通過離子電滲療法遞送siRNA的方法

2023-10-27 01:58:02

專利名稱：通過離子電滲療法遞送siRNA的方法
通過離子電滲療法遞送siRNA的方法相關申請本申請要求2007年12月5日申請的美國臨時申請61/005，635的權益，所述申請 的全部內容通過引用結合到本文中。
背景技術：
寡核苷酸已被用來治療各種眼病。全身用製劑、局部用製劑和注射用製劑被用於 各種眼科疾病。特別是局部應用構成眼病無創遞送寡核苷酸中的最廣泛應用。然而，該方 法受生物利用度低所困，因此功效有限。小幹擾RNA(SiRNA)是一類用於治療各種眼病的雙鏈RNA寡核苷酸。然而，使用的 是可供siRNA擴散透過眼膜的眼用製劑，這類局部製劑受攝取慢、攝取量不足和攝取不均 勻的困擾。由於目前的眼部遞送方法只達到低的眼部暴露，因此需要頻率使用，而且組織順 應性十分重要。發明概述本發明涉及siRNA製劑以及用來使藥物遞送和患者安全最大化的方法。本發明涉 及適於眼部離子電滲療法(ocular iontophoresis)的siRNA製劑。這些新型製劑可用於治 療各種眼病。所述製劑能夠以不同的離子電滲劑量(例如電流水平和施用時間)使用。這 些溶液劑可以例如(1)適當緩衝以控制初始PH和終末pH，(2)使之穩定以控制保存期限 (化學穩定性)，和/或⑶包括調節摩爾滲透壓濃度的其它賦形劑。此外，精心製備siRNA 溶液劑以使存在的競爭離子降到最低。這些獨特的劑型可以滿足各種治療需要。眼部離子電滲療法是一種用於將有效量 的siRNA遞送到眼部組織的用於門診患者的新的無創方法。這種無創方法產生的結果與眼 部注射所達到的結果相當或更好。涉及眼部離子電滲療法的局部SiRNA應用已有記載。根據市售的局部應用於皮膚 的各種治療藥的鈮控離子電滲療法(columbie-controlled iontophoresis)，清楚了解到 即使對充分認識的藥品，用於離子電滲療法時也需要定製的製劑。這些改變使劑量療效最 大化，提高安全性，並且控制商業挑戰。已知的由皮膚病學應用提出的工藝製劑挑戰可轉移 到眼部遞送中。然而，眼部離子電滲療法提出了額外的製劑需要。因此，需要開發理想的適 於siRNA眼部離子電滲遞送的新型製劑。開發適於無創局部眼部遞送的siRNA將極大地拓 寬眼科醫師的治療選擇。一個實施方案涉及將治療上相關的寡核苷酸即小幹擾RNA(SiRNA)透鞏膜離子 電滲療法遞送至受治療者眼內的方法，所述方法包括下列步驟製備裝有寡核苷酸的含水 組合物的眼部離子電滲療法裝置；b.將所述裝置放置在眼球表面中部，與直流電發生器連 接，使得應用表面至少部分受到面向眼球光軸的外邊線凹面的限制，且其中該裝置的外壁 相對於光軸從外邊線向外延伸；和c.通過執行離子電滲療法將寡核苷酸給予受治療者眼 內，從而將寡核苷酸遞送到眼內。一個實施方案涉及通過透鞏膜離子電滲療法將有效量的SiRNA遞送至受治療者 眼內的方法，所述方法包括a)將裝置放置在受治療者眼球表面的中部，使得在該裝置和眼球間形成應用表面，其中所述裝置包含貯器，所述貯器裝有含有一種或多種siRNA分 子或其製劑的水溶液，且其中所述裝置與電發生器連接；和b)通過執行離子電滲療法將 siRNA給予受治療者眼內，從而將siRNA遞送至眼內。在一個具體的實施方案中，將裝置應 用於眼球表面至少部分受到面向眼球光軸的外邊線凹面的限制，且其中該裝置的外壁相對 於光軸從外邊線向外延伸。在一個具體的實施方案中，siRNA的長度介於約15個和約30個 核苷酸之間。在一個具體的實施方案中，siRNA的長度介於約21個和約23個核苷酸之間。 在一個具體的實施方案中，貯器裝有治療組合物，所述治療組合物包含在適於眼部離子電 滲療法的水溶液中配製的至少一種寡核苷酸化合物。在一個具體的實施方案中，治療組合 物包含選自以下的至少一種物質緩衝劑、滲透劑、滲透促進劑、螯合劑、抗氧化劑和抗微生 物防腐劑(antimicrobial preservative)。在一個具體的實施方案中，在重配用於離子電 滲療法應用之前將治療組合物凍幹。在一個具體的實施方案中，所述貯器裝有納米微粒形 式的siRNA製劑。在一個具體的實施方案中，納米微粒包含選自以下的至少一種物質緩衝 劑、滲透劑、滲透促進劑、螯合劑、抗氧化劑和抗微生物防腐劑。