增強腦膜炎球菌疫苗接種免疫原性的方法

2023-10-27 14:58:37 3

專利名稱：增強腦膜炎球菌疫苗接種免疫原性的方法
本申請要求2003年5月7日提交的美國臨時專利申請號60/468,581的優先權，其在文中全部公開引用作為參考。
背景技術：
1.發明領域
本發明總的來說涉及醫學領域，並且更具體的涉及到微生物學、免疫學、疫苗以及通過免疫對細菌病原體感染的預防。
2.相關領域概述
腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)是全球細菌性腦膜炎和膿毒症的主要原因。在最近的30年中，地方性腦膜炎球菌疾病的發生率在發達國家為每100,000人中有1到5人，而在發展中國家為每100,000人中有10到25人(Reido，F.X.等，(1995)Ped.Infect.Dis.J.14，643-657頁)。流行期間腦膜炎球菌疾病的發病率可達每1000,000人中有1,000人。在美國，每年大約有2,600例細菌性腦膜炎病例，而在發展中國家平均有330,000例。病例致死率在10到20％之間。
病原腦膜炎球菌被附著在生物體外膜表面的多糖莢膜所包被。基於莢膜多糖的免疫學特異性，已經鑑定出13種不同的腦膜炎球菌血清群(Frasch，C.E.等，(1985)Rev.Infect.Dis.7，504-510頁)。在這13個血清群當中有5個引起了大多數的腦膜炎球菌疾病；它們包括血清群A、B、C、W135和Y。血清群A引起大部分流行性疾病。血清群B、C和Y引起大多數的地方病和疾病的區域性爆發。
人類鼻-口咽黏膜是唯一已知的腦膜炎奈瑟氏球菌的天然貯庫。細菌在黏膜細胞的外表面以及鼻咽的皮下組織定居。腦膜炎球菌可被持續攜帶幾個月。腦膜炎球菌通過直接接觸或通過空氣飛沫傳播。腦膜炎球菌是以吞噬泡的形式通過胞吞作用經由黏膜上皮侵入的。對入侵的腦膜炎球菌的宿主防禦依賴於補體介導的溶菌作用。在補體介導的溶菌作用中發揮作用的血清抗體相當大部分直接針對外部莢膜多糖。
已經描述了基於腦膜炎球菌多糖的疫苗，其引起針對莢膜多糖的免疫應答。這些抗體可以對血清群特異性腦膜炎球菌引起補體介導的溶菌作用。腦膜炎球菌多糖疫苗顯示對兒童和成人有效(Peltola，H.等，(1997)NewEngl.J.Med 297，686-691頁和Artenstein，M.S.等，(1970)New Engl.J.Med.282，417-420頁)，但對嬰兒和幼兒期效能有限(Reingold，A.L.等，(1985)Lancet 2，14-118頁)。對年幼群體，此多糖的後繼給藥產生弱加強應答或無加強應答(Goldschneider，I.等，(1973)J.Infect.Diseases 128，769-776頁和Gold，R.等，(1977)J.Infect.Diseases.136，S31-S35頁)。腦膜炎球菌多糖疫苗的保護期不能持續很長，並且據估計對成人和大於4歲的兒童而言為3到5年(Brandt，B.L.和Artenstein，M.S.(1975)J.Infect.Diseases.131，S69-S72頁；Kyhty，H.等，(1980)J.Infect.Diseases.142，861-868頁，和Cessey，S.J.等，(1993)J.Infect.Diseases.167，1212-1216頁)。對1到4歲的兒童而言保護期少於3年(Reingold，A.L.等，(1985)Lancet 2，114-118頁)。
多糖不能與主要組織相容性複合體分子結合，而這是抗原呈遞和刺激T-輔助淋巴細胞的前提條件，即它們是非T-細胞依賴性抗原。多糖能夠不需要T-輔助淋巴細胞的輔助而刺激B淋巴細胞產生抗體。由於對B淋巴細胞的非T-細胞依賴性刺激，這些抗原免疫後缺乏記憶誘導。在成人體內，多糖抗原可以產生非常有效的非T-細胞依賴性應答，但在嬰兒和幼兒的不成熟免疫系統中這些非T-細胞依賴性應答卻很弱。
非T-細胞依賴性多糖抗原可以通過將多糖共價綴合至蛋白質分子(「載體」或「載體蛋白質」)上而轉變為T-細胞依賴性抗原。與綴合疫苗的多糖組分結合的B細胞可以被肽特異的T輔助細胞激活，所述肽為綴合的載體蛋白質的一部分。對載體蛋白質的T-輔助細胞應答可以增加針對多糖的抗體的產生。
已經證明，血清群B多糖在人群中具有極弱的免疫原性至無免疫原性(Wyle，F.A.等，(1972)J.Infect.Diseases.126，514-522頁)。這一血清群多糖與蛋白質的化學綴合在實驗動物中沒有顯著改變免疫應答(Jennings，H.J.和Lugowski，C.(1981)J.Immunol.127，1011-1018頁)。據認為對這一血清群多糖缺乏免疫應答的原因是血清群B多糖與多唾液酸化的宿主糖蛋白如神經細胞粘附分子之間的結構相似性。
一種基於血清群C多糖的腦膜炎球菌綴合疫苗已有敘述。這種單價疫苗可引起針對相應於血清群C的腦膜炎奈瑟氏球菌株系上存在的莢膜多糖的強功能抗體應答。這種疫苗僅僅能夠預防由血清群C細菌引起的疾病。
現有的基於腦膜炎球菌多糖的疫苗對幼兒的用途有限，而且不能為成人提供長時間保護。已被證實能夠對所有有危險感染腦膜炎球菌的群體(包括兒童)產生長時間保護的唯一腦膜炎球菌疫苗是基於腦膜炎奈瑟氏球菌單一血清群的多糖，其不能提供針對其它血清群感染的保護。因此，就需要一種能夠在腦膜炎球菌感染的易感兒童和成人中對腦膜炎球菌疾病產生廣譜、長效保護的腦膜炎球菌綴合疫苗。本發明的多價腦膜炎球菌多糖通過提供疫苗製劑解決了這一需要，其中在所述製劑中來源於腦膜炎奈瑟氏球菌主要致病血清群的免疫原性多糖通過與載體蛋白質綴合而轉變成T-細胞依賴性抗原。
美國食品藥品管理局(FDA)頒發的腦膜炎球菌多糖疫苗許可證是基於使用幼兔補體的殺菌力試驗方法(SBA-BR)，該方法是通過用所許可疫苗免疫後的血液樣品進行的。許多政府和專家小組公布了在此類試驗方法中評價腦膜炎球菌多糖疫苗的目前規程和推薦意見，例如
世界衛生組織生物製品標準化專家委員會(WHO ExpertCommittee on Biological Standardization)指出用針對腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A和C的腦膜炎球菌疫苗免疫健康成年受試者可誘導產生殺菌抗體(WHO 1976)；
國際比較研究中的CDC SB-BR建立了用於使用標準參考品血清即CDC供體R21654-3430107測定法的標準化參數，所述血清是比較研究中質量控制血清樣品之一(Maslanka SE等，1997.Clin.Diagn.Lab.Immunol.4156-167)；和
世界衛生組織疫苗和生物製品開發專家委員會(WHO ExpertCommittee of the Department of Vaccines and Biologicals)推薦的標準化CDC方法作為最佳方法(WHO 1999)。
由於已經證明人類對腦膜炎球菌疾病的免疫性與血清殺菌力試驗(SBA)中補體介導殺菌的抗體水平密切相關，所以同意頒發許可證(Goldschneider，I等，1969，J.Exp.Med.1291307-1326和Goldschneider，I等，1969，J.Exp.Med.1291327-1348)。在使用人補體的殺菌力試驗(SBA-H)中，已經確定了抗血清群C的1∶4 SBA滴度的替代水平。但是，對腦膜炎球菌多糖疫苗許可的必要條件是基於在使用幼兔補體作為補體來源的試驗中(SBA-BR)能夠誘導血清殺菌反應(世界衛生組織(World HealthOrganization)，1976，Requirements for meningococcal polysaccharidevaccine。世界衛生組織技術報告系列，第594號。世界衛生組織，Geneva，瑞士(WHO，1976))。根據此建議，受試者免疫接種腦膜炎球菌多糖疫苗2-4周後，檢測其抗下列靶菌株或同等菌株(Al對應血清群A，C11對應血清群C，S-1975對應血清群Y，且S-4383對應血清群W-135)時發現至少90％受試者的血清抗體滴度升高4倍或更多(WHO 1976，WHO 1981，生物製品局(Bureau of Biologics)，美國食品藥品管理局，1985年7月17日)。生物製品局採納了WHO的建議，並且根據此規程腦膜炎球菌多糖疫苗(血清群A和C組合以及血清群A、C、Y和W-135組合)在美國得到許可。為了利於各實驗室之間對腦膜炎球菌疫苗誘導的殺菌活性的比較，經過多實驗室研究建立了一種利用幼兔補體的標準化SBA(SBA-BR)(MaslankaSE等，1997.Clin.Diagn.Lab.Immunol.4156-167.)。
