動物免疫實驗1) BalB/C鼠，隨機分為2組，每組10隻。2)用日本血吸蟲SjGALE部分胺基酸序列(SEQ ID NO 1)的重組蛋白質rSjGALE 進行免疫保護試驗，同時設佐劑對照組。3)實驗每隻小鼠注射50μ g重組蛋白質與等體積的弗氏完全/不完全佐劑的混合 物，佐劑對照組注射PBS與佐劑混合物。每隔兩周免疫一次，共免疫三次，免疫前和每次免疫兩周後分別眼眶脈採血，分離 血清-20°C保存。4)三免後兩周，以每鼠30條尾蚴腹部皮膚貼片攻擊感染。5)攻擊42d後，肝門靜脈灌注衝蟲，計數蟲體數目和肝臟蟲卵數。
2.減蟲率計算統計各組蟲體數目，計算減蟲率
權利要求
1.一種日本血吸蟲蛋白質，其特徵在於，所述蛋白質具有免疫原性，且包含SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列。
2.編碼權利要求1所述日本血吸蟲蛋白質的核苷酸序列。
3.根據權利要求2所述的核苷酸序列，其特徵在於，所述核苷酸序列為SEQID N0:2所 示的核苷酸序列。
4.一種抗血吸蟲疫苗，其特徵在於，包含權利要求1所述的日本血吸蟲蛋白質。
5.一種能與權利要求1所述日本血吸蟲蛋白質特異性結合的抗體。
6.一種包含權利要求2所述核苷酸序列的重組載體。
7.一種宿主細胞，其特徵在於，包含權利要求6所述的重組載體，或已用權利要求2所 述核苷酸序列轉化或轉染。
8.權利要求1所述的日本血吸蟲蛋白質在製備預防或治療血吸蟲病的疫苗中的應用。
9.權利要求1所述的日本血吸蟲蛋白質在製備診斷血吸蟲病的產品中的應用。
10.權利要求2所述的日本血吸蟲核苷酸序列在製備預防或治療血吸蟲病的疫苗中的 應用。
全文摘要
本發明公開了一種日本血吸蟲蛋白質，該蛋白質具有免疫原性，且包含SEQ ID NO1所示的胺基酸序列。本發明還公開了該日本血吸蟲蛋白質在製備預防或治療血吸蟲病的疫苗中的應用。本發明的日本血吸蟲蛋白質，對血吸蟲病有良好的免疫預防效果，適於成為抗血吸蟲病的新疫苗。
文檔編號C07K14/44GK102079783SQ201010575768
公開日2011年6月1日 申請日期2010年12月6日 優先權日2010年12月6日
發明者劉萍萍, 劉金明, 林矯矯, 金亞美 申請人:中國農業科學院上海獸醫研究所