在一個具體的實施方案中， 納米微粒的直徑介於約20nm和約400nm之間。在一個具體的實施方案中，納米微粒的水動 力學直徑介於約40nm和約200nm之間。在一個具體的實施方案中，納米微粒的ζ電位介 於約+5mV和約+IOOmV之間。在一個具體的實施方案中，納米微粒的ζ電位介於約+20mV 和約+80mV之間。在一個具體的實施方案中，納米微粒的ζ電位介於約-5mV和約-IOOmV 之間。在一個具體的實施方案中，納米微粒的ζ電位介於約_20mV和約-80mV之間。在一 個具體的實施方案中，納米微粒通過介於約+0. 25mA和約+IOmA之間的離子電滲電流遞送。 在一個具體的實施方案中，納米微粒通過介於約+0. 5mA和約+5mA的離子電滲電流遞送。在 一個具體的實施方案中，貯器保存介於約50μ L 約500μ L之間的siRNA製劑。在一個具 體的實施方案中，貯器保存介於約150 μ L 約400 μ L之間的siRNA製劑。在一個具體的實 施方案中，給藥時間介於約1分鐘和約20分鐘之間。在一個具體的實施方案中，給藥時間 介於約2分鐘和約10分鐘之間。在一個具體的實施方案中，給藥時間介於約3分鐘和約5 分鐘之間。在一個具體的實施方案中，siRNA的溶液通過介於約-0. 25mA和約-IOmA之間的 離子電滲電流遞送。在一個具體的實施方案中，siRNA的溶液通過介於約-0. 5mA和約_5mA 之間的離子電滲電流遞送。在一個具體的實施方案中，以單劑量給予siRNA。在一個具體 的實施方案中，以多劑量給予siRNA。在一個具體的實施方案中，寡核苷酸在離子電滲療法 之前通過注射遞送。在一個具體的實施方案中，注射的方法選自眼房內注射、角膜內注射、 結膜下注射、筋膜下注射(subtenon injection)、視網膜下注射、玻璃體內注射和注射入前 房。在一個具體的實施方案中，在離子電滲療法之前局部給予寡核苷酸。在一個具體的實 施方案中，眼部離子電滲療法的步驟在給予寡核苷酸的步驟之前、期間或之後進行。一個實施方案涉及用於治療哺乳動物眼病的方法，所述方法包括通過眼部離子電 滲療法給予有效量的siRNA。一個實施方案涉及適於眼部離子電滲遞送至受治療者眼內的SiRNA製劑，所述制 劑包含含有siRNA的納米微粒組合物。一個實施方案涉及用於遞送siRNA至受治療者眼內的裝置，所述裝置包括a)裝 有至少一種介質的貯器，所述介質包含siRNA製劑，所述貯器沿欲覆蓋眼球一部分的表面 展開；和b)與貯器連接的電極，其中當將貯器與眼球接觸放置時，電極可供應定向穿過介質並指向眼表面的電場，因此引起SiRNA移到眼內，從而通過離子電滲療法經由眼睛表面 遞送SiRNA製劑。在一個具體的實施方案中，貯器裝有a)用於容納至少一種介質的第一 容器，所述介質包含SiRNA製劑；b)用於容納導電介質的第二容器，所述導電介質包含導電 元件；和c)位於第一容器和第二容器之間的半透膜，半透膜對於導電元件是可滲透的而對 於活性物質是不可滲透的。附圖簡述

圖1是用於將寡核苷酸(例如SiRNA分子)遞送到需要的眼部組織的眼部離子電 滲療法系統的示意圖。圖2A和圖2B是以lmg/mL的濃度用單鏈寡核苷酸(ss-oligo)經離子電滲法治療 的兔眼結膜和鞏膜的螢光顯微照片(圖2A)和同時期的被動擴散的作用(圖2B)。動物用 15mA·分鐘的離子電滲電流(圖2A)或無電流(圖2B)治療。比例尺表示25微米，並同時 適用於圖A和圖B。圖3A和圖3B是從圖2所見圖像中形成的強度分布圖。圖3A顯示在離子電滲治療 後ss-oligo的強度分布圖，而圖3B表示被動擴散5分鐘後ss-oligo的分布。這些圖像顯示 較高的強度以及較廣的分布，這就表明與被動擴散相比，在離子電滲治療後較多ss-oligo 滲入組織中。圖4A-C是在離子電滲遞送(圖4A)以及被動擴散(圖4B和圖4C)後ss-oligo 分布的螢光顯微照片。這些圖像顯示與被動擴散相比，在離子電滲治療後，ss-oligo被遞 送到眼內的較大區域。圖5A和圖5B是在離子電滲治療後兔視網膜的螢光顯微照片。圖5A顯示ss-oligo 在整個視網膜層中的分布。