由於腦膜炎球菌綴合C疫苗的資料開始可以得到，開始出現如下的擔心，即在分析中使用幼兔補體可能導致假的高SBA滴度。在1999年3月召開的澄清和解決關於實驗室測定法用於分析人腦膜炎球菌血清群A和C特異性抗體的問題的會議之後，世界衛生組織生物製品標準化專家委員會建議使用幼兔補體的SBA可以用於檢測對血清群C的抗體反應(世界衛生組織，1999.Standardization and validation of serological assays for theevaluation of immune responses to Neisseria meningitidis serogroup A/Cvaccines.Geneva，WHO/V&B/99.19(WHO 1999))。為了盡力避免使用幼兔補體對保護作用的過高評價，WHO建議開展研究以便將通過使用幼兔補體的SBA試驗所測定的SBA閾值滴度與使用人補體所測定的SBA滴度關聯起來。隨後召開了會議，得出的結果支持這樣一個總的結論使用幼兔補體時＜1∶8的SBA滴度缺乏抗血清群C的保護作用，而使用幼兔補體時≥1∶128的SBA滴度與使用人補體時的1∶4保護性SBA滴度密切相關。沒有信息提供對於其它腦膜炎球菌血清群如A、Y或W-135或多糖綴合物的相應關聯SBA-BR滴度。
使用幼兔補體時的1∶8和1∶64之間的SBA滴度沒有必要與使用人補體時1∶4的保護性SBA滴度密切相關(Jodar L等，Biologicals 2002；30323-329)。WHO專家委員會推薦，接種疫苗後SBA-BR滴度為1∶8、1∶16、1∶32和1∶64時需要使用人補體進行再評價。解決1∶8、1∶16、1∶32和1∶64的SBA-BR滴度不確定性的其它措施包括經評價接種疫苗前和接種疫苗後之間的抗體SBA滴度的4倍升高。也提供了與保護作用相關聯的記憶性的示例，然而專家委員會承認有關這些替代品的可以得到的資料是不充分的或者是有限的。
高於1∶8的SBA-BR滴度是表明人對腦膜炎球菌疾病產生免疫性的較好的指標，該滴度是從免疫前至免疫後大約15至大約45天的免疫後階段內SBA-BR滴度的4倍升高或更高。
在一種實施方案中，本發明提供了用多價腦膜炎球菌多糖綴合組合物免疫病人的方法，其中病人血清SBA-BR滴度為1∶16或更高，優選地為1∶32或更高，更優選地為1∶64或更高，並且甚至更加優選地為1∶128或更高。在進一步的實施方案中，本發明提供了用腦膜炎球菌多糖綴合組合物免疫病人的方法，其中接種疫苗前後病人抗體SBA滴度升高4倍或更高。
在另一個實施方案中，本發明通過用多價腦膜炎球菌多糖綴合組合物免疫病人來為病人提供抗腦膜炎奈瑟氏球菌多種血清群免疫性的方法，其中組合物包含選自腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A和W-135；Y和W-135；C和Y；C和W-135；A、C和Y；A、C和W-135；C、Y和W-135；A、Y和W-135以及A、C、Y和W-135中的兩種或兩種以上多糖。
發明概述
本發明提供了向人體提供抗致病腦膜炎奈瑟氏球菌所致腦膜炎球菌疾病免疫性的方法，其是通過在施用腦膜炎球菌多糖免疫組合物的同時或施用第二個疫苗來實現的，其中第二個疫苗包含白喉、破傷風、百日咳FHA、百日咳PT或PRP的抗原並且在腦膜炎球菌疫苗施用的同時或者6個月內向病人施用第二個疫苗。
在本發明的一個實施方案中，免疫組合物包含兩種或兩種以上蛋白質-多糖綴合物，其中每種綴合物均包含與載體蛋白質綴合的來自腦膜炎奈瑟氏球菌的莢膜多糖。在優選的實施方案中，免疫組合物包含兩種或兩種以上不同的蛋白質-多糖綴合物，其中每種綴合物均包含與載體蛋白質綴合的來自腦膜炎奈瑟氏球菌不同血清群的莢膜多糖。
本發明提供了向人體提供抗致病腦膜炎奈瑟氏球菌所致腦膜炎球菌疾病免疫性的方法，其通過施用包含兩種或兩種以上不同蛋白質-多糖綴合物的免疫組合物實現的，其中每種綴合物均包含與載體蛋白質綴合的來自腦膜炎奈瑟氏球菌不同血清群的莢膜多糖。
本發明提供了向人體提供抗致病腦膜炎奈瑟氏球菌所致腦膜炎球菌疾病免疫性的方法，其通過施用腦膜炎球菌多糖-蛋白質綴合物實現的。本發明提供了多價腦膜炎球菌疫苗，其由包含免疫有效量的2-4種不同的蛋白質-多糖綴合疫苗，其中每一綴合物各包含與載體蛋白質綴合的不同莢膜多糖，並且其中每一莢膜多糖選自血清群A、C、W-135和Y的莢膜多糖。本發明還提供了誘導抗腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖的免疫反應的方法，其包括向人施用免疫有效量的本發明免疫組合物。在一個實施方案中，多價腦膜炎球菌疫苗包含免疫有效量的兩種不同的蛋白質-多糖綴合物，其中每一綴合物包含與載體蛋白質綴合的不同莢膜多糖，並且其中每一莢膜多糖選自血清群A、C、W-135和Y的莢膜多糖，更加優選地，多價腦膜炎球菌疫苗包含莢膜多糖A和W-135、A和Y、C和W-135、C和Y以及W-135和Y。在一個實施方案中，多價腦膜炎球菌疫苗包含免疫有效量的三種不同的蛋白質-多糖綴合物，其中每一綴合物包含與載體蛋白質綴合的不同莢膜多糖，並且其中每一莢膜多糖選自血清群A、C、W-135和Y的莢膜多糖，更加優選地，多價腦膜炎球菌疫苗包含莢膜多糖A、C和W-135；A、C和Y；C、Y和W-135；C、W-135和Y以及A、W-135和Y。在另一個實施方案中，多價腦膜炎球菌疫苗包含免疫有效量的四種不同的蛋白質-多糖綴合物，其中每一綴合物包含與載體蛋白質綴合的不同莢膜多糖，並且其中每一莢膜多糖選自血清群A、C、W-135和Y的莢膜多糖。
本發明還提供了誘導抗腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖的免疫反應的方法，其包括向人或動物施用免疫有效量的本發明免疫組合物。
本發明的優選實施方案使用了多價腦膜炎球菌疫苗，其包含免疫有效量的2-4種不同的蛋白質-多糖綴合疫苗，其中每一綴合物各包含與載體蛋白質綴合的不同莢膜多糖，並且其中每一莢膜多糖選自血清群A、C、W-135和Y的莢膜多糖。
本發明提供了保護易感染腦膜炎奈瑟氏球菌的人或動物的方法，其包括向人或動物施用免疫有效量的本發明疫苗。
本文引用的所有專利、專利申請以及其它出版物全文併入作為參考。
發明詳述
可以通過本領域技術人員已知的標準技術製備莢膜多糖。在本發明中莢膜多糖優選從腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y製備。
在優選的實施方案中，分別製備這些腦膜炎球菌血清群綴合物然後配製成單一劑量形式。例如，從腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y中分別純化莢膜多糖。
在本發明的優選實施方案中，純化的多糖在綴合至載體蛋白質前被解聚並活化。在本發明的優選實施方案中，利用溫和氧化條件將來源於腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y的莢膜多糖部分解聚。
