免疫球蛋白純化用纖維素類凝膠的製作方法

2023-10-27 12:24:47

專利名稱：免疫球蛋白純化用纖維素類凝膠的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種色譜用填充劑、特別是適於可在抗體醫藥中利用的免疫球蛋白、 血液製劑用生物醫藥等蛋白質製劑等的分離純化的陽離子交換型色譜用填充劑的製造與使用。
背景技術：
近年來，以抗體醫藥為代表的蛋白質製劑可通過大量發酵及強效發酵而提高生產性。伴隨於此的是亦要求純化步驟的效率化。特別是於純化中所使用的色譜用填充劑的高流速化及高吸附化亦與成本削減有關，因此期待得到改善。為了實現高流速化，開發通過對基礎凝膠進行交聯而提高強度的手法而製造的色譜用填充劑。另外，已知通過於該些交聯凝膠中組合葡聚糖等親水性高分子而提高吸附性， 且導入了此種親水性高分子的多孔性基材於色譜用填充劑的開發領域中受到關注。例如，於非專利文獻1 (色譜法雜誌A (Journal of Chromatography Α)， 679(1994) 11-22)中報告了 於由聚苯乙烯-二氧化矽所構成的核心粒子上加成離子交換基而成的、由源自葡聚糖的水凝膠所構成的離子交換吸附劑(由拜歐賽帕(Biosepra)公司 (法國)以「S HyperD(商標)」而市售)，由此而提高蛋白質的吸附性能。而且，於專利文獻1 (日本專利特開2008-5^966號公報)中報告了 通過使用於甲基丙烯酸酯聚合物粒子上加成聚乙烯亞胺而成的色譜用填充劑，可增強蛋白質的吸附特性。另外，於專利文獻2 (日本專利特開2008-232764號公報)中記載了 於在多孔性甲基丙烯酸酯粒子上固定分子量為50萬的普魯蘭多糖而成的凝膠中，使用2-溴乙碸而導入配體，由此而獲得顯示出良好流速特性的強陽離子離子交換型色譜用基質。其中報告了達成人免疫球蛋白的吸附容量為160mg/ml。而且，於非專利文獻2 (Journal of Chromatography A, 1146(2007)202-215)中報告了使用葡聚糖對由瓊脂糖所構成的核心粒子實施表面改性時的效果。由此可使用葡聚糖對核心粒子的表面進行改性，從而可使目標蛋白質於載體內的擴散性提高，因此可使對象物的物質移動增大。而且，作為此種設計的色譜用填充劑的例子，市售有通用電器醫療集團生命科學部(GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES)的 「SP S印harose (商標)XL」。另外，於專利文獻3(國際公開第2007-027139號說明書)中，作為可於抗體醫藥製造用中利用的陽離子交換型色譜用凝膠基質的例子，報告了於在交聯瓊脂糖凝膠中共價鍵結分子量為40kDa的葡聚糖而成的粒子中，使用乙烯基磺酸而導入離子交換基，由此而獲得具有143mg/ml的免疫球蛋白(IgG)吸附性能的凝膠。如上所述，報告了通過於基礎凝膠中加成親水性高分子而提高吸附性能。然而，特別是於抗體醫藥的製造領域中，銳意地實踐了製造的大容量化及強效化，因此對於純化基材亦強烈要求高流速與動態吸附特性的進一步改善。作為色譜用填充劑的以代表性的二氧化矽為基材的填充劑的高流速性優異。然而，材質於鹼性條件下不穩定，因此對於通常的鹼清洗性而言變得不利。另一方面，以多糖類為基材的色譜用填充劑的耐鹼性強。而且，以多糖類為基材的色譜用填充劑具有適於蛋白質大小的分離純化的多孔性，有望用於蛋白質或疫苗製劑的分
離純化。於作為代表性的多糖類的纖維素與瓊脂糖中，纖維素的氫鍵的網狀牢固，因此於色譜用填充劑所要求的高流速化中有利。然而，迄今為止並無以纖維素為基材而實現對於蛋白質製劑(特別是用於抗體醫藥的免疫球蛋白)的分離純化而言適宜的流速特性與吸附特性的例子。現有技術文獻專利文獻專利文獻1 日本專利特開2008-5^966號公報專利文獻2 日本專利特開2008-232764號公報專利文獻3 國際公開第2007-027139號說明書非專利文獻非專利文獻 1 Journal of Chromatography A，679 (1994) 11-22非專利文獻2 Journal of Chromatography A, 1146(2007)202-21
發明內容
發明要解決的技術課題於如上所述的狀況中，需要提供流速特性與吸附特性均得到改善的色譜用填充劑。特別是期望提供適於抗體醫藥製造中的免疫球蛋白的分離純化的色譜用填充劑、或者代替肝素凝膠的色譜用填充劑。解決課題的技術手段本發明人等人進行銳意努力，結果發現通過於在多孔性纖維素粒子上加成規定量的多糖類而成的基礎凝膠中導入陽離子交換基，成功地獲得可顯示出所期望的流速特性， 且顯示出迄今為止所沒有的較高的值的吸附特性的色譜用填充劑。另外發現於該過程中， 使用極限粘度高的多糖類，由此可利用更簡易的方法而製造色譜用填充劑。亦即，本發明提供如下所示的多孔性纖維素類凝膠、色譜用填充劑及該些物質的製造方法以及用途等。[1] 一種多孔性纖維素類凝膠，其是於多孔性纖維素粒子上加成具有0. 21dL/g
0.90dL/g的極限粘度的多糖類而成的多孔性纖維素類凝膠，其特徵在於所述多孔性纖維素類凝膠的每單位體積的乾燥重量是所述多孔性纖維素粒子的每單位體積的乾燥重量的
1.06倍 1. 40倍。[2]根據[1]所述的多孔性纖維素類凝膠，其中，所述多孔性纖維素粒子具有 30 μ m 200 μ m的粒徑，且具有0. 15 0. 6的凝膠分配係數，其中所述凝膠分配係數以於重量平均分子量為1.5X IO5Da的標準聚環氧乙烷(polyethylene oxide,ΡΕ0)中使用純水作為流動相時的Kav所表示。[3]根據[1]或[2]所述的多孔性纖維素類凝膠，其中，所述多糖類是葡聚糖。[4]根據[1]或[2]所述的多孔性纖維素類凝膠，其中，所述多糖類是普魯蘭多糖。