圖5B顯示在該視網膜區域中觀察到的自身螢光，這表明了圖5A 中記錄的信號是由於存在ss-oligo所致。紅色=Cy5標記的ss-0lig0，藍色=核，綠色= 存在於視網膜組織內的自身螢光信號。圖6顯示在用-4mA電流治療的動物的水狀液中檢測到的ss-oligo (泳道5_8)，而 在被動治療的兔的水狀液中未能檢測出ss-oligo (泳道1-4)。泳道9顯示檢測出摻加入水 中的已知量的ss-oligo的大小與實驗樣品的相同，這就支持ss-oligo的離子電滲遞送不 會影響分子的完整性的斷言。濃度lmg/mL ；持續時間5分鐘；電流為OmA或-3. OmA ；對照 泳道為Ing/mL單鏈oligo。圖7A-D是用Cy5標記的雙鏈VEGF siRNA (lmg/mL)經離子電滲治療的兔眼的結膜 和鞏膜(圖7B和圖7D)以及經無電流治療的眼(圖7A和7C)的螢光顯微照片(圖7A和 圖7B)及強度分布圖(圖7C和圖7D)。動物用無電流治療5分鐘或用20mA ·分鐘離子電 滲電流治療(_4mA達5分鐘)。比例尺表示25微米並適用於圖7A和圖7B。圖8A-B是在被動擴散(圖8A)或離子電滲治療(圖8B)後兔眼緣區的螢光顯微 照片，表明在離子電滲治療後siRNA遞送的區域擴大。圖8C是比較被動擴散和離子電滲治 療後siRNA分布差異的圖。比例尺表示250微米並同時適用於圖A和圖B。圖9A和9B是用Cy5標記的雙鏈VEGF siRNA (lmg/mL)經離子電滲治療的兔眼的 結膜(圖9A)和固有層(lamina propria)(圖9A和圖9B)的螢光顯微照片。這些圖像顯 示在離子電滲治療後有大量的細胞攝取。比例尺表示10微米並同時適用於圖9A和圖9B。 紅色=Cy5標記的VEGF siRNA，藍色=核。
圖10顯示在用-4mA電流治療的動物水狀液中檢測到的siRNA (泳道1_4)，而被動 治療的兔水狀液中未能檢出siRNA(泳道5-8)。泳道11顯示檢測出摻加入水狀液中已知 量的siRNA的大小與實驗樣品的相同，這就支持siRNA的離子電滲遞送不會影響分子的完 整性的斷言。濃度lmg/mL ；持續時間10分鐘；電流為-4. OmA或OmA ；對照泳道9、10和11 是分別以0. 5ng/mL、lng/mL和5ng/mL摻加入水狀液中的siRNA。發明詳述本文所描述的是用於將SiRNA遞送到受治療者眼內的組合物和方法。例如，遞送 的siRNA可用於治療各種疾病(例如青光眼、糖尿病性視網膜病、增殖性玻璃體視網膜病、 年齡相關性黃斑變性(AMD)、乾性AMD、溼性AMD、乾眼症等)。本文所述實施方案涉及預料 不到的發現，即可以通過眼部離子電滲療法遞送有效量的siRNA。例如，所述遞送允許下調 一種或多種特定基因，這就使得例如可治療特定的疾病或病症。本文所使用的術語「小幹擾RNA」是指一類約18-25個核苷酸長的雙鏈RNA分子。 標準siRNA分子的平均長度為21或23nt。siRNA在生物學中發揮各種各樣的作用。本發 明利用siRNA的RNA幹擾(RNAi)作用，特異性下調基因表達，以用於治療各種眼病。雖然 RNAi的機制涉及雙鏈RNA分子，但是可以將單鏈或部分雙鏈RNA分子遞送到需要的組織中， 然後單鏈或部分雙鏈RNA分子轉變成預期下調靶基因表達的雙鏈RNA分子。本文所使用的 術語「受治療者」是指動物，特別是哺乳動物，例如人。眼部離子電滲療法是一項眼科療法技術，可以克服將藥物遞送到眼前部和眼後 部兩者中的常規方法在實踐中的局限性(Eljarrat-Binstock, Ε.和Domb，Α.，J. Control Release，110 :479_489，2006)。離子電滲療法是無創技術，其中施以弱電流以促進電離 藥物或帶電藥物載體滲入機體組織中。可通過在正極上的電斥力驅動帶正電的物質進 入組織中，而帶負電的物質被則陰極排斥。該法使用簡單，不良副作用小，遞送至靶定區 域的藥物增多，使得離子電滲療法主要在經皮給藥領域中廣泛用於臨床。已對用眼部離 子電滲療法遞送不同的活性化合物進行了廣泛深入的研究，包括抗生素(Barza，Μ.等， Ophthalmology, 93 133-139，1986 ；Rootman,D.