在多糖解聚或部分解聚後可以接著進行活化步驟。「活化」是指對多糖進行化學處理以提供能夠與載體蛋白質反應的化學基團。優選的活化方法包括在15-30℃、pH 5.0±0.1下於生理鹽水中使用已二酸二醯肼處理約2小時。美國專利號5,965,714描述了一種活化方法。
一旦活化，就可以將莢膜多糖綴合到一種或多種載體蛋白質上。在本發明優選的實施方案中，每一莢膜多糖分別與單一載體蛋白質種類綴合。在優選的實施方案中，將來源於腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y的莢膜多糖分別綴合至同一種載體蛋白質上。
載體蛋白質可以包括細菌毒素如白喉毒素，失活的細菌毒素如白喉類毒素、CRM197、破傷風類毒素、百日咳類毒素、大腸桿菌(E.coli)LT、大腸桿菌ST以及來源於銅綠假單胞桿菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A。也可以使用細菌外膜蛋白，例如外膜複合體c(OMPC)、孔蛋白、轉鐵蛋白結合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)或肺炎球菌粘附素蛋白質(PsaA)。其它蛋白質如卵清蛋白、鑰孔血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或結核菌素純化蛋白衍生物(PPD)也可以作為載體蛋白質使用。載體蛋白質優選無毒和無反應原性並且可得到足夠量和足夠純度的蛋白質。載體蛋白質應經受得住標準綴合過程。在本發明的優選實施方案中，從喉棒桿菌(Corynebacteria diphtheriae)培養物純化並利用甲醛化學脫毒的白喉毒素被用作載體蛋白質。另外一種可供選擇的載體蛋白質是蛋白質D，它是流感嗜血桿菌(H.influenza)的外膜表面暴露蛋白。
在本發明的一個實施方案中，每一衍生多糖與載體蛋白質的平均比例為大約1∶1至大約1∶20(w/w)。在本發明的優選實施方案中，總的衍生多糖與載體蛋白質的平均比例為大約1∶2至大約1∶10(w/w)；並且每一衍生多糖與載體蛋白質的更加優選地平均比例為大約1∶2至大約1∶6(w/w)。在本發明的一個更加優選的實施方案中，總的衍生多糖與載體蛋白質的平均比例為大約1∶(4±1)，更加優選地為1∶(4±0.5)，甚至更加優選地為1∶(4±0.25)(w/w)。
在莢膜多糖與載體蛋白質綴合後，可以利用多種技術對多糖-蛋白質綴合物進行純化(就多糖-蛋白質綴合物的量而言為富集)。純化步驟的一個目的是從多糖-蛋白質綴合物中去除未結合的多糖。美國專利號6,146,902中描述了一種涉及在硫酸銨存在下進行超濾的純化方法。或者，可以通過許多標準技術從未反應的蛋白質和多糖中將綴合物純化出來，所述標準技術尤其包括大小排阻層析、密度梯度離心、疏水相互作用層析或硫酸銨分級分離等。參見，例如P.W.Anderson等(1986).J.Immunol.1371181-1186。還可見H.J.Jennings和C.Lugowski(1981)J.Immunol.1271011-1018。
在將多糖和載體蛋白質綴合後，可以通過組合多種衍生多糖-蛋白質綴合物來製備本發明的免疫組合物。本發明的免疫組合物包含與一種或一種以上的載體蛋白質綴合的兩種或兩種以上不同的莢膜多糖。本發明的優選實施方案是二價免疫組合物，其包含與白喉毒素或類毒素綴合的分別來源於腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A和C的衍生莢膜多糖。更優選地，本發明為四價免疫組合物，其包含與白喉毒素或類毒素綴合的分別來源於腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y的莢膜多糖。
載體蛋白質的製備和用途以及多種可能的綴合方法為本領域技術人員眾所周知。本發明綴合物可以通過這些技術人員利用本發明所教導以及在普通文獻上可輕易得到的信息來製備。也可以從以下美國專利的任意一個或全部中得到指導，其中這些專利的教導在此全部引用作為參考美國專利號4,356,170；4,619,828；5,153,312；5,422,427和5,445,817。
備選地，可以通過共同培養兩種或兩種以上腦膜炎奈瑟氏球菌血清群並且共純化、解聚、活化並綴合多糖，或者通過分別培養純化腦膜炎奈瑟氏球菌血清群並且在解聚、活化和綴合多糖的任何步驟之前或之後將兩種或兩種以上純化多糖混合來製備免疫組合物。
可以通過從不同的腦膜炎球菌血清群分別製備多糖-蛋白質綴合物然後將綴合物混合而製備本發明免疫組合物。本發明免疫組合物可以作為疫苗使用。本發明疫苗的配製可以利用本領域的已知方法完成。本發明的疫苗組合物還可以包含一種或一種以上的佐劑。佐劑包括(作為例子但不限於此)鋁佐劑(例如鋁鹽諸如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁或其組合)、弗氏佐劑(完全佐劑或不完全佐劑)、BAY、DC-chol、pcpp、單磷醯脂A、CpG、QS-21、霍亂毒素和甲醯甲硫氨醯肽。參見例如Vaccine Design，theSubunit and Adjuvant Approach，1995(M.F.Powell和M.J.Newman編，Plenum出版社，N.Y.)。佐劑優選地為鋁佐劑，如氫氧化鋁或磷酸鋁。
備選的佐劑包括水包油乳劑製劑，例如PCT公開號WO90/14837中所描述的MF59、SAF(包含10％角鯊烷、0.4％Tween 80、5％pluronic封閉的多聚體L121和thr-MDP)和RibiTM佐劑系統(RAS)(RibiImmunochem，Hamilton，MT，包含2％角鯊烷、0.2％Tween 80和選自單磷酸脂質A(MPL)、海藻糖二黴菌酸(TDM)和細胞壁骨架(CWS)的一種或多種細菌細胞壁成分，優選MPL+CWS(DetoxTM))；皂角甙佐劑，例如可以使用StimulonTM(Cambridge Bioscience，Worcester，Mass.)或者產生的顆粒如ISCOM(免疫刺激複合物)；細胞因子，例如白細胞介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、幹擾素(例如γ幹擾素)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)。
在本發明的一個實施方案中，蛋白質-多糖綴合物的平均糖基化比率(多糖與蛋白質的比率)為大約0.05至大約2；更優選的平均糖基化比率為大約0.08至大約1.25；甚至更加優選的平均糖基化比率為大約0.1至大約0.9。在一個優選的實施方案中，蛋白質-多糖綴合物的平均糖基化比率為大約0.2至大約0.8；更優選的平均比率為大約0.2至大約0.6；並且甚至更加優選的平均比率為大約0.3至大約0.5。
如下所述，本發明的疫苗和免疫組合物在多種動物模型中引起類似T-細胞依賴性的免疫反應，而多糖疫苗引起類似非T-細胞依賴性的免疫反應。因此，本發明組合物對於研究在類似T-細胞依賴性的腦膜炎奈瑟氏球菌抗原免疫反應中所涉及的生物學途徑和過程也是一個有用的研究工具。
施用於人或動物的本發明疫苗的量以及施用方案可以按照藥學和獸醫領域一般技術人員眾所周知的標準技術確定，並在確定時考慮到諸如所用具體抗原、佐劑(如果存在)、年齡、性別、體重、物種和特定動物或患者的狀況以及施用路徑等因素。在本發明中，為了在抗腦膜炎奈瑟氏球菌的疫苗接種中提供有效劑量，多糖-蛋白質載體的量可以為每公斤體重大約0.02μg至大約5μg。在本發明優選的組合物和方法中，劑量為每公斤體重大約0.1μg至3μg。例如，如果感染後時間不長，由於細菌增殖時間較短，有效劑量可以需要較少的抗體。同樣，有效劑量依賴於診斷時的細菌負載量。對於治療使用，可考慮在一段時期內多次注射施用。
包含白喉、破傷風、百日咳FHA、百日咳PT或者PRP的抗原的疫苗是本領域技術人員眾所周知的。