[5]根據[1] W]中任一項所述的多孔性纖維素類凝膠，其中，所述多孔性纖維素粒子是具有5ml/g 20ml/g的水溶脹度的交聯纖維素粒子。[6] 一種色譜用填充劑，其是於根據[1] [5]中任一項所述的多孔性纖維素類凝膠上加成配體而成。[7]根據[6]所述的填充劑，其中，所述配體是磺醯基。[8]根據[7]所述的填充劑，其中，所述配體的導入量以離子交換容量計而言為
0.13mmol/ml 0. 30mmol/mlo[9]根據[6]所述的填充劑，其中，所述配體是硫酸酯基。[10]根據[9]所述的填充劑，其中，所述配體的導入量以硫含量計而言為 5000ppm 60000ppm。[11]根據[6] [8]中任一項所述的填充劑，其用於免疫球蛋白純化。[12]根據[11]所述的填充劑，其中，免疫球蛋白的吸附量為150mg/ml 250mg/ ml ο[13]根據[12]所述的填充劑，其中，免疫球蛋白的吸附量為190mg/ml 250mg/ ml ο[13a]根據[9]或[10]所述的填充劑，其用於製造血液製劑。[13b]根據[9]或[10]所述的填充劑，其用於純化免疫球蛋白。[14] 一種色譜用填充劑的製造方法，其包含於多孔性纖維素類凝膠上加成配體的步驟，所述多孔性纖維素類凝膠是於多孔性纖維素粒子上加成具有0. 21dL/g 0. 90dL/g 的極限粘度的多糖類而成的多孔性纖維素類凝膠，且所述多孔性纖維素類凝膠的每單位體積的乾燥重量是所述多孔性纖維素粒子的每單位體積的乾燥重量的1. 06倍 1. 40倍。[15]根據[14]所述的方法，其中，所述多孔性纖維素粒子具有30 μ m 200 μ m的粒徑，且具有0. 15 0. 6的凝膠分配係數，其中所述凝膠分配係數以於重量平均分子量為
1.5X IO5Da的標準聚環氧乙烷中使用純水作為流動相時的Kav所表示。[16]根據[14]或[15]所述的方法，其中，所述多糖類是葡聚糖。[17]根據[14]或[15]所述的方法，其中，所述多糖類是普魯蘭多糖。[18] 一種免疫球蛋白製劑的製造方法，其包含使用根據[6] [8]及[11] [13] 中任一項所述的填充劑而對免疫球蛋白進行分離純化的步驟。[18a] 一種血液製劑的製造方法，其包含使用根據[9]或[10]所述的填充劑而對血液製劑進行分離純化的步驟。[18b] 一種免疫球蛋白製劑的製造方法，其包含使用根據[9]或[10]所述的填充劑而對免疫球蛋白進行分離純化的步驟。另外，於本說明書中，所謂「多孔性纖維素類凝膠」是色譜用分離劑，是指多孔性纖維素粒子上加成多糖類而成的多孔性粒子於其內部包含溶劑或者吸收溶劑而溶脹的狀態。發明的效果根據本發明的優選實施例，可提供流速特性與吸附特性均得到改善的色譜用填充劑及可於其中適宜使用的基材。根據本發明的優選實施例，通過使用具有規定極限粘度的葡聚糖作為在多孔性纖維素粒子上所加成的多糖類，可效率良好地導入配體，能夠以簡便的方法而提高對於目的物質的吸附性能。而且，根據本發明的優選實施例，通過於本發明的多孔性纖維素類凝膠中導入充分量的磺醯基而作為配體，可提供能夠於抗體醫藥領域中的免疫球蛋白的分離純化中利用的陽離子交換型色譜用凝膠。根據本發明的優選實施例，可使免疫球蛋白的吸附性能大幅提尚。


圖1是對實例及比較例中所得的溼凝膠的一例的分配係數Kav進行繪圖而所得的圖表。
具體實施例方式以下，對本發明的多孔性纖維素類凝膠、色譜用填充劑及該些的製造方法以及用途等加以詳細說明。1.多孔性纖維素類凝膠首先，對本發明的多孔性纖維素類凝膠加以說明。本發明的多孔性纖維素類凝膠是於多孔性纖維素粒子上加成具有0. 21dL/g
0.90dL/g的極限粘度的多糖類而成的多孔性纖維素類凝膠，其特徵在於所述多孔性纖維素類凝膠的每單位體積的乾燥重量是所述多孔性纖維素粒子的每單位體積的乾燥重量的
1.06倍 1. 40倍。本發明的多孔性纖維素類凝膠是於多孔性纖維素粒子上加成規定量的具有規定極限粘度的多糖類而成，通過用具有規定極限粘度的多糖類對利用表氯醇等交聯劑使纖維素分子間交聯而成的多孔性纖維素粒子的表面或細孔內部進行改性，可於色譜用填充劑中使用時確保高的流速特性，且可效率良好地導入配體，因此可賦予高的吸附特性。而且，於本發明中，通過使用具有規定極限粘度的多糖類，可利用簡易的方法而於多孔性纖維素上加成所期望量的多糖類。本發明中所使用的多孔性纖維素粒子優選具有30 μ m 200 μ m的粒徑，特別優選具有50 μ m 150 μ m的粒徑。所期望的粒徑例如可通過使用JIS標準篩等的分級操作而進行調整。特別是以孔徑討μ m (線徑0. 04mm)與孔徑125 μ m (線徑0. 088mm)進行篩選可適於獲得本發明的粒徑。而且，本發明中所使用的多孔性纖維素粒子的平均粒徑優選為80μπι 120μπι， 更優選為90 μ m 110 μ m。多孔性纖維素粒子的平均粒徑可以使用掃描電子顯微鏡或光學顯微鏡而對拍攝所得的任意數的纖維素粒子照片進行實際測定，求出其平均而算出。具體的測定方法如實例中所示。另外，本發明中所使用的多孔性纖維素粒子的球度(短徑/長徑)並無特別限制， 優選具有0. 8 1. 0的球狀形態。為了於多孔性纖維素粒子上加成規定量的多糖類，吸收成為最終所期望的蛋白質而進行回收，優選具有適度的細孔尺寸，本發明中所使用的多孔性纖維素粒子優選具有
0.15 0. 6的凝膠分配係數而作為多孔性的指標，該凝膠分配係數以於重量平均分子量為