等，Arch. Ophthalmol，106 -.262-265,1988 ； Yoshizumi， M.等，J. Ocul. Pharmacol, : 163—167，1991 ；Frucht-Pery, J.等，J. Ocul. Pharmacol. Ther, 15 :251_256，1999 ；Vollmer, D.等，J. Ocul Pharmacol. Ther.，18 549-558, 2002 ；Eljarrat-Binstock, Ε.等，Invest. Ophthalmol Vis, Sci,45 2543-2548, 2004 ；Frucht-Pery, J.等，Exp. Eye Res. ,78 :745_749，2004)；抗病毒藥(Lam，Τ.等，J. Ocul. Pharmacol，10 :571-575，1994)；皮質類固醇(Behar-Cohen,F.等，Exp. Eye Res. ,65 533-545,1997 ；Behar-Cohen, F.等，Exp. Eye Res. ,74 :51_59，2002 ；Eljarrat-Binstock, E.等，J. Control Release, 106 :386_390，2005)；化療藥物(Kondo, Μ.和 Araie, Μ.， Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , 30 :583_585,1989 ；Hayden, B.等，Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. ,45 3644-3649,2004 ；Eljarrat-Binstock, E 等，Curr. Eye Res. ,32 :639-646, 2007 ；Eljarrat-Binstock, E 等，Curr.Eye Res. ,33 :269_275，2008)；以及寡核苷酸 (Asahara, Τ.等，Jpn.J. Ophthalmol, 45 :31_39, 2001 ；Voigt,M 等，Biochem. Biophys. Res. Commun.，295 =336-341,2002)。離子電滲療法的過程包括給可電離物質(例如藥品)施加 電流，以提高其穿過表面的移動性。三種主要的力控制著由電流引起的流量，其中主要的力 是電化學斥力，其驅使諸如帶電類物質通過表面(組織)。
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當電流通過含有電解質的水溶液和帶電物質(例如活性藥物成分或者API或包含 API的製劑)時，會發生若干事件(1)電極產生離子，(2)新產生的離子接近諸如帶電粒子 (通常為被遞送的藥物)/與之碰撞，和(3)新產生的離子之間的電斥力迫使溶解/懸浮的 帶電粒子(API)進入和/或穿過靠近電極的表面(組織)。比起只是用簡單的局部給藥達 到的效果，連續施加電流驅動API顯著更多地進入組織。離子電滲療法的程度與所施加的 電流和治療時間成比例。離子電滲療法發生在基於水的製備物中，其中可容易地通過電極產生離子。可以 使用兩種類型的電極來產生離子(1)惰性電極，和⑵作用電極。每種類型的電極都需要 含有電解質的含水介質。使用惰性電極的離子電滲療法受施加電流可產生的水解程度的控 制。電解反應產生氫氧根離子(陰極)或水合氫離子(陽極)。一些製劑含有緩衝劑，可減 緩由這些離子引起的PH改變。某些緩衝劑可帶入諸如帶電離子，這些離子可能與藥品(即 待被離子電滲導入的承載物(例如siRNA))因電解而產生的離子競爭，這可能降低藥品的 遞送。藥物遞送電極的極性取決於藥品的化學性質，尤其是藥品的PKa/等電點和初始給藥 溶液PH。重要的是通過電解產生的離子和藥品電荷(或包含活性劑的組合物的電荷，例如 納米微粒製劑)之間的電化學斥力驅使藥品進入組織。因此，離子電滲療法提供優於局部 用藥的重要優勢，因為它增加藥物遞送。可按本領域技術人員所確定的一樣，通過改變所施 加的電流來調節遞藥率。用於離子電滲遞送的裝置包括例如EyeGate II塗藥器(applicator)和相關技 術。