本發明的多價綴合物可以以單一劑量或以系列劑量(即進行「一次加強」或「幾次加強」)形式施用。例如，就像目前針對預防兒童疾病的其它疫苗所推薦的那樣，兒童可以在生命早期接受單一劑量，此後在長達10年後接受加強劑量。
加強劑量可使致敏B細胞產生抗體，即回憶應答。也就是說，多價綴合物疫苗與得到許可的多糖疫苗相比，可在年幼群體中引起高的初次(即在疫苗的單次施用後)功能抗體應答，而且還能夠引起回憶應答(即在加強施用後)，這表明由本發明的多價綴合疫苗所引起保護性免疫應答具有長效性。
本發明組合物包括經管口例如口、鼻、肛、陰道、經口、胃內、黏膜(例如經舌、肺泡、牙齦、嗅覺或呼吸黏膜)等等施用的液體製劑，諸如混懸液、糖漿或酏劑；以及經腸胃外、皮下、皮內、肌肉、腹膜內或靜脈施用(例如注射施用)的製劑，諸如無菌混懸劑或乳劑。優選靜脈內和腸胃外施用。此類組合物可以與適當載體、稀釋劑或賦形劑諸如無菌水、生理鹽水、葡萄糖等混合。組合物也可以被凍幹。根據所期望的施用路徑和製劑形式，組合物可以包含諸如溼潤劑或乳化劑、pH緩衝劑、膠凝劑或粘度增強添加劑、防腐劑、調味劑、著色劑等等輔料。可以在不需要過多實驗的前提下參考標準教科書例如REMINGTON』S PHARMACEUTICAL SCIENCE，第17版，1985(文中併入作為參考)來製備適宜的製劑。
在本發明的一個實施方案中，優選的施用路徑是肌肉或皮下，優選肌肉施用路徑。可以通過注射或備選的遞送裝置進行施用。
本發明組合物可以以液體製劑的形式方便的提供，所述液體製劑例如可以被緩衝至選定pH的等滲水溶液、混懸液、乳液或粘性組合物。如果優選消化道吸收，本發明組合物可以為藥丸、片劑、膠囊、膜片等等「固體」形式，包括緩釋或液體填充型「固體」製劑(例如以明膠包裹液體，由此明膠在胃中溶解用於在消化道中實現遞送)。如果希望鼻腔或呼吸道(黏膜)施用，組合物可以是通過壓力噴霧給藥器、泵給藥器或氣霧給藥器施用的形式。氣溶膠通常藉助碳氫化合物在壓力下形成。泵給藥器優選按計量的量施用或者按具有特定微粒大小的劑量施用。
液體製劑通常比凝膠、其它粘性組合物和固體組合物更易製備。另外，液體組合物多少可以更方便的在動物、兒童(尤其是幼兒)和其它可能在吞咽藥丸、片劑、膠囊等等方面有困難的個體上施用，尤其是通過注射或口服方式，在多劑量給藥情況下液體組合物也更方便。另一方面，可以將粘性組合物配製成具有適當範圍內的粘性以便與黏膜(諸如胃或鼻黏膜的內襯)接觸時間更長。
在本發明的優選實施方案中，疫苗組合物可以配製成無菌液體的、無致熱原的、磷酸鹽緩衝的生理鹽水，可以有或沒有防腐劑。在一個優選的實施方案中，一次劑量的配方包含大約0.3至大約1.0mg磷酸鈉、大約3.5至大約6.0mg氯化鈉以及高達1.5mL的水。在一個優選的實施方案中，一次劑量的配方包含大約0.6±0.2mg磷酸鈉、4.4±0.2mg氯化鈉以及高達大約0.5±0.2mL的水。
明顯的，對適當載體和其它添加劑的選擇會取決於確切施用途徑和特定劑型的性質，例如液體劑型(例如不管將組合物配製成溶液、混懸液、凝膠或其它液體形式)或固體劑型(例如不管將組合物配製成藥丸、片劑、膠囊、膜片、緩釋型或液體填充型)。
溶液、混懸液和凝膠除含有活性成分之外通常含有大量的水(優選純化的水)。也可以存在少量的其它成分，例如pH調節劑(例如諸如氫氧化鈉的鹼)、乳化劑或分散劑、緩衝劑、防腐劑、溼潤劑、膠凝劑(例如甲基纖維素)、著色劑和/或調味劑。組合物可以為等滲的，即它可以具有與血液和淚液相同的滲透壓。
所期望的本發明組合物的等滲性可以利用酒石酸鈉、丙二醇或其它無機或有機溶質實現。在一個實施方案中，用磷酸鈉或氯化鈉或其混合物實現組合物的優選等滲性。對於包含鈉離子的緩衝劑而言，特別優選氯化鈉。
組合物的粘度可以使用可藥用增稠劑來維持所選定水平。由於甲基纖維素可以容易地且經濟地獲得，而且容易操作，所以優選甲基纖維素。其它適宜的增稠劑包括例如黃原膠、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、卡波姆等等。增稠劑的優選濃度取決於所選試劑。要點是使用可達到所選粘度的量。粘性組合物通常通過向溶液中添加此類增稠劑製備。
可以採用可藥用防腐劑來延長組合物的保存期。苯甲醇是適宜的，但是還可以使用各種防腐劑包括例如對羥基苯甲酸酯、硫柳汞、氯代丁醇或苯扎氯銨。防腐劑的適宜濃度為總重量的0.02％-2％，但根據所選試劑可以明顯變化。
本領域技術人員將認識到所選則的組合物組分必須為與腦膜炎奈瑟氏球菌多糖-蛋白質載體綴合物不起化學反應的。
本發明將通過參考下列舉例說明性但非限制性實施例進一步描述，所述實施例詳細闡明本發明概念的幾個優選實施方案。本發明的其它實施例在不背離本發明精神的前提下對本領域技術人員而言是顯而易見的。
以下縮寫和商標為ACIP，免疫接種顧問委員會(Advisory Committeeon Immunization Practices)；AE，不良事件；CetavalonTM，十六烷基三甲基溴化銨，CTAB；CFR，聯邦法規；CRF，個案報告表；DTP，白喉-破傷風-百日咳；ELISA，酶聯免疫吸附測定；FDA，美國食品藥品管理局；GCP，藥品臨床試驗管理規範；GMC，幾何平均濃度；GMT，幾何平均滴度；IgG，免疫球蛋白G；IgG1，免疫球蛋白G亞類1；IgG2，免疫球蛋白G亞類2；IgM，免疫球蛋白M；ICH，國際協調會議；IND，研究用新藥；IRB，機構審查委員會；MenA/C-Dt，二價(A和C)腦膜炎球菌多糖-白喉綴合疫苗；MenPS，腦膜炎球菌血清群特異性多糖；mL，毫升；MenomuneTM，許可的腦膜炎球菌A、C、Y和W-135多糖疫苗；OD，光密度；PBS，磷酸緩衝鹽溶液；SAE，嚴重不良事件；SBA，血清殺菌活性；SBA-BR，使用幼兔補體進行的血清殺菌力試驗；SBA-HC，使用人補體進行的血清殺菌力試驗；SIDS，嬰兒猝死症候群；TetraMenD，四價(A、C、Y和W-135)腦膜炎球菌多糖-白喉綴合疫苗；Td，破傷風和白喉疫苗；UAE，意外不良事件；URI，上呼吸道感染；μg，微克。
實施例
實施例1.腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y的純化莢膜多糖粉末的製備
粗糊狀物的製備
分別將腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y的凍存種培養物融化，並在液體Watson Scherp培養基中恢復，而後接種至含有MuellerHinton瓊脂培養基的Blake瓶中。將Blake瓶在CO2存在條件下於35-37℃培養15-19小時。培養後，將生長物從Blake瓶中移出並加至含有WatsonScherp培養基的4L搖瓶中。將搖瓶在水平搖床上於35-37℃培養3-7小時。將4L瓶中的內容物轉移至含有Watson Scherp培養基的發酵容器中。發酵容器在35-37℃培養7-12小時，其間加入補料和消泡劑並控制溶解氧含量和pH。培養後，將發酵容器內容物轉移至500L大罐中，加入CetavlonTM，並且混合1小時。將CetavlonTM處理的生長物以每小時約30-70升的流速以約15,000-17,000×g離心。利用第二次CetavlonTM沉澱將多糖粗品從上清液中沉澱出來。向上清液中加入CetavlonTM並將材料在室溫下混合至少1小時。將材料於1-5℃貯藏8-12小時。以每分鐘300-400ml的流速，約45,000-50,000×g離心收集沉澱的多糖。將收集的糊狀物貯藏於-60℃或更低溫度下直至進一步處理。
純化多糖粉末的製備
將未活化的糊狀物融化並轉移至攪拌器中。將糊狀物於0.9M氯化鈣中攪拌以得到均一懸浮液。懸浮液於大約10,000×g離心15分鐘。將上清液通過容器中的無綿絨墊得到第一次提取物。向糊狀物中加入第二次體積的0.9M氯化鈣，並且攪拌得到均一懸浮液。懸浮液如上所述離心，且將上清液與來自第一次提取的上清液混合。總共進行4次提取，並將上清液混合。混合的提取物通過利用10-30kDa MWCO螺旋形超濾裝置進行超濾濃縮。