1.5X IO5Da的市售的標準聚環氧乙烷中使用純水作為流動相時的Kav所表示。該凝膠分配係數更優選為0. 20 0. 55，進一步更優選為0. 25 0. 50。重量平均分子量為1. 5 X IO5Da 的標準聚環氧乙烷例如優選列舉東曹公司製造的標準聚環氧乙烷「SE-5」。於本發明中，凝膠分配係數Kav可根據分子量的標準物質的洗脫體積及管柱體積的關係，通過下式而求出。Kav = (Ve-V0) / (Vt-V0)[式中，Ve是樣品的保持容量(ml)，Vt是空管柱體積(ml)，V0是葡聚糖T2000保持容量(ml)。]凝膠分配係數Kav的測定方法例如於L. Fischer著的生物化學實驗法2 「凝膠色譜法」第1版(東京化學同人)等中有所記載。具體的測定方法如實例中所示。本發明的多孔性纖維素粒子的凝膠分配係數Kav例如可通過控制後述的參考例1中所記載的製造纖維素粒子時的纖維素溶解濃度而調整。於使用結晶纖維素Ceolus PH101(商品名、旭化成化學株式會社製造)的情況時，其濃度優選調整為4% 6% (ff/ff), 由此可獲得適於本發明的多孔性纖維素粒子的凝膠分配係數Kav。另外，多孔性纖維素粒子的凝膠分配係數Kav例如也可以通過控制纖維素粒子的交聯方法、交聯條件而控制。優選可通過控制為後述的參考例1中所記載的交聯方法、交聯條件而獲得適於本發明的多孔性纖維素粒子的凝膠分配係數Kav。當然，亦可利用將控制製造纖維素粒子時的纖維素溶解濃度和控制纖維素粒子的交聯方法、交聯條件加以組合的方法。本發明中所使用的多孔性纖維素粒子可為交聯纖維素粒子，亦可為未交聯纖維素粒子，但於以本發明的多孔性纖維素類凝膠為基材而製造色譜用填充劑時，為了獲得更高的流速特性，優選使用交聯纖維素粒子。交聯纖維素粒子可通過對未交聯纖維素粒子進行交聯而獲得。交聯於各個在纖維素粒子內形成三維網狀結構的纖維素分子的游離羥基與交聯劑的官能基之間進行。交聯纖維素粒子的製造方法並無特別的限制，可通過使未交聯纖維素粒子分散於溶劑中而成的懸浮液與交聯劑反應而製造。溶劑若為可分散未交聯纖維素粒子的溶劑則並無特別的限制，可使用水、醇或酮、 醚、芳香族烴等有機溶劑、或水與有機溶劑的混合物的任意溶劑。該些溶劑中優選水溶性溶劑，特別優選水。而且，為了提高交聯反應的效率，亦可於懸浮液中共存廉價的硫酸鈉等無機鹽。交聯劑若為多官能的交聯劑則並無特別的限制，於本發明中優選使用二官能的交聯劑。自本發明中所使用的交聯劑與纖維素的結合的化學性穩定，且並未導入於反應時產生所不期望的吸附作用的荷電基的方面考慮，可列舉表氯醇、對聚乙二醇或山梨糖醇的羥基進行縮水甘油醚化而成的環氧化合物等作為優選的例子。該些交聯劑可單獨使用一種亦可組合使用兩種以上。於本發明中，該些交聯劑中優選使用結合變得更牢固的表氯醇。另外，於使用水作為溶劑的情況時，優選於鹼的存在下進行交聯反應，鹼可列舉氫氧化鈉、氫氧化鉀等鹼金屬的氫氧化物、氫氧化鈣等鹼土金屬的氫氧化物。其中，鹼金屬的氫氧化物的溶解性良好，因此優選氫氧化鈉、氫氧化鉀，特別優選氫氧化鈉。作為交聯纖維素粒子的製造方法，更具體而言例如可使用日本專利特公昭 43-10059號公報、日本專利特表2000-508361號公報及日本專利特開昭60-39558號公報等中所記載的方法。特別是自可獲得於本發明中維持適宜的多孔性且具有優異的流速特性的交聯纖維素粒子的方面考慮，優選使用本參考例1中所記載的方法。亦即，優選利用包含如下步驟的方法而製造於使未交聯纖維素粒子分散於水中而成的懸浮液中，以3小時以上連續滴加或者分割添加相對於纖維素單體的摩爾數而言為4倍量 12倍量的交聯劑、相對於交聯劑的摩爾數而言為0. 1倍量 2倍量的NaOH。本發明中所使用的多孔性纖維素粒子的水溶脹度優選為5ml/g 20ml/g，特別優選為 6ml/g 13ml/g。於本發明中，多孔性纖維素粒子的水溶脹度以體積/固形物重量(ml/g)而定義， 可將以水而溶脹的凝膠放入至量筒中，一面時時使其振動一面放置直至其體積變固定後， 測定其體積，其次自量筒中取出凝膠，使凝膠的總量乾燥而測定多孔性纖維素粒子的乾燥重量，使用所得的測定值，根據下式而求出。水溶脹度(ml/g)=凝膠的體積(ml)-凝膠的乾燥重量(g)本發明的多孔性纖維素粒子的水溶脹度例如可通過控制後述的參考例1中所記載的製造纖維素粒子時的纖維素溶解濃度而調整。於使用結晶纖維素Ceolus PHlOl (商品名、旭化成化學株式會社製造)的情況時，其濃度優選調整為4% 6% (w/w)，由此可獲得適於本發明的多孔性纖維素粒子的水溶脹度。另外，多孔性纖維素粒子的水溶脹度亦可通過控制纖維素粒子的交聯方法、交聯條件而控制。優選可通過控制為後述的參考例1中所記載的交聯方法、交聯條件而獲得適於本發明的多孔性纖維素粒子的水溶脹度。當然，亦可利用將控制製造纖維素粒子時的纖維素溶解濃度和控制纖維素粒子的交聯方法、交聯條件加以組合而得的方法。於本發明中，加成於多孔性纖維素粒子上的多糖類可使用具有0.21dL/g 0. 90dL/g的極限粘度的多糖類。若本發明中所使用的多糖類具有上述極限粘度，則可使所期望量的多糖類加成於多孔性纖維素粒子上。由此可於製造色譜用填充劑時變得有效率地導入配體，從而提高對於目標物質的吸附特性。而且，多糖類若使用上述極限粘度的多糖類，則具有不對反應操作造成負荷的優點。本發明的優選實施例中所使用的多糖類的極限粘度的範圍例如為0. 21dL/g 0. 90dL/g，亦可為0. 21dL/g 0. 80dL/g或0. 21dL/g 0. 70dL/g,另外亦可為 0. 21dL/g 0. 64dL/g。多糖類的極限粘度例如可以通過自市售的多糖類中選擇具有適當的極限粘度的多糖類而進行調整，或者可以通過公知的方法而進行調整，例如選擇可生產適當極限粘度的多糖類的微生物，由該微生物而獲得多糖類；變更生產多糖類的微生物的培養條件，獲得由該培養條件而生成的多糖類等。於本發明中，多糖類的極限粘度可依照日本藥典第14版中所收錄記載的一般測定法中的粘度測定法、第1法「毛細管粘度計法」，求出數個不同濃度的高分子溶液的粘度而測定粘度的濃度依存性，將所得的直線的濃度外插至0而求出。另外，已知葡聚糖的極限粘度與重量平均分子量滿足下述關係式，因此亦可根據重量平均分子量而求出葡聚糖的極限粘度。極限粘度(η) = 9 X 10-4 X重量平均分子量(Mw) 5以重量平均分子量為標準的情況時，本發明中所使用的多糖類的重量平均分子量更優選為60kDa以上，進一步更優選為70kDa以。而且，多糖類的重量平均分子量更優選為 500kDa以下，進一步更優選為300kDa以下。