當與其它裝置相比時，採用EyeGate Ii塗藥器和技術導致使用較少的藥物，從而使每 次治療的成本降低。本文所述組合物和方法利用EyeGate Ii塗藥器和相關技術將治療上 相關的寡核苷酸遞送進並完整地通過眼部組織並使之發揮隨後功能的能力。本文所述組合物和方法由於用EyeGate Ii塗藥器和技術進行離子電滲治療，因 此可供提高細胞對所得到的寡核苷酸的攝取。與局部遞送方法相比，使用將寡核苷酸遞送 至眼部組織的EyeGate Ii塗藥器和技術增加細胞對該分子的通透性。另外，通過例如產 生所需要的荷質比，可供更有效地遞送特定組合物(例如經特殊改造的納米微粒)，以及通 過例如結合攝取納米微粒表面上的因子，可供更有效使細胞攝取特定組合物。使用雙鏈RNA(例如siRNA)以定向抑制基因表達的方法是本領域技術人員已知 的。本領域技術人員會了解如何設計與要下調的內源基因(例如異常表達引起疾病的基 因)同源的siRNA分子。按照已知的鹼基配對原則選擇序列。本文所述的方法和組合物可 用於將siRNA分子遞送至特定的眼部組織，因為其它的遞送和攝取已被證實不能產生預期 效果。得自之前的siRNA方法的不一致結果涉及遞送和攝取，以及在遞送至並攝入特定組 織後siRNA分子的無效性。因此，本文所述方法促進siRNA分子遞送至並攝入需要的特定 組織中，其中特定分子的siRNA的功能可供下調預期的基因產物，因此有效用於治療與基 因產物相關的疾病。本領域技術人員所確定的有效量的特定siRNA足以產生特定基因在臨 床上相關的下調。本文所使用的術語「有效量」是指需要達到所需效果的siRNA的劑量，例 如下調特定基因靶直到達到所需效果的程度。術語「有效量」也是緩解或減輕一種或多種 與眼病相關的症狀或臨床事件。對於本文所述的組合物和方法，siRNA的長度介於約15 約30個核苷酸，例如介於22 23個核苷酸長度。SiRNA分子可以是完全雙鏈、部分雙鏈或單鏈，因為本領域技術 人員應能夠產生開始時作為雙鏈RNA分子或者在攝入需要的組織或細胞後體內轉化成雙 鏈RNA分子的分子。本領域技術人員應理解的是，至少對於遞送和攝取，由於本文所述方法 取決於RNA或普遍含有RNA的製劑的物理性質(例如荷質比)，所以所述方法和組合物是不 依賴於序列的(Brand，R.等，J. Pharm. Sci.，49-52，1998)。在遞送並由經需要的眼部組織攝取後，SiRNA分子有效地下調預期靶基因的內源 基因表達。靶基因的具體實例包括但不限於例如β腎上腺素能受體1和/或2、碳酸酐酶 II、C0Chlin、骨形態發生素蛋白受體l/2、gremlin、血管緊張素轉化酶、血管緊張素II 1型 受體(ATI)、血管緊張素原仏呢)、腎素、補體0、補體03、補體05、補體05^補體0513、補體因 子H、VEGF、VEGF受體(1、2或兩者)、整聯蛋白avi33、PDGF受體β、蛋白激酶C、c-JUN轉 錄因子、IL-I a、IL-I β、TNFa、MMP, ICAM-1、胰島素樣生長因子_1、胰島素樣生長因子_1 受體、生長激素受體 GHr、整聯蛋白 av35、TNFa、ICAM-1、MMP-10、MMP-2、MMP-9 等。本發明的SiRNA可以納米微粒的形式包封。在某些實施方案中，當將API包封在 納米微粒中時，可達到特定的均一荷質比，這取決於納米微粒的確切性質。將API包封在納 米微粒中還可供例如延長API的停留時間，提高特定細胞的攝取，使API分子靶向預期組織 或細胞內的特定靶標，提高API的穩定性，以及其它與具體納米微粒有關的有利性質。例如，SiRNA製劑或組合物可包含在溶液中，例如用於保護製劑的完整性和/或用 作合適離子電滲療法緩衝劑的溶液。例如，採用EyeGate Ii塗藥器和技術，可使溶液最優 化以將寡核苷酸離子電滲遞送至眼部組織，同時確保在離子電滲遞送之前和期間寡核苷酸 的穩定性。還可以設計與其將遇到的眼部組織相容的製劑和/或溶液。通過改進塗藥器，可進一步提高遞送寡核苷酸或裝載寡核苷酸的納米微粒的 EyeGate Ii塗藥器和技術的利用，以確保溶液得到不斷緩衝並使成功完成離子電滲治療 所需要的溶液的體積降至最低。這兩個目的可通過向塗藥器中加入緩衝系統來完成。在塗 藥器中使用緩衝系統，確保在離子電滲治療期間患者的安全，並維持寡核苷酸的完整性。向 EyeGate II塗藥器中加入成膜緩衝系統(membrane-shapedbuffering system)還可減 小用作含藥物溶液的貯器的泡沫襯墊(foam insert)體積。泡沫襯墊由快速溶脹的吸水聚 氨酯型泡沫基質製成，其形狀是空心圓筒，尺寸大致為6mm(長度)xl4mm(內徑)xl7mm(外