向濃縮液中加入氯化鎂，並用氫氧化鈉調節pH值為7.2-7.5。向濃縮物中加入DNA酶和RNA酶，並於25-28℃混合孵育4小時。加乙醇至濃度為30-50％。通過10,000×g離心2小時除去沉澱的核酸和蛋白質。回收上清液並通過加入乙醇至80％且於1-5℃靜置過夜使多糖沉澱。虹吸除去乙醇，並將沉澱的多糖在10,000×g離心5分鐘。用乙醇洗滌沉澱的多糖。用丙酮洗滌多糖，10,000×g離心15-20分鐘。將多糖真空乾燥。
將初始多糖粉末融入乙酸鈉溶液。向其中加入氯化鎂，並用氫氧化鈉溶液調節pH值至7.2-7.5。向溶液中加入DNA酶和RNA酶，並於25-28℃混合孵育4小時以去除殘餘的核酸。在與這些酶孵育後，向多糖-酶混合物中加入等體積的乙酸鈉-酚溶液，並置於1-5℃水平搖床中約30分鐘。將混合物於10,000×g離心15-20分鐘。將上層水相層回收並保存。向水相層中加入等體積乙酸鈉-酚溶液，並按照上述提取。總共進行4次提取以便從多糖溶液中去除蛋白質和內毒素。合併的水相提取物用注射用水稀釋高達10倍，並對10倍體積注射用水透析。向透析後的多糖中加入氯化鈣。通過加入乙醇至80％並於1-5℃過夜沉澱多糖。取出乙醇上清液，並通過10,000×g離心15分鐘收集多糖。純化的多糖用乙醇洗滌兩次，並用丙酮洗滌一次。將洗滌後的粉末在乾燥器中進行真空乾燥。乾粉貯藏於-30℃或更低溫度下直至進行綴合反應。
實施例2.純化的腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y莢膜多糖粉末的解聚
本製備所用材料包括來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y的純化的莢膜多糖粉末(按照實施例1製備)、無菌的50mM乙酸鈉緩衝液(pH6.0)、無菌的1N鹽酸、無菌的1N氫氧化鈉、30％過氧化氫以及無菌生理鹽水(0.85％氯化鈉)。
在分別的反應中對每一血清群多糖進行解聚。向一不鏽鋼罐中裝入多達60克的純化莢膜多糖粉末。向多糖中加入無菌的50mM乙酸鈉緩衝液(pH6.0)至濃度為每升2.5g多糖。在1-5℃下混合多糖溶液12-24小時以實現溶解。將反應罐與熱交換器相連。再額外加入50mM乙酸鈉緩衝液(pH6.0)以稀釋多糖至每升1.25g的反應濃度。將多糖溶液加熱至55±0.1℃。向反應混合物中加入30％過氧化氫至其反應濃度為1％。
通過隨反應時間跟蹤多糖分子大小的變化來監控反應進程。每隔15-20分鐘，取出一份反應混合物試樣並注射至高效凝膠排阻色譜(HPSEC)柱以測量多糖的分子大小。當多糖的分子大小達到目標分子大小時，關閉加熱器並通過冰水浴循環將多糖溶液迅速冷卻至5℃。通過將反應罐連接至裝備有3000MWCO再生纖維素柱的超濾器上，將解聚多糖溶液濃縮至每升15g。將濃縮後的解聚多糖溶液用10倍體積無菌生理鹽水(0.85％氯化鈉)透析。將解聚多糖貯存於1-5℃直至下一步驟。
通過流經商品名為「Ultahydrogel.TM.250」的凝膠過濾層析柱以及利用多角度雷射光散射確定解聚多糖的分子大小，所述凝膠過濾層析柱用葡聚糖分子標準來校準。對於血清群A，使用Bartlet G.R.J的方法((1959)，Journal of Biophygical Chemistry，234，466-468頁)通過磷的含量測定多糖的量，並且對於血清群C、W135和Y，使用Svennerholm L.的方法((1955)，Biochimica Biophysica Acta，24，604-611頁)通過唾液酸的含量測定多糖的量。通過Hesterin S.((1949)，Journalof Biological Chemistry，180，249頁)的方法測定O-乙醯基含量。通過Park J.T.和JohnsonM.J.((1949)，Journal of Biological Chemistry，181，149-151頁)的方法測定還原活性。解聚多糖的結構完整性通過質子1H和13C NMR確定。解聚多糖的純度通過測量LAL(內毒素)含量和殘餘過氧化氫含量來確定。
實施例3.腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y解聚多糖的衍生化
本製備所用材料包括過氧化氫解聚的腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y莢膜多糖(按照實施例2製備)、己二酸二醯肼、僅用於血清群A的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDAC)、氰基硼氫鈉、無菌的1N鹽酸、無菌的1N氫氧化鈉、無菌的1M氯化鈉以及無菌生理鹽水(0.85％氯化鈉)。
在分開的反應中將每一血清群多糖進行衍生反應。向一不鏽鋼罐中裝入純化的解聚多糖，並用無菌0.85％生理鹽水的稀釋至終反應濃度為每升1g多糖。向該溶液中加入溶於無菌0.85％生理鹽水的己二酸二醯肼濃的等分試樣至其反應濃度為每升1g。對於血清群A，將EDAC作為溶於無菌0.85％生理鹽水的濃的等分試樣加入，以達到每升1g的反應濃度。調節pH值至5.0±0.1，並利用無菌的1N鹽酸和無菌的1N氫氧化鈉在室溫下(15-30℃)維持此pH值達2小時。2小時後，向此反應混合物中加入溶於無菌0.85％生理鹽水的氰基硼氫鈉濃的等分試樣至每升2g的反應濃度。在室溫下(15-30℃)攪動反應物44±4小時，同時維持pH值5.5±0.5。此反應期後，將pH值調至6.0±0.1，並且通過將反應罐連接至裝備有3000MWCO再生纖維素柱的超濾器上將衍生的多糖濃縮至每升12g多糖。用30倍體積的1M氯化鈉透析濃縮後衍生多糖，接著用10倍體積的0.15M氯化鈉透析。將反應罐與超濾器分離，並在1-5℃貯藏7天。將反應罐與裝備有3000MWCO再生纖維素柱的超濾器重新連接，並用30倍體積的1M氯化鈉透析，接著用10倍體積的0.15M氯化鈉透析。
通過與在解聚多糖中所用的相同方法對衍生多糖的分子大小、多糖的量以及O-乙醯基含量進行測定。通過Snyder S.L.和Sobocinski P.Z.((1975)，Analytical Biochemistry，64，282-288頁)的2，4，6-三硝基苯磺酸方法測定醯肼含量。衍生多糖的結構完整性通過質子1H和13C NMR確定。衍生多糖的純度通過測量未結合的醯肼水平、LAL(內毒素)含量和殘餘氰基硼氫化物含量來確定。
實施例4.載體蛋白質的製備
粗白喉類毒素蛋白質的製備
將凍幹的種子培養物進行重構並培養16-18小時。取一等分試樣培養物轉移至含有生長培養基的0.5升搖瓶中，並將培養瓶在旋轉搖床上於34.5-36.5℃培養7-9小時。從培養瓶取一等分試樣培養物轉移至含有生長培養基的4升搖瓶中，並將培養瓶在旋轉搖床上於34.5-36.5℃培養14-22小時。將來自4升搖瓶中的培養物接種於含有生長培養基的發酵罐。將發酵罐在34.5-36.5℃孵育70-144小時。發酵罐內容物通過深層濾器過濾至收集器中。向收穫物中加入37％的甲醛溶液至其濃度為0.2％。將pH調整至7.4-7.6。將收穫物通過0.2微米濾器過濾至無菌的20升的瓶中。將瓶子於34.5-36.5℃培養7天。向每一20升瓶中加入37％的甲醛溶液至其濃度為0.4％。調節混合物pH值至7.4-7.6。將瓶在搖床上於34.5-36.5℃培養7天。向每一20升瓶中加入37％的甲醛溶液至其濃度為0.5％。調節混合物pH值至7.4-7.6。將瓶於34.5-36.5℃培養8周。對類毒素粗品進行脫毒測試。在測試期間將瓶貯藏於1-5℃。
粗白喉類毒素蛋白質的純化