作為本發明中所使用的多糖類的具體例，若為不具有並不於反應時產生所不期望的非特異的吸附作用的荷電基，具有可與多孔性纖維素粒子結合、且其後可導入配體的反應性官能基(優選羥基)的多糖類，則並無特別的限制。例如，可列舉瓊脂糖、葡聚糖、普魯蘭多糖、澱粉及該些化合物的衍生物。該些多糖類中，優選使用水溶性且於反應操作性方面有利、可廉價地獲得的葡聚糖。本發明的其他優選的實施例中所使用的多糖類為普魯蘭多糖。於本發明中，多孔性纖維素粒子上所加成的多糖類的量是以多糖類加成前後的每單位體積的乾燥重量的變化量而表示。亦即，於本發明中，多孔性纖維素類凝膠的每單位體積的乾燥重量優選為所述多孔性纖維素粒子的每單位體積的乾燥重量的1. 06倍 1. 40 倍。該比根據多糖類的粘度而具有適宜的範圍，大致而言更優選為1. 10倍以上，進一步更優選為1. 15倍以上，特別優選為1. 20倍以上。若多糖類的加成量為上述範圍，則可於使用本發明的多孔性纖維素類凝膠而製造色譜用填充劑時效率良好地導入配體，可提高目標物質的吸附特性。多孔性纖維素類凝膠的每單位體積的乾燥重量及多孔性纖維素粒子的每單位體積的乾燥重量可以通過如下方式而求出。首先，將多孔性纖維素類凝膠10. Og添加於50ml帶塞量筒中，進一步添加純水直至50ml的刻度線，塞上塞子進行靜置直至體積變得並不變化。於體積變得並不變化後，根據量筒的刻度而讀取凝膠的體積。其次，自量筒中取出凝膠，使凝膠的總量乾燥後，測定乾燥凝膠的重量。使用各測定值，依照下述式可求出多孔性纖維素類凝膠的每單位體積的乾燥重量。每單位體積的乾燥重量(g/ml)=凝膠的乾燥重量(g) +凝膠的體積(ml)多孔性纖維素粒子的每單位體積的乾燥重量亦可與上述同樣地求出。具體的測定方法如實例中所示。多孔性纖維素類凝膠的每單位體積的乾燥重量及多孔性纖維素粒子的每單位體積的乾燥重量例如可通過選擇所使用的多糖類的分子量或者控制於多孔性纖維素粒子上的加成量等而進行調整。於本發明中，使多糖類加成於多孔性纖維素粒子上的方法若為可使多糖類以化學共價鍵而結合於多孔性纖維素粒子上的方法則並無特別的限制。例如，於溶劑中、鹼的存在下，使多孔性纖維素粒子與交聯劑反應，其次使所得的反應生成物與多糖類反應，由此可使多糖類加成於多孔性纖維素粒子上。反應中所使用的交聯劑若為二官能或多官能的交聯劑則並無特別限制，可例示與多孔性纖維素粒子的交聯中使用的交聯劑同樣的交聯劑。特別優選使用表氯醇。反應中所使用的鹼可例示與多孔性纖維素粒子的交聯中所使用的鹼同樣的鹼。反應中所使用的溶劑若為可分散多孔性纖維素粒子的溶劑則並無特別限制。例如， 可例示與多孔性纖維素粒子的交聯中所使用的溶劑相同的溶劑。該些溶劑中特別優選水。 另外，為了提高反應效率，亦可於反應混合物中共存硫酸鈉等無機鹽。使多糖類加成於多孔性纖維素粒子上的方法亦可使用日本專利特開昭60-77769 號公報中所記載的方法。亦即，使交聯纖維素粒子與表氯醇反應而導入環氧基，使其與葡聚糖硫酸或其鹽反應，由此可於交聯纖維素粒子上加成葡聚糖。根據該方法，具有可回收未反應的葡聚糖硫酸或其鹽而再利用的優點。可如上所述那樣於多孔性纖維素粒子上加成具有規定極限粘度的多糖類而獲得本發明的多孔性纖維素類凝膠。於如此而所得的本發明的多孔性纖維素類凝膠上加成配體，由此可獲得可賦予所期望的流速特性、且目標物質的吸附特性優異的色譜用填充劑。2.色譜用填充劑其次，對本發明的色譜用填充劑加以敘述。本發明的色譜用填充劑是於所述的本發明的多孔性纖維素類凝膠中所存在的反應性官能基的至少一部上加成配體而成。於多孔性纖維素粒子上加成規定量的具有規定極限粘度的多糖類而成的本發明的多孔性纖維素類凝膠，由於流速特性優異，且可效率良好地導入配體，因此於其中加成配體而成的本發明的色譜用填充劑的流速特性及吸附特性優
已根據配體的種類及導入量而賦予對於目標化合物的親和性，因此配體的種類及導入量可根據用途等而適宜選擇。配體的種類有離子交換基、疏水基、親和基等，具體而言可列舉二乙基氨基、氨基乙基、羧基甲基、碸乙基、碸、苯基、磷酸酯基、硫酸酯基、苯基硼酸基、蛋白A(pr0tein Α)、其他具有親和性的反應性官能基等。本發明的色譜用填充劑可通過如下方式而容易地獲得於本發明的多孔性纖維素類凝膠的反應性官能基的至少一部分上加成配體。例如，通過於本發明的多孔性纖維素類凝膠所具有的反應性官能基(例如羥基等)的至少一部分上導入磺醯基，可獲得適於溶菌酶及免疫球蛋白等蛋白質的分離純化的色譜用填充劑。或者，通過於本發明的多孔性纖維素類凝膠所具有的反應性官能基(例如羥基等)的至少一部分上導入硫酸酯基，可獲得適於溶菌酶、血液凝固因子IX、免疫球蛋白等的分離純化的色譜用填充劑。例如，於本發明的多孔性纖維素類凝膠中導入磺醯基時，可以如下所示的方式而進行。首先，於反應容器中準備磺化劑。