徑)。因此，使泡沫襯墊水合所需的含藥物溶液的總體積減小。例如，與標準EyeGate 11
塗藥器所需量相比，加入3mm厚的水凝膠/膜緩衝劑系統可使總的含藥物溶液減少50%。 從塗藥器中每移動Imm泡沫襯墊，就相當於使充滿貯器所需含藥物溶液減少大致16%。因 此，可以調整含藥物溶液的量以滿足各治療方案的特殊要求。EyeGate Ii塗藥器和技術 可用來將治療上相關的寡核苷酸的納米微粒製備物遞送至眼部組織和通過眼部組織。然後 納米微粒可以控時和/或控速的方式，釋放出其有效負荷(例如活性劑、SiRNA寡核苷酸)， 以遞送完整狀態的寡核苷酸，因此可供其細胞攝取和隨後的功能。不論寡核苷酸大小、核苷 酸組成成分和/或寡核苷酸的修飾怎樣，EyeGate Ii塗藥器和技術都不會影響寡核苷酸 的完整性。通過離子電滲療法，可使用預製備的荷載寡核苷酸的納米微粒將SiRNA分子遞送至需要的眼部組織。可參考有關眼藥遞送的納米微粒的綜述(Zimmer，A.和Kreuter.J.， Adv. Drug Delivery Reviews, 16 :61_73,1995 ；Amrite 禾口 Kompella, Nanoparticles for Ocular Drug Delivery(用於遞送眼藥的納米微粒)，載於Nanoparticle Technology for DrugDelivery，第 159 卷，Gupta 和 Kompella(編輯)，2006 ；Kothuri 等，Microparticles and Nanoparticles in Ocular Drug Delivery (眼藥遞送中的微粒和納米微粒)，載於 Ophthalmic Drug Delivery Systems，第 130 卷，Ashim K. Mitra (主編)，第 2 版，2008)。用於製備眼部遞藥的納米微粒的材料包括但不限於聚烷基氰基丙烯酸酯，例如聚 (乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(異丁基氰基丙烯酸酯)、聚(己基氰基 丙烯酸酯)、聚(十六烷基氰基丙烯酸酯)或烷基氰基丙烯酸酯和乙二醇的共聚物；選自聚 (DL-丙交酯)、聚(L-丙交酯)、聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)、聚(ε -己內酯)和聚(DL-丙 交酯-共-ε-己內酯)；或選自Eudragit 聚合物，例如Eudragit RL lOO.Eudragit RS lOO.Eudragit E 100、Eudragit L 100、Eudragit L 100-55 和Eudragit S 100。納米 微粒也可自以下成分製備例如聚醋酸乙烯鄰苯二甲酸酯、醋酸纖維素鄰苯二甲酸酯、羥 丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯或醋酸羥丙基甲基纖維素琥珀酸酯。所述材料可包括例如 天然多糖，例如脫乙醯殼多糖、藻酸鹽或其組合；藻酸鹽和聚(1-賴氨酸)的複合物；聚乙 二醇化脫乙醯殼多糖；天然蛋白，例如白蛋白；脂質和磷脂，例如脂質體；或者矽。其它材 料包括例如聚乙二醇、透明質酸、聚(1-賴氨酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrollidone)、聚乙烯亞胺、聚丙烯醯胺、聚(N-異丙基丙烯醯胺)。實例實施例1.圖ι表示眼部離子電滲療法裝置EyeGate Ii塗藥器的縱切面，由用寡核苷酸水 溶液飽和的泡沫襯墊和含有緩衝組合物的水凝膠基質膜組成。示圖中裝置元件的形狀、大 小和相對位置不必精確或按比例描繪。