將類毒素粗品升溫至室溫，並將20升瓶中的內容物合併裝入純化罐。調節類毒素pH值至7.2-7.4，並向類毒素粗品中加入活性炭並混合2分鐘。將活性炭類毒素混合物靜置1小時，然後用深層濾器過濾至第二個純化罐中。向濾液中加入固體硫酸銨至70％飽和度。調節pH值至6.8-7.2，並將溶液靜置16小時。過濾收集沉澱的蛋白質，並用70％飽和度硫酸銨溶液(pH7.0)洗滌。將沉澱溶於無菌蒸餾水，並將蛋白質溶液過濾至不鏽鋼收集器中。調節pH值至6.8-7.2，並加入硫酸銨至40％飽和度。調節溶液pH值至7.0-7.2，並將溶液靜置16小時。通過過濾去除並丟棄沉澱。向濾液中加入硫酸銨至60％飽和度，並調節pH值至7.0-7.2。將混合物靜置16小時，並通過過濾收集沉澱的蛋白質。將沉澱溶於無菌蒸餾水，過濾去除不溶的蛋白質，並用0.85％生理鹽水透析。
純化白喉類毒素蛋白質的濃縮和無菌過濾
利用10,000MWCO再生纖維素濾柱，將蛋白質溶液濃縮至每升15g並用10倍體積的0.85％生理鹽水透析。濃縮的蛋白質溶液通過0.2微米濾膜過濾。將蛋白質溶液貯藏於1-5℃貯存直至進行綴合。
蛋白質濃度通過Lowry，O.H.等的方法((1951)，Journal of BiologicalChemistry，193，265-275頁)測定。蛋白質純度通過測定無菌度、LAL(內毒素)含量和殘餘甲醛含量確定。
實施例5.腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y多糖與白喉類毒素蛋白質的單價綴合物的製備
本製備所用材料包括腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y的己二酸衍生多糖(按照實施例3製備)、無菌白喉類毒素蛋白質(按照實施例4製備)、EDAC、硫酸銨、無菌的1N鹽酸、無菌的1N氫氧化鈉以及無菌生理鹽水(0.85％)。
在分別的反應中製備每一血清群多糖綴合物。所有的四種綴合物均通過下列方法製備。向一不鏽鋼罐中裝入純化的己二酸衍生多糖(反應濃度為700-1000μM活性醯肼)以及純化的白喉類毒素蛋白質(反應濃度為3.8-4.0g/L蛋白質)。利用0.85％生理鹽水稀釋這些原料至目標反應濃度並調節pH值至5.0±0.1。將等分試樣的EDAC加入到多糖蛋白質混合物中至2.28-2.4g/L的濃度。在15-30℃下將反應pH維持在5.0±0.1達2小時。2小時後，用無菌的1N氫氧化鈉調節pH值至7.0±0.1，並將反應物在1-5℃貯藏16-20小時。
將反應混合物升溫至15-30℃，並將反應罐連接至裝備有30,000MWCO再生纖維素柱的超濾器上。加入固體硫酸銨至60％飽和度(對於血清群A、W-135和Y)和50％飽和度(對於血清群C)。將綴合反應混合物用20倍體積的60％飽和硫酸銨溶液(對於血清群A、W-135和Y)和50％飽和硫酸銨溶液(對於血清群C)透析，接著用20倍體積的0.85％生理鹽水透析。透析後的綴合物先通過含有1.2微米和0.45微米濾心的過濾膠囊，然後再通過含有0.22微米濾心的過濾膠囊。
通過與解聚和衍生多糖中所用相同的方法測定多糖的量和O-乙醯基含量。蛋白質的量通過Lowry方法確定。綴合物的分子大小通過商品名為「TSK6000PW」的凝膠過濾層析柱來確定，其使用DNA作為空體積標記物、使用ATP作為總體積標記物以及使用牛甲狀腺球蛋白作為參考標記物。此外，通過多角度雷射光散射確定從TSK6000PW柱上洗脫的綴合物的分子大小。通過使用雙夾心ELISA方法測定與抗多糖血清群特異性抗體的結合來測定綴合物的抗原特性。綴合物純度通過測定未結合(未綴合)多糖的量(通過在疏水相互作用層析柱上洗脫)、未綴合蛋白質的量(利用毛細管電泳)、無菌度、LAL(內毒素)含量、殘餘EDAC含量以及殘餘銨離子含量來確定。
實施例6.多價腦膜炎球菌A、C、W-135和Y多糖白喉類毒素綴合疫苗的配製
本製備所用材料包括按照實施例5製備的血清群A、C、W-135和Y多糖-白喉類毒素綴合物、無菌的100mM磷酸鈉緩衝的生理鹽水(0.85％氯化鈉)。
向不鏽鋼積聚罐內的生理鹽水(0.85％)中加入等分試樣的無菌的100-500mM磷酸鈉緩衝生理鹽水使得到的最終疫苗濃度為10mM磷酸鈉。向含有10mM無菌磷酸鈉生理鹽水的積聚罐中加入2-4種無菌單價腦膜炎球菌多糖-白喉類毒素綴合物中的每一種，達到每毫升緩衝液中每一血清群多糖各8μg的終濃度。將配製的四價綴合物混合併通過0.2μm濾器過濾至第二個積聚罐中。
多價疫苗製劑中每一種血清群多糖的量可以通過糖成分分析測定，其中糖成分分析可以使用具有脈衝安培檢測的高pH陰離子交換層析來測定。蛋白質的量通過Lowry方法測定。使用與pH計連接的複合電極測定疫苗的pH值。通過使用雙夾心ELISA方法測定與抗多糖血清群特異性抗體的結合來測定多價綴合物的抗原特性。通過疫苗中每一綴合物在動物模型中引起初次和加強抗多糖IgG免疫應答的能力來確定多價綴合疫苗的免疫原性。多價綴合疫苗的純度通過測定未結合(未綴合)多糖的量(使用具有脈衝安培檢測的高pH陰離子交換層析)，無菌度、LAL(內毒素)含量、致熱原含量和一般安全性來測定。
實施例7.氫氧化鋁佐劑輔助的多價腦膜炎球菌多糖白喉類毒素蛋白質綴合物的製備
製備吸附至氫氧化鋁的綴合物。本製備所用材料包括按照實施例5製備的血清群A、C、W-135和Y多糖白喉類毒素綴合物、無菌生理鹽水(0.85％氯化鈉)以及溶於生理鹽水(0.85％氯化鈉)的無菌氫氧化鋁。
向含有生理鹽水的積聚罐中加入每一種的無菌單價腦膜炎球菌多糖白喉類毒素綴合物的等分試樣，達到每毫升緩衝液中每一血清群多糖為8μg的終濃度。向多價綴合疫苗中加入溶於生理鹽水(0.85％氯化鈉)的無菌氫氧化鋁，以達到終濃度為每毫升疫苗0.44mg鋁離子。
實施例8.磷酸鋁佐劑輔助的綴合物的製備
本製備所用材料包括按照實施例5製備的血清群A、C、W-135和Y多糖白喉類毒素綴合物、無菌生理鹽水(0.85％氯化鈉)以及溶於生理鹽水(0.85％氯化鈉)的無菌磷酸鋁。
向含有生理鹽水的積聚罐中加入每一種的無菌單價腦膜炎球菌多糖-白喉類毒素綴合物的等分試樣，達到每毫升緩衝液中每一血清群多糖為8μg的終濃度。向多價綴合物疫苗中加入溶於生理鹽水(0.85％氯化鈉)的無菌磷酸鋁，以達到終濃度為每毫升疫苗0.44mg鋁離子。
實施例9.在人類臨床研究中使用的材料和方法的一般描述
四價衍生綴合疫苗的免疫原性
在多種不同的臨床方案下研究了綴合疫苗誘發人類免疫應答的能力。以下研究總結了這些結果。除非另外指出，以下每種研究中所使用的材料和方法如下
TetraMenD
TetraMenD疫苗包含四種血清群腦膜炎球菌莢膜多糖A、C、Y和W-135，每種多糖4μg，共價綴合於總量為48μg的白喉類毒素蛋白質上。疫苗用無菌的、無熱原的磷酸鹽緩衝生理鹽水配製，但不含防腐劑。配方包含0.6mg磷酸鈉、4.4mg氯化鈉以及高達0.5mL的水。
Menomune
Menomune在美國和其它國家被許可用於2歲及2歲以上的人群。Menomune為凍幹製劑，疫苗的一次劑量包含作為抗原的A、C、Y和W-135多糖各50μg，用硫柳汞保存的等滲氯化鈉溶液的稀釋液重新溶解，每次皮下給藥劑量為0.5mL。每0.5mL劑量的疫苗包括2.5-5mg作為穩定劑的乳糖。對於皮下施用，作為血清群A、C、Y和W-135組合的Menomune-A/C/Y/W-135腦膜炎球菌多糖疫苗是一種血清群特異多糖抗原的凍幹製劑，這些抗原分別來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、Y和W-135。稀釋劑是無菌的、無熱原的蒸餾水。按照標記的指示用稀釋劑重新溶解凍幹製劑，每0.5mL劑量的配方包含溶於等滲氯化鈉溶液中的血清群A、C、Y和W-135的「分離產品」各50μg。