磺化劑可列舉3-氯-2-羥基丙磺酸鈉或3-溴丙磺酸鈉等滷代烷烴磺酸；1，4_ 丁磺酸內酯或1，2_環氧乙磺酸等具有環氧化合物的磺酸等。該些磺化劑中，優選使用1，4_ 丁磺酸內酯或1，2_環氧乙磺酸等具有環氧化合物的磺酸。磺化劑的使用量可根據目標磺醯基的導入率及反應條件而任意選擇，例如優選相對於多孔性纖維素類凝膠中的反應性官能基而言使用0. 001當量 1當量。其次，將乾燥的多孔性纖維素類凝膠添加於磺化劑中而使其反應。反應溫度及反應時間因溶劑或磺化劑的種類而異，於惰性氣體中、通常為0°c 100°C、優選為20°C 85°C下，優選進行0. 5小時 24小時，更優選進行0. 5小時 10小時。於反應結束後，亦可於反應混合物中添加鹼性水溶液、例如氫氧化鈉水溶液而進行中和。其後，對所得的反應混合物進行過濾或離心分離，由此而回收生成物，以水將其清洗為中性，從而可獲得目標物質。磺醯基的導入量可通過變更磺化劑的使用量等而進行調整，可根據色譜法填充劑的用途等而適宜決定。具體而言，可通過增加磺化劑的使用量而增加磺醯基的導入量。磺醯基的導入方法的詳細情況可參照日本專利特開2001-302702號公報及日本專利特開平9-235301號公報等。本發明的色譜用填充劑中的配體的導入量並無特別的限制，自可獲得所期望的吸附特性的方面考慮，以離子交換容量計而言優選為0. 13mmol/ml 0. 30mmol/ml，特別優選為0. 15mmol/ml以上。而且，特別優選為0. 20mmol/ml以下。另外，於本說明書中，所謂「離子交換容量」是表示每體積凝膠的配體摩爾量。具體的測定方法如實例中所示。而且，於本發明的多孔性纖維素類凝膠中導入硫酸酯基時，可通過如下方式而進行。至於將硫酸酯基導入至本發明的多孔性纖維素類凝膠中，例如可利用美國專利第 4，480，091號說明書或日本專利特開2006-274245號公報等中所揭示的通常已知的方法， 亦即，於二甲基甲醯胺或吡啶等溶劑中使硫酸化劑與氯磺酸作用的方法。此時硫酸化劑的使用量因目標粒子的硫含量而異，纖維素凝膠與硫酸化劑的重量比(纖維素凝膠硫酸化劑)優選100 10 100 100的範圍，更優選100 10 100 50的範圍。反應因溶劑、硫酸化劑的種類而異，於惰性氣體中，於0°C 100°C、優選為20°C 85°C下，進行0. 5 小時 M小時，優選進行0. 5小時 10小時。其後，通過對所得的反應混合物進行過濾或離心分離而回收生成物，用水加以清洗使其成為中性，從而可獲得目標物質。硫酸酯基的導入量可如上所述根據硫酸化劑的裝入量等而進行調整，可根據色譜法填充劑的用途等而適宜決定。具體而言，可通過提高硫酸化劑相對於纖維素凝膠的重量比率，而增加硫酸酯基的導入量。本發明的色譜用填充劑中的硫酸酯基的導入量並無特別的限制，為了獲得所期望的吸附特性，以硫含量計而言優選為5000ppm 60000ppm，特別優選為IOOOOppm以上。而且，特別優選為50000ppm以下。另外，於本說明書中，所謂「硫含量」是表示硫重量份佔多孔性纖維素凝膠的總乾燥重量的比例。具體的測定方法如實例中所示。本發明的色譜用填充劑特別適宜用於免疫球蛋白的分離純化。通過使用本發明的多孔性纖維素類凝膠，可效率良好地導入所期望量的磺醯基，因此可賦予對於免疫球蛋白的親和性。根據本發明的優選實施例，本發明的色譜用填充劑中的免疫球蛋白的吸附量為 110mg/ml 250mg/ml。另外，根據本發明的優選實施例，對磺醯基的導入量進行適宜調整， 可獲得相對於免疫球蛋白而言為150mg/ml 250mg/ml、更優選為190mg/ml 250mg/ml的吸附量，可提供可用於免疫球蛋白的分離純化的色譜用填充劑。另外，於本說明書中，所謂 「免疫球蛋白的吸附量」是表示通過實例中所示的測定方法而測定的每體積凝膠的免疫球蛋白的吸附量。配體為硫酸酯基的本發明的數種實施例的色譜用填充劑可作為代替肝素凝膠的色譜用填充劑而適宜地利用。本實施例的色譜用填充劑可適宜地用於溶菌酶等各種蛋白質的分離純化。優選本實施例的色譜用填充劑中的溶菌酶的吸附量為50mg/ml 250mg/ml。 另外，通過適宜調整硫酸酯的導入量，可獲得相對於溶菌酶而言為100mg/ml 250mg/ml的吸附量，可提供可用於溶菌酶的分離純化的色譜用填充劑。另外，於本說明書中，所謂「溶菌酶的吸附量」是表示通過實例中所示的測定方法而測定的每體積凝膠的溶菌酶的吸附量。另外，通過使用本發明的色譜用填充劑對免疫球蛋白進行分離純化，可以簡便的方法而提供高純度的免疫球蛋白製劑。或者，將本發明的數種實施例的色譜用填充劑用作代替肝素凝膠的色譜用填充劑，自血漿中等分離純化血液製劑，由此可以簡便的方法而提供血液製劑。另外，於本說明書中所記載的所有文獻及刊行物無論是否為該目的，均通過參照而將其全體併入至本說明書中。而且，本說明書包含成為本申請的優選權主張的基礎的日本專利申請，亦即日本專利特願2009-37651號(於2009年2月20日提出申請)以及日本專利特願2009-260183號(於2009年11月13日提出申請)的權利要求範圍、說明書、以及附圖的揭示內容。實例以下，列舉實例對本發明加以更詳細的說明，但本發明並不限定於該些實例。〈參考例1>交聯纖維素粒子的調製依照色譜法雜誌(Journalof Chromatography)，195 (1980)、221_230、日本專利特開昭55-44312號公報中所記載的方法，以如下方式而製造使硫氰酸鈣的60wt%水溶液中所溶解的纖維素濃度為6% (w/w)或10% (w/w)的纖維素粒子。(A)6%球狀纖維素粒子的製造(1)於IOOg的硫氰酸鈣的60wt%水溶液中添加6. 