所繪元件的具體形狀無意表達有關該具體元件實際 形狀的任何信息，僅僅是選來便於在圖中識別。藥物製劑貯器由以下部分組成(i)用液體 製備物飽和的泡沫襯墊，所述液體製備物包含一種或多種治療性寡核苷酸化合物、任選緩 衝組合物及用於眼部遞藥的藥學上可接受的任選無活性成分；和任選(ii)含有緩衝組合 物的水凝膠基質/膜。至少一種治療性化合物溶於溶液中。所述緩衝組合物是(i)大量 的包括陽離子和/或陰離子交換樹脂的離子交換樹脂顆粒；(ii)大量的包括陽離子和/或 陰離子顆粒的聚合物顆粒；(iii)陽離子和/或陰離子聚合物；(iv)生物緩衝劑；或(ν)無 機緩衝劑。顆粒可具有規則形狀(例如圓形、球形、立方形、圓柱形、纖維狀和針狀)或不規 則形狀。塗藥器(10)由以下主要元件構成11.近端部件，為裝置提供穩固支持並將藥物製劑傳遞至貯器的工具；12.源連接器插針，在電流發生器和電極之間提供連接點；13.電極，將電流傳輸到製劑貯器；14.貯器，裝有要遞送的藥物製劑；15.遠端部件，這是一個與眼睛對接的軟塑料；和16.治療性寡核苷酸化合物，溶於飽和泡沫襯墊的液體溶液中。實施例2.抗VEGF siRNA的體內遞送
在治療前，將重量約為3kg的雌性紐西蘭白兔各關養至少三天，以便從運送中恢 復，並適應設施環境條件。在治療前至少24小時，用脫毛膏脫去兩耳後的毛髮。在治療前 20分鐘用氯胺酮(35mg/kg)和賽拉嗪(5mg/kg)進行肌內注射使動物麻醉。一旦動物被麻 醉，便將返回電極放置在耳朵裸露的皮膚上(每耳一片)，並與發生器連接。使用ImL 27號 針頭注射器，按需要，將約0. 25mL 約0. 50mL含有siRNA的溶液加到多套EyeGate II塗 藥器的泡沫襯墊中。目視檢查每個塗藥器以確保泡沫完全水合。以機械法除去任何氣泡或 未水合區。然後將EyeGate II塗藥器與發生器連接，並在滴上一滴局部麻醉藥後放置在右 眼上。給予適當治療後，從眼上取下該裝置，然後將動物調轉，在左眼上重複該步驟。其餘 的兔以同樣的方法，各用新的塗藥器接受離子電滲劑量的siRNA。兔的每隻眼可接受4mA電流治療，持續10分鐘(總離子電滲劑量為40mA 分鐘)， 從右眼開始。每隻動物的左眼治療完成後，立即取出ImL血液，離心收集血漿樣品。在採集 血樣後，使動物安樂死。所有動物用4mL過量的Euthasol，經靜脈內注射入耳緣靜脈處以安 樂死。通過不存在心搏和沒有呼吸證實死亡。一旦確認死亡，使用0.33mL胰島素注射器從 每隻眼內取出水狀液，放入無DNA酶和RNA酶的管中，保存在-80°C下直到進行分析。然後 摘取眼球，解剖成其具有各種組織類型的構成組分，單獨放入無DNA酶和RNA酶的管中，保 存在-80°C下直到用質譜法進行定量和完整性測定分析。實施例3.透鞏膜遞送7.5kDa單 鏈寡核苷酸在眼部組織中進行了體內單鏈RNA分子的離子電滲移動性分析。給予紐西蘭兔(約3kg)單劑量的單鏈RNA寡核苷酸，濃度為lmg/mL，使用 EyeGate II裝置，電流為3mA達5分鐘，產生總離子電滲劑量為15mA ·分鐘。與被動擴散相比，使用EyeGate Ii裝置，將單鏈寡核苷酸經離子電滲療法導入 兔眼內會增加運送至眼部組織的寡核苷酸的量(圖2、圖3和圖5)。與被動擴散相比，離子 電滲治療還增大遞送寡核苷酸的面積(圖4)。在離子電滲治療後，寡核苷酸的完整性不受 影響(圖6)。實施例4.透鞏膜遞送15kDa雙鏈siRNA對15kDa雙鏈血管內皮生長因子(VEGF) siRNA分子在治療年齡相關性黃斑變性的 功效進行了測試。採用EyeGate Ii裝置，通過離子電滲療法將抗VEGF siRNA分子(用 Cy5標記，用於通過螢光顯微術檢測)遞送至紐西蘭兔眼內(圖7-10)。正如用單鏈寡核苷 酸所見，與被動擴散相比，使用EyeGate Ii裝置的離子電滲療法增加遞送至各種眼部組 織的oligo的量(圖7)，而且向其中遞送siRNA的總面積也增大(FIG-8)。與被動擴散相 比，使用EyeGate II裝置的離子電滲治療還導致所觀察到的抗VEGF siRNA的細胞攝取量 增加(圖9)。另外，在離子電滲治療後，SiRNA寡核苷酸的完整性也未改變(圖10)。其它疾病和基因靶標歸納列表於表1中。表 1.