成人用吸著破傷風白喉混合類毒素(Tetanus and Diphtheria ToxoidsAdsorbed for Adult Use)(以下稱作Td)是一種溶於等滲氯化鈉溶液中的明礬沉澱類毒素的無菌混懸劑，其中含有磷酸鈉緩衝液以控制pH值。此疫苗用於肌肉注射。通過分析，每一0.5mL的劑量配製成包含5Lf的破傷風類毒素、2Lf的白喉類毒素和不超過0.28mg的鋁。在豚鼠效價測試中，破傷風和白喉類毒素可以分別誘導產生至少2和0.5單位/毫升的抗毒素。在第一次隨訪時，所有受試者均接受0.5mL Td的單一劑量，施用時使用25英寸的計量注射針在左臂三角肌注射。每0.5mL劑量包含5Lf的破傷風類毒素和2Lf的白喉類毒素。
血清樣品
於基線期之後指定的天數抽取血液樣品。例如，如果方案指定3個時間點(0天、28天和6個月)，那麼應該在疫苗接種之前的0天(基線期)、疫苗接種後28天(為了評價初次免疫應答)和疫苗接種後6個月(為了評價免疫應答的延續時間)抽取血液樣品。在每個時間點從每位受試者收集大約5mL全血。在採集後4小時之內離心全血。吸出血清並貯存於-20℃。「28天」血液樣品取自0天注射後至少28天但尚未到57天時。「6個月」血液樣品取自0天注射後6個月加或減28天時。所以，28天血清代表取自0天後28-56天的血清，6個月血清代表取自0天後149-217天的血清。
測定技術
本研究使用了多種標準化免疫學測定法。以下描述總結了文中所用的方法。但是，其它相似的測定法(包括文中提到的測定法的修改方法)是本領域技術人員眾所周知的且可以被使用。
通過使用幼兔補體的殺菌力試驗方法(SBA-BR)檢測抗腦膜炎球菌抗體
使用血清殺菌力試驗方法測定抗血清群A、C、Y和W-135腦膜炎球菌抗體的功能性抗體活性。在無菌96孔微量滴定板中準備測試血清的倍比稀釋液。將血清群特異性腦膜炎球菌和幼兔補體加入到血清稀釋液中並孵育。在該孵育階段之後，向血清/補體/細菌混合物中加入瓊脂覆層培養基，使之凝固，然後在37℃、5％CO2環境中孵育過夜。計數孔中存在的細菌菌落。通過與補體對照孔的平均值相比達到＞50％殺死的倒數型血清稀釋度確定終點滴度。對於使用兔補體的該測定法，檢出限為滴度8。
IgG抗腦膜炎球菌抗體的測定
使用間接ELISA測定抗血清群A、C、Y和W-135腦膜炎球菌抗體的IgG抗體活性。操作方法中涉及到與通過甲基化人血清白蛋白吸附到塑料微量滴定孔中的過量腦膜炎球菌血清群特異多糖(MenPs)抗原發生反應的血清抗體。通過與過氧化物酶標記的小鼠抗人IgG特異單克隆抗體的反應來測定所結合抗體的量。然後使用過氧化物酶底物產生顯色產物，並用分光光度計法測定該產物。所得到的光密度(OD)與結合到微量滴定板中腦膜炎球菌多糖的血清中IgG抗體的量相關聯。然後通過使用4參數邏輯曲線法與指定值的參考標準品(Lot CDC 1992或等效物)相比較來計算IgG抗體的量。
IgM抗腦膜炎球菌抗體的測定
使用間接ELISA測定抗血清群A、C、Y和W-135腦膜炎球菌抗體的IgM抗體活性。操作方法中涉及到與通過甲基化人血清白蛋白吸附到塑料微量滴定孔中的過量MenPs抗原發生反應的血清抗體。通過與過氧化物酶標記的小鼠抗人IgM特異單克隆抗體的反應來測定所結合抗體的量。然後使用過氧化物酶底物產生顯色產物，並用分光光度計法測定該產物。所得到的光密度(OD)與結合到微量滴定板中腦膜炎球菌多糖的血清中IgM抗體的量相關聯。然後通過使用4參數邏輯曲線法與指定值的參考標準品(LotCDC 1992或等效物)相比較來計算IgM抗體的量。
高親和力抗腦膜炎球菌IgG抗體的測定
在Aventis Pasteur Inc.公司使用改良的ELISA法測定抗血清群A、C、Y和W-135腦膜炎球菌抗體的高親和力IgG抗體活性。目前，該測定法處於Aventis Pasteur Inc.公司的研發中，並且將在臨床樣品測試之前取得資格。簡言之，就是用MenPs抗原包被96孔微量滴定板。吸出並洗滌所包被的微量滴定板後，在板中直接製備臨床血清的系列稀釋液並孵育過夜，稀釋時使用包含75mM硫氰酸銨的磷酸緩衝鹽(PBS)血清稀釋緩衝液。通過與過氧化物酶標記的小鼠抗人IgG特異單克隆抗體的反應來測定結合抗體的量。然後使用過氧化物酶底物產生顯色產物，並用分光光度計法測定該產物。所得到的光密度(OD)與結合到微量滴定板內腦膜炎球菌多糖的血清中高親和力IgG抗體的量相關聯。然後通過使用4參數邏輯曲線與參考標準品(Lot CDC 1992或等效物)相比較來計算高親和力IgG抗體的量。
腦膜炎球菌抗體IgG1和IgG2亞類的測定
使用ELISA測定抗血清群A、C、Y和W-135腦膜炎球菌抗體的IgG1和IgG2亞類的抗體分布。血清系列稀釋液中的抗體與吸附在微量滴定板孔中的MenPs抗原反應。使用抗人IgG1Fc特異或IgG2Fc特異的試劑測定所結合抗體的量。然後使用過氧化物酶底物產生顯色產物，並用分光光度計法測定該產物。所得到的光密度(OD)與結合到微量滴定板內腦膜炎球菌多糖的血清中IgG1和IgG2抗體的量相關聯。抗體的量表示為血清樣品中IgG1∶IgG2的比率，如果可以得到適宜的參考標準品則也可以表示為IgG1或IgG2的濃度。
通過對VERO細胞代謝的抑制測定抗白喉抗體
通過測試血清保護VERO細胞免受白喉毒素攻擊的能力，檢測抗白喉抗體的反應。使用無菌的96孔微量滴定板，將測試血清的倍比稀釋液(以1∶4稀釋度開始)用白喉毒素激發並孵育。然後加入VERO細胞，用無菌的礦物油將微量滴定板孔封口並孵育6-8天。然後通過觀察培養基中pH指示劑的顏色改變來確定抗體水平，這種顏色的變化源自細胞代謝的副產物。通過與校準的WHO參考血清對比，將結果表示為國際單位/毫升，並且通過在白喉毒素激發劑量(challenge dose)存在下允許細胞代謝的最高血清稀釋度來確定。檢測低限可以通過參考血清的最低的可檢測抗毒素水平以及測試血清的起始稀釋度來確定，一般為0.005IU/mL。
通過ELISA法測定抗破傷風抗體
使用間接酶聯免疫吸附測定(ELISA)測定抗破傷風抗體水平。操作方法中涉及到與吸附到塑料微量滴定孔中破傷風類毒素發生反應的測試血清抗體。通過與鹼性磷酸酶偶聯的山羊抗人IgG特異抗體的反應來測定所結合抗體的量。然後使用鹼性磷酸酶底物產生顯色產物，並用分光光度計法測定該產物。所得到的OD值(光密度)與結合到微量滴定板內所包被抗原的血清稀釋液中的抗體的量相關聯。然後通過使用平行線分析法與指定單位量的國際參考品(WHO Lot TE-3)相比較，計算出抗體濃度。結果表示為國際單位/毫升(IU/mL)。ELISA法檢測抗破傷風IgG的最低水平為0.01IU/mL，將低於此水平的樣品的值表示為＜0.01IU/mL。
如文中所使用，「不良事件」、「嚴重不良事件」和「意外不良事件」均為疫苗行業所熟知的術語。依據標準的臨床實踐總結並分析了安全性資料，包括評價接種疫苗的所有受試者的臨床研究持續時間。一般來說，每個術語均理解為具有以下含義。
不良事件(AE)定義為「在施用藥物的病人或臨床研究受試者中出現的任何不幸醫療事件，並且其不一定與此處理存在因果關係。因此，不良事件可以是與醫藥(研究)產品的使用暫時相關的任何不利的和非故意的病徵(包括異常實驗室發現)、症狀或疾病，而不管其是否與醫藥(研究)產品相關。」(ICH指導，GCP(E6)§1.2)。
嚴重不良事件(SAE)是「在任何劑量出現的導致任何下列後果的任何不良藥物事件死亡、威脅生命的不良藥物事件、病人住院或住院期延長、持久或明顯殘疾/無自理能力或先天性異常/出生缺陷。當根據適當醫療鑑定，即它們危害到病人或受試者並且需要通過藥物或外科介入避免發生本定義所列後果之一，則那些沒有導致死亡、威脅生命或需要住院的重大醫療事故可以考慮為嚴重不良藥物事件。此醫療事件的實例包括需要在急診室或家中進行精心治療的過敏性支氣管痙攣、未導致病人住院的血液病或驚厥或者藥物依賴或藥物濫用的發展。」(21CFR第I章，§312.32(a))。
意外不良事件(UAE)是「任何不良的藥物事件，其特異性或嚴重性與目前研究者指南中的不一致；或者如所修正，如果不需要或者得不到研究者指南，則其特異性或嚴重性與總體研究計劃中或當前應用的其它地方描述的危險性資料不一致。」(21CFR第I章，§312.32(a))。