4g的結晶性纖維素(旭化成化學株式會社製造、商品名=Ceolus PH101)，加熱至110°C 120°C而使其溶解。(2)於該溶液中添加作為表面活性劑的山梨醇酐單油酸酯6g，滴加至預先加熱為 130°C 140°C的鄰二氯苯480ml中，以200rpm 300rpm進行攪拌分散。(3)其次，將上述分散液冷卻至40°C以下，注入至甲醇190ml中，獲得粒子的懸浮液。(4)過濾分離該懸浮液，以甲醇190ml對粒子進行清洗，進行過濾分離。進行數次該清洗操作。(5)進一步以大量水進行清洗後，獲得目標球狀纖維素粒子。(6)其次，用篩子對球狀纖維素粒子進行篩選，使其成為所期望的粒子大小間隔 (50 μ m 150 μ m、平均粒徑 100 μ m)。(B) 10%球狀纖維素粒子的製造除了使6. 4g的結晶性纖維素使用10. Og的結晶性纖維素以外，與上述6%球狀纖維素粒子的製造同樣地進行而獲得10%球狀纖維素粒子。其次，利用孔徑M μ m (線徑0.04mm)與孔徑125 μ m (線徑0. 088mm)的金屬絲網篩的篩操作對所得的纖維素粒子進行分級。分級後的纖維素粒子的平均粒徑為100 μ m，水溶脹度分別是於6 %纖維素粒子中為16. 4ml/g,於10%纖維素粒子中為9. 6ml/g。其次，依照下述方法對所得的纖維素粒子進行交聯。(A)交聯6%纖維素粒子的調製(1)將上述所得的6%球狀纖維素粒子IOOg(含水率為10. 8)添加於在121g的純水中溶解有60g Na2SO4W溶液中，進行攪拌。使混合物的溫度成為50°C而繼續攪拌2小時。(2)其次，於該混合物中添加45wt%的NaOH水溶液3. 3g與NaBH4O. 5g而進行攪拌。初始鹼濃度[NaOH] % 0. 69% (w/w)。(3) 一面於50°C下繼續混合物的攪拌，一面每隔15分鐘以大約6小時添加將45wt%的NaOH水溶液48g、表氯醇50g分別25等分的量。(4)添加結束後，使該混合物於50°C的溫度下反應16小時。(5)將該混合物冷卻至溫度40°C以下，然後添加乙酸2. 6g而進行中和。(6)對反應混合物進行過濾而回收凝膠，以純水進行過濾清洗，獲得目標的交聯 6%纖維素粒子。所得的交聯6%纖維素粒子的水溶脹度、平均粒徑、以及使用標準聚環氧乙烷 (東曹公司製造)SE-5(重量平均分子量為4. 3X IO4Da)或SE-15 (重量平均分子量為 1. 5X IO5Da)且以純水為流動相而測定的Kav如下所示。水溶脹度ll.^il/g平均粒徑100 μ m凝膠分配係數Kav 0. 38 (SE-15)、0. 60 (SE-5)(B)交聯10%纖維素粒子的調製(1)將上述所得的10%球狀纖維素粒子100g(含水率6. 3)添加於在的純水中溶解有104g Na2SO4的溶液中，進行攪拌。使混合物的溫度成為50°C而繼續攪拌2小時。(2)其次，於該混合物中添加45wt %的NaOH水溶液5. 7g與NaBH4O. 9g而進行攪拌。初始鹼濃度[NaOH] % 0. 69% (w/w)。(3) 一面於50°C下繼續混合物的攪拌，一面每隔15分鐘以大約6小時添加將 45wt%的NaOH水溶液83g、表氯醇85g分別25等分的量。(4)添加結束後，使該混合物於50°C的溫度下反應16小時。(5)將該混合物冷卻至溫度40°C以下，然後添加乙酸4. Og而進行中和。(6)對反應混合物進行過濾而回收凝膠，以純水進行過濾清洗，獲得目標的交聯 10%纖維素粒子。所得的交聯10%纖維素粒子的水溶脹度、平均粒徑、以及使用標準聚環氧乙烷 (東曹公司製造)SE-5(重量平均分子量為4. 3X I(^Da)或SE-15 (重量平均分子量為 1. 5X IO5Da)且以純水為流動相而測定的Kav如下所示。水溶脹度7. lml/g平均粒徑100 μ m凝膠分配係數Kav 0. 27 (SE-15)、0. 47 (SE-5)其次，為了使多糖類加成於交聯纖維素粒子上，通過下述方法而於交聯纖維素粒子中導入環氧基。〈參考例2A>交聯6 %纖維素粒子的環氧化於IL可分離式燒瓶中放入抽濾的交聯6%纖維素粒子200g。於其中放入純水 160ml，蓋上蓋子而將該燒瓶浸入至30°C的溫浴中。於燒瓶內的溫度成為30°C後，添加氫氧化鈉水溶液(氫氧化鈉Mg、純水133g)與表氯醇120g，於30°C下攪拌2小時。2小時後，對反應混合物進行抽濾，以3倍量的純水對所得的溼凝膠進行5次清洗。於清洗後，對所得的凝膠進行抽濾而除去剩餘的水分，於溼凝膠的狀態下進行保存。〈參考例2B>
交聯10%纖維素粒子的環氧化除了使用交聯10%纖維素粒子代替交聯6%纖維素粒子以外，以與參考例2A同樣的順序進行環氧化反應。其次，於參考例2A或參考例2B中所得的環氧化交聯纖維素粒子上加成葡聚糖而獲得多孔性纖維素類凝膠，進一步對其進行磺化處理而獲得色譜用填充劑。〈實例1>於500ml的可分離式燒瓶中加入純水43g與葡聚糖70 (名糖產業、極限粘度為
0.23dL/g、重量平均分子量約為70，000) 32. Og,於室溫下進行攪拌直至溶解。於溶解後，於其中添加參考例2A中所得的溼凝膠60g，於30°C下進行1小時的攪拌。其次，於該燒瓶中添力45% (w/w)氫氧化鈉水溶液6. 6g，直接於30°C下攪拌18小時。 於18小時後對反應混合物進行抽濾，以3倍量的純水對所得的溼凝膠進行5次清洗。於清洗後，對溼凝膠進行抽濾而除去剩餘的水分，於溼凝膠的狀態下進行保存。於標準聚環氧乙烷(東曹公司製造)SE-5(重量平均分子量為4.3X104)中使用純水作為流動相而求出的 Kav為0.30。相對於參考例I(A)中所得的交聯6%纖維素的Kav的比例為50%。而且， 所得的溼凝膠的每單位體積的乾燥重量是交聯6%纖維素粒子的每單位體積的乾燥重量的