權利要求
一種通過透鞏膜離子電滲療法將有效量的siRNA遞送至受治療者眼內的方法，所述方法包括a)將一種裝置放置在受治療者的眼球表面中心，使得在所述裝置和眼球間形成應用表面，其中所述裝置包含貯器，所述貯器裝有含有一種或多種siRNA分子或其製劑的水溶液，且其中所述裝置與電發生器連接；和b)通過執行離子電滲療法，將siRNA給予受治療者眼，從而將siRNA遞送至眼內。
2.權利要求1的方法，其中將所述裝置應用於眼球表面上至少部分受到面向眼球光軸 的外邊線凹面的限制，且其中該裝置的外壁相對於光軸從外邊線向外延伸。
3.權利要求1的方法，其中siRNA的長度介於約15個和約30個核苷酸之間。
4.權利要求1的方法，其中siRNA的長度介於約21個和約23個核苷酸之間。
5.權利要求1的方法，其中所述貯器裝有治療組合物，所述治療組合物包含至少一種 配製於適於眼部離子電滲療法的水溶液中的寡核苷酸化合物。
6.權利要求5的方法，其中所述治療組合物包含選自以下的至少一種物質緩衝劑、滲 透劑、滲透促進劑、螯合劑、抗氧化劑和抗微生物防腐劑。
7.權利要求5的方法，其中在重配用於離子電滲療法應用之前將治療組合物凍幹。
8.權利要求1的方法，其中所述貯器裝有納米微粒形式的siRNA製劑。
9.權利要求8的方法，其中所述納米微粒包含選自以下的至少一種物質緩衝劑、滲透 劑、滲透促進劑、螯合劑、抗氧化劑和抗微生物防腐劑。
10.權利要求8的方法，其中所述納米微粒的直徑介於約20nm和約400nm之間。
11.權利要求8的方法，其中所述納米微粒的水動力學直徑介於約40nm和約200nm之間。
12.權利要求8的方法，其中所述納米微粒的ζ電位介於約+5mV和約+IOOmV之間。
13.權利要求8的方法，其中所述納米微粒的ζ電位介於約+20mV和約+80mV之間。
14.權利要求8的方法，其中所述納米微粒的ζ電位介於約-5mV和約-IOOmV之間。
15.權利要求8的方法，其中所述納米微粒的ζ電位介於約-20mV和約-80mV之間。
16.權利要求8的方法，其中所述納米微粒通過介於約+0.25mA和約+IOmA之間的離子 電滲電流遞送。
17.權利要求8的方法，其中所述納米微粒通過介於約+0.5mA和約+5mA的離子電滲電流遞送。
18.權利要求1的方法，其中所述貯器保存介於約50μ L 約500 μ L之間的siRNA製劑。
19.權利要求1的方法，其中所述貯器保存約150μ L 約400 μ L的siRNA製劑。
20.權利要求1的方法，其中所述給藥時間介於約1分鐘和約20分鐘之間。
21.權利要求1的方法，其中所述給藥時間介於約2分鐘和約10分鐘之間。
22.權利要求1的方法，其中所述給藥時間介於約3分鐘和約5分鐘之間。
23.權利要求1的方法，其中siRNA的溶液通過介於約-0.25mA和約-IOmA之間的離子 電滲電流遞送。
24.權利要求的方法23，其中siRNA的溶液通過介於約_0.5mA和約_5mA之間的離子 電滲電流遞送。
25.權利要求1的方法，其中以單劑量給予siRNA。
26.權利要求1的方法，其中以多劑量給予siRNA。
27.權利要求1的方法，其中所述寡核苷酸在離子電滲療法之前通過注射遞送。
28.權利要求27的方法，其中注射方法選自眼房內注射、角膜內注射、結膜下注射、筋 膜下注射、視網膜下注射、玻璃體內注射和注射入前房。
29.權利要求1的方法，其中所述寡核苷酸在離子電滲療法之前局部給予。
30.權利要求1的方法，其中所述眼部離子電滲療法的步驟在給予寡核苷酸的步驟之 前、期間或之後進行。
31.一種用於治療哺乳動物眼病的方法，所述方法包括通過眼部離子電滲療法給予有 效量的siRNA。
32.一種適於眼部離子電滲遞送至受治療者眼內的siRNA製劑。
33.權利要求32的siRNA製劑，其中所述製劑包含含有siRNA的納米微粒組合物。
34.一種用於遞送siRNA至受治療者眼內的裝置，所述裝置包括a)裝有至少一種介質的貯器，所述介質包含siRNA製劑，所述貯器沿欲覆蓋眼球一部 分的表面展開；和b)與貯器連接的電極，其中當將貯器與眼球接觸放置時，電極可供應定向穿過介質並 指向眼表面的電場，因此引起siRNA移到眼內，從而通過離子電滲療法通過眼睛表面遞送 siRNA製劑。
35.權利要求34的裝置，其中所述貯器裝有a)用於容納至少一種介質的第一容器，所述介質包含siRNA製劑的；b)用於容納導電介質的第二容器，所述導電介質包含導電元件；和c)位於第一容器和第二容器之間的半透膜，所述半透膜對於導電元件是可滲透的而對 於活性物質是不可滲透的。
全文摘要
本文公開了適於通過眼部離子電滲療法遞送的siRNA製劑、用於經離子電滲遞送siRNA的裝置及其使用方法。
文檔編號A61N1/30GK101965212SQ200880126631
公開日2011年2月2日 申請日期2008年12月5日 優先權日2007年12月5日
發明者M·佩坦, P·伊索姆, P·莫斯萊米, W·舒伯特 申請人:眼門藥品公司