1.06 倍。另外，於50ml的帶塞錐形燒瓶中放入所得的溼凝膠5g。於其中放入硫酸鈉(和光純藥)5g、氫氧化鈉水溶液(氫氧化鈉0. 98g、純水7. Sg)，於50°C的恆溫箱中進行30分鐘的攪拌。於30分鐘後，添加1，4_ 丁磺酸內酯(和光純藥)1.41g，於50°C下攪拌6小時。 於6小時後，對反應溶液進行抽濾，以5倍量的純水對所得的凝膠進行5次清洗。於清洗後， 對所得的凝膠進行抽濾而除去剩餘的水分，於溼凝膠的狀態下進行保存。如此而獲得導入了磺醯基作為配體的溼凝膠。此時的離子交換容量為0. 17mmol/ml，γ-球蛋白10%動態吸附容量為146mg/ml。〈實例2>除了使葡聚糖70為24. Sg而進行實施以外，與實例1同樣地進行而獲得溼凝膠。 於標準聚環氧乙烷(東曹公司製造)SE-5(重量平均分子量為4.3X104)中使用純水作為流動相而求出的Kav為0. 37。相對於參考例1 (A)中所得的交聯6 %纖維素的Kav的比例為62%。而且，所得的溼凝膠的每單位體積的乾燥重量是交聯6%纖維素粒子的每單位體積的乾燥重量的1.09倍。另外，與實例1同樣地使用1，4_ 丁磺酸內酯1^8g，對所得的凝膠進行磺化，於溼凝膠的狀態下進行保存。此時的離子交換容量為0. 13mmol/ml，Y -球蛋白10%動態吸附容量為12ang/ml。〈實例3>使用高分子葡聚糖EH(名糖產業、極限粘度為0.42dL/g、重量平均分子量約為 178，000 218，000) 17. 5g而代替葡聚糖70，除此以外與實例1同樣地進行而獲得溼凝膠。 於標準聚環氧乙烷(東曹公司製造)SE-5(重量平均分子量為4.3X104)中使用純水作為流動相而求得的Kav為0. 17。相對於參考例1㈧中所得的交聯6%纖維素的Kav的比例為觀％。而且，所得的溼凝膠的每單位體積的乾燥重量是交聯6%纖維素粒子的每單位體積的乾燥重量的1.11倍。
另外，與實例1同樣地使用1，4_ 丁磺酸內酯1.39g而對所得的凝膠進行磺化，於溼凝膠的狀態下進行保存。此時的離子交換容量為0. 15mmol/ml，γ-球蛋白10%動態吸附容量為12%ig/ml。〈實例4>使用高分子葡聚糖EH 33. Og而代替葡聚糖70，除此以外與實例1同樣地進行而獲得溼凝膠。於標準聚環氧乙烷(東曹公司製造)SE-5(重量平均分子量為4.3X104)中使用純水作為流動相而求出的Kav為0. 03。相對於參考例1 (A)中所得的交聯6%纖維素的 Kav的比例為5%。而且，所得的溼凝膠的每單位體積的乾燥重量是交聯6%纖維素粒子的每單位體積的乾燥重量的1. 34倍。另外，與實例1同樣地使用1，4_ 丁磺酸內酯1.57g而對所得的凝膠進行磺化，於溼凝膠的狀態下進行保存。此時的離子交換容量為0. 19mmol/ml，γ-球蛋白10%動態吸附容量為Mlmg/ml。〈實例5>使用葡聚糖T500(製藥宇宙(Pharmacosmos)、重量平均分子量為500kDa、極限粘度為0. 64dL/g) 10. 9g代替葡聚糖70，除此以外與實例1同樣地進行而獲得溼凝膠。於標準聚環氧乙烷(東曹公司製造)SE-5(重量平均分子量為4.3X104)中使用純水作為流動相而求得的Kav為0. 21。相對於參考例1 (A)中所得的交聯6%纖維素的Kav的比例為35%。 而且，所得的溼凝膠的每單位體積的乾燥重量是交聯6%纖維素粒子的每單位體積的乾燥重量的1. 10倍。另外，與實例1同樣地使用1，4_ 丁磺酸內酯1.29g而對所得的凝膠進行磺化，於溼凝膠的狀態下進行保存。此時的離子交換容量為0. 14mmol/ml，γ-球蛋白10%動態吸附容量為117mg/ml。〈實例6>使用葡聚糖T500 17. 3g而代替葡聚糖70，除此以外與實例1同樣地進行而獲得溼凝膠。於標準聚環氧乙烷(東曹公司製造)SE-5(重量平均分子量為4.3X104)中使用純水作為流動相而求得的Kav為0. 17。相對於參考例1㈧中所得的交聯6%纖維素的Kav的比例為觀％。而且，所得的溼凝膠的每單位體積的乾燥重量是交聯6%纖維素粒子的每單位體積的乾燥重量的1. 22倍。另外，與實例1同樣地使用1，4_ 丁磺酸內酯1.41g而對所得的凝膠進行磺化，於溼凝膠的狀態下進行保存。此時的離子交換容量為0. 14mmol/ml，γ-球蛋白10%動態吸附容量為199mg/ml。〈實例7>使用葡聚糖T500 24. 5g代替葡聚糖70，除此以外與實例1同樣地進行而獲得溼凝膠。於標準聚環氧乙烷(東曹公司製造)SE-5(重量平均分子量為4.3X104)中使用純水作為流動相而求得的Kav為0. 02。相對於參考例1 (A)中所得的交聯6%纖維素的Kav的比例為3%。而且，所得的溼凝膠的每單位體積的乾燥重量是交聯6%纖維素粒子的每單位體積的乾燥重量的1.34倍。另外，與實例1同樣地使用1，4_ 丁磺酸內酯1.55g而對所得的凝膠進行磺化，於溼凝膠的狀態下進行保存。此時的離子交換容量為0. 17mmol/ml，γ-球蛋白10%動態吸附容量為217mg/ml。使用葡聚糖40(名糖產業、極限粘度為0. 17dL/g、重量平均分子量約為 40，000) 33g而代替葡聚糖70，除此以外與實例1同樣地進行而獲得溼凝膠。於標準聚環氧乙烷(東曹公司製造)SE-5(重量平均分子量為4.3X104)中使用純水作為流動相而求得的Kav為0. 42。相對於參考例1 (A)中所得的交聯6%纖維素的Kav的比例為70%。而且， 所得的溼凝膠的每單位體積的乾燥重量是交聯6%纖維素粒子的每單位體積的乾燥重量的 1. 10 倍。另外，與實例1同樣地使用1，4- 丁烷磺內酯1. 29g而對所得的凝膠進行磺化，於溼凝膠的狀態下進行保存。此時的離子交換容量為0. 13mmol/ml，γ-球蛋白10%動態吸附容量為101mg/ml。〈比較例2>使用葡聚糖70(名糖產業、極限粘度為0.23dL/g、重量平均分子量約為 70，000) 17. 5g，除此以外與實例1同樣地進行而獲得溼凝膠。於標準聚環氧乙烷(東曹公司製造)SE-5 (重量平均分子量為4. 3 X IO4)中使用純水作為流動相而求得的Kav為0. 43。 相對於參考例I(A)中所得的交聯6%纖維素的Kav的比例為72%。而且，所得的溼凝膠的每單位體積的乾燥重量是交聯6%纖維素粒子的每單位體積的乾燥重量的1. 04倍。另外，與實例1同樣地使用1，4_ 丁磺酸內酯1.23g而對所得的凝膠進行磺化，於溼凝膠的狀態下進行保存。此時的離子交換容量為0. 13mmol/ml，γ-球蛋白10%動態吸附容量為70mg/ml。〈比較例3>使用高分子葡聚糖EH(名糖產業、極限粘度為0.42dL/g、重量平均分子量約為 200，000) 11. Og代替葡聚糖70，除此以外與實例1同樣地進行而獲得溼凝膠。於標準聚環氧乙烷(東曹公司製造)SE-5(重量平均分子量為4. 3X IO4)中使用純水作為流動相而求得的Kav為0. 32。相對於參考例1的交聯6%纖維素的Kav的比例為53%。而且，所得的溼凝膠的每單位體積的乾燥重量是交聯6%纖維素粒子的每單位體積的乾燥重量的1. 05倍。另外，與實例1同樣地使用1，4_ 丁磺酸內酯1.26g而對所得的凝膠進行磺化，於溼凝膠的狀態下進行保存。此時的離子交換容量為0. 12mmol/ml，γ-球蛋白10%動態吸附容量為76mg/ml。將實例1 實例7及比較例1 比較例3的結果匯總於表1中。[表 1]表權利要求
1.一種多孔性纖維素類凝膠，其是於多孔性纖維素粒子上加成具有0.21dL/g 0.90dL/g的極限粘度的多糖類而成的多孔性纖維素類凝膠，其特徵在於所述多孔性纖維素類凝膠的每單位體積的乾燥重量是所述多孔性纖維素粒子的每單位體積的乾燥重量的1.06倍 1. 40倍。
2.根據權利要求1所述的多孔性纖維素類凝膠，其中，所述多孔性纖維素粒子具有 30 μ m 200 μ m的粒徑，且具有0. 15 0. 6的凝膠分配係數，其中所述凝膠分配係數以於重量平均分子量為1. 5X IO5Da的標準聚環氧乙烷中使用純水作為流動相時的Kav表示。
3.根據權利要求1或2所述的多孔性纖維素類凝膠，其中，所述多糖類是葡聚糖。
4.根據權利要求1或2所述的多孔性纖維素類凝膠，其中，所述多糖類是普魯蘭多糖。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的多孔性纖維素類凝膠，其中，所述多孔性纖維素粒子是具有5ml/g 20ml/g的水溶脹度的交聯纖維素粒子。
6.一種色譜用填充劑，其是於根據權利要求1至5中任一項所述的多孔性纖維素類凝膠上加成配體而成。
7.根據權利要求6所述的色譜用填充劑，其中，所述配體是磺醯基。
8.根據權利要求7所述的色譜用填充劑，其中，所述配體的導入量以離子交換容量計而言為 0. 13mmol/ml 0. 30mmol/mlo
9.根據權利要求6所述的色譜用填充劑，其中，所述配體是硫酸酯基。
10.根據權利要求9所述的色譜用填充劑，其中，所述配體的導入量以硫含量計而言為 5000ppm 60000ppm。
11.根據權利要求6至8中任一項所述的色譜用填充劑，其用於免疫球蛋白純化。
12.根據權利要求11所述的色譜用填充劑，其中，免疫球蛋白的吸附量為150mg/ml 250mg/ml。
13.根據權利要求12所述的色譜用填充劑，其中，免疫球蛋白的吸附量為190mg/ml 250mg/ml。
14.一種色譜用填充劑的製造方法，其包含於多孔性纖維素類凝膠上加成配體的步驟， 所述多孔性纖維素類凝膠是於多孔性纖維素粒子上加成具有0. 21dL/g 0. 90dL/g的極限粘度的多糖類而成的多孔性纖維素類凝膠，且所述多孔性纖維素類凝膠的每單位體積的乾燥重量是所述多孔性纖維素粒子的每單位體積的乾燥重量的1. 06倍 1. 40倍。
15.根據權利要求14所述的方法，其中，所述多孔性纖維素粒子具有30μ m 200 μ m 的粒徑，且具有0. 15 0. 6的凝膠分配係數，其中所述凝膠分配係數以於重量平均分子量為1. 5X IO5Da的標準聚環氧乙烷中使用純水作為流動相時的Kav表示。
16.根據權利要求14或15所述的色譜用填充劑的製造方法，其中，所述多糖類是葡聚糖。
17.根據權利要求14或15所述的色譜用填充劑的製造方法，其中，所述多糖類是普魯蘭多糖。
18.一種免疫球蛋白製劑的製造方法，其包含使用如權利要求6至8及11至13中任一項所述的填充劑而對免疫球蛋白進行分離純化的步驟。
全文摘要
提供一種流速特性與吸附特性均得到改善的色譜用填充劑。特別是提供一種適於抗體醫藥製造中的免疫球蛋白的分離純化的色譜用填充劑。使用一種多孔性纖維素類凝膠，其是於多孔性纖維素粒子上加成具有0.21dL/g～0.90dL/g的極限粘度的多糖類而成的多孔性纖維素類凝膠，且所述多孔性纖維素類凝膠的每單位體積的乾燥重量是所述多孔性纖維素粒子的每單位體積的乾燥重量的1.06倍～1.40倍。通過於多孔性纖維素粒子上加成規定量的具有規定極限粘度的多糖類，可改善流速特性與吸附特性。
文檔編號C07K1/18GK102326075SQ20108000827
公開日2012年1月18日 申請日期2010年2月18日 優先權日2009年2月20日
發明者戸所正美, 松本吉裕, 梅田靖人, 青山茂之 申請人:Jnc株式會社