本研究依據標準臨床實踐開展，並且研究中病人入選或排除的標準如下
病人的入選標準
1.如通過既往醫療史和體格檢查所確定，受試者為健康的。
2.在接種疫苗時受試者至少11歲而未到19歲。
3.受試者的父母/監護人或受試者已經籤署了機構審查委員會(IRB)認可的適用於本試驗的知情同意書。
4.受試者已經籤署了機構審查委員會(IRB)認可的適用於本試驗的同意書。
病人的排除標準
1.患有嚴重慢性病(如心臟病、腎病、神經病、代謝疾病、風溼病等)。
2.已知或懷疑免疫功能損傷。
3.在檢查之前的72小時內患有伴隨或不伴隨發熱的急性內科疾病或者在檢查時口腔溫度≥38℃(100.4°F)。
4.具有確實的侵入性腦膜炎球菌疾病史或先前進行腦膜炎球菌疫苗接種。
5.在近3個月內施用過免疫球蛋白和其它血液製品，或者在疫苗研究的6周內口服或注射過皮質類固醇或進行過其它免疫調節治療。按照口服類固醇持續時間＜7天的遞減劑量方案進行的個體可以登記參加試驗，只要他們在登記前2周內沒有接受1個療程以上的治療即可。
6.在疫苗接種前72小時內接受過抗生素治療。
7.在登記前28天內接種過任何疫苗，或者在登記後28天內計劃接種除本研究指出的附加疫苗之外的任何疫苗。
8.懷疑或已知對任何疫苗成分過敏。
9.無法參與整個研究階段或者不能參加預定隨訪或不遵守研究規程。
10.登記參加另一個臨床試驗。
11.在研究者看來，對受試者具有健康危險或者幹擾疫苗評價的任何情況。
12.在接種疫苗時尿妊娠試驗陽性或可疑陽性的女性。
實施例10.研究A-劑量研究
研究A是向3個年齡組的受試者施用三個劑量水平TetraMenD疫苗的非盲、開放標記、劑量遞增試驗。90個健康成人(18-55歲)參加I期試驗，並接受TetraMenD疫苗單次注射。30個健康兒童(12-22個月)參加II期試驗並接受TetraMenD疫苗的單一劑量水平注射兩次。90個健康嬰兒(6-12周)參加III期試驗並接受TetraMenD疫苗的單一劑量水平注射三次。
I期在18-55歲成人中的劑量研究
此臨床試驗是向3個年齡組的受試者施用三個劑量水平TetraMenD疫苗的非盲、開放標記、劑量遞增試驗。在I期中，90個健康成人(18-55歲)接受了TetraMenD疫苗的單次注射。
對於成人受試者，在TetraMenD施用前的基線期(0天)和TetraMenD施用後的28天抽取血清樣品用於血清學分析。分析所有可得到樣品的抗腦膜炎球菌血清群A、C、Y和W-135莢膜多糖的SBA，並且通過ELISA法分析抗這些相同血清群的IgG抗體。對於所有血清群的SBA和IgGELISA結果總結如下。
一個關鍵的免疫原性判定終點是比基線值升高≥4倍的受試者的比例。為了確定基線值SBA滴度對SBA升高≥4的比例產生什麼影響，在成人中開展了亞組分析，其中將成人分成受試者基線值滴度小於1∶64的組和受試者基線值滴度至少1∶64的組。TetraMenD的安全性與Menomune是可比的，研究結果總結於下表。
表A-1I期(成人)-按照TetraMenD劑量水平的基線期(0天)SBA滴度分布
(續表A-1)
表A-2I期(成人)-按照TetraMenD劑量水平的注射後28天
的SBA滴度分布(符合方案數據分析)
(續表A-2)
表A-3I期(成人)-按照TetraMenD劑量水平的基線期和注射後
28天達到SBA閾值的比例(符合方案數據分析)
N在每一時間點(0天；28天)可評價受試者的數量
表A-4I期(成人)-按照TetraMenD劑量水平的基線期和注射後
28天的SBA和IgG ELISA結果(符合方案數據分析)
(續表A-4)
0天在接種疫苗前抽取的基線期血液樣品。
28天在接種疫苗後28天抽取的血液樣品。
上升≥4倍的％與0天相比接種疫苗後28天GMT值上升≥4倍的成人的百分比。
N可評價受試者的數量。
*對於SBA數據計算GMT；對於IgG ELISA數據計算GMC。
表A-5顯示了按照劑量、病人年齡和血清群的GMT值。
表A-5按照劑量、病人年齡和血清群的GMT
(續表A-5)
(續表A-5)
II期在12個月至22個月的幼兒中的劑量研究
此臨床試驗是向3個年齡組的受試者施用三個劑量水平TetraMenD疫苗的非盲、開放標記、劑量遞增試驗。在2期中，30個健康兒童(12-22個月)接受了兩次TetraMenD疫苗的單一劑量。
對於幼兒受試者，在三個時間點抽取血清樣品用於血清學分析第一次注射TetraMenD疫苗之前的基線期(0天)、登記後60天(第一次注射之後的60天並且在馬上進行第二次注射TetraMenD疫苗的之前)和登記後90天(第二次注射之後30天)。分析所有可得樣品的抗腦膜炎球菌血清群A、C、Y和W-135莢膜多糖的SBA，並且通過ELISA法分析抗這些相同血清群的IgG抗體。對於所有血清群的SBA和IgG ELISA結果總結如下。結果總結於下表。
表A-6II期(幼兒)-按照TetraMenD劑量水平的基線期(0天)
SBA滴度分布(符合方案數據分析)
(續表A-6)
表A-7II期(幼兒)-按照TetraMenD劑量水平的第一次注射後60天
(60天)的SBA滴度分布(符合方案數據分析)
(續表A-7)
表A-8II期(幼兒)-按照TetraMenD劑量水平的第二次注射後30天
(90天)SBA滴度分布(符合方案數據分析)
(續表A-8)
表A-9II期(幼兒)-按照TetraMend劑量水平的基線期、第一次注射後60天和第二次注射後30天達到SBA閾值的比例(符合方案數據分析)
(續表A-9)
表A-10II期(幼兒)-按照TetraMenD劑量水平的幼兒的基線期、第一次注射後
60天和第二次注射後30天的SBA和IgG ELISA結果(符合方案數據分析)
(續表A-10)
(續表A-10)
0天在第1次注射前抽取的基線期血液樣品。
60天在第1次注射後60天和第2次注射前抽取的血液樣品。
90天在第2次注射後30天抽取的血液樣品。
上升≥4倍的％第1次注射後與0天相比在60天GMT值上升≥4倍的幼兒的百分比；第2次注射後與0天相比在90天GMT值上升≥4倍的幼兒的百分比。
N可評價受試者的數量。
*對於SBA數據計算GMT；對於IgG ELISA數據計算GMC。
表A-11總結了按照劑量、病人年齡和血清群的GMT。
表A-11按照劑量、病人年齡和血清群的GMT的總結
III期在嬰兒中的劑量研究
此臨床試驗是向3個年齡組的受試者施用三個劑量水平TetraMenD疫苗的非盲、開放標記、劑量遞增試驗。在III期中，90個健康嬰兒(6-12周)接受了三次TetraMenD疫苗的單劑量。
嬰兒受試者分別在2個月(第1次注射)、4個月(第2次注射)和6個月大(第3次注射)時接種TetraMenD疫苗。在兩個時間點抽取血清樣品用於血清學分析6個月(第2次注射TetraMenD疫苗後2個月)和7個月(第3次注射後1個月)。分析所有可得樣品的抗腦膜炎球菌血清群A、C、Y和W-135莢膜多糖的SBA，並且通過ELISA法分析抗這些相同血清群的IgG抗體。對於所有血清群的SBA和IgG ELISA結果總結如下。結果總結於下表。
表A-13III期(嬰兒)-按照TetraMenD劑量水平的7個月(第3次注射
後1個月)時SBA滴度分布(符合方案數據分析)
(續表A-13)
表A-14III期(嬰兒)-按照TetraMenD劑量水平的6個月(第3次注射前)
和7個月(第3次注射後)時達到SBA閾值的比例(符合方案數據分析)
N在每一時間點(6個月；7個月)可評價受試者的數量。
表A-15III期(嬰兒)-按照TetraMenD劑量水平的6個月
(第3次注射前)和7個月(第3次注射後)的嬰兒的SBA
和IgG ELISA結果(符合方案數據分析)
(續表A-15)
N可評價受試者的數量。
*對於SBA數據計算GMT；對於IgG ELISA數據計算GMC。
表A-16顯示了按照病人年齡和血清群的GMT總結。
表A-16按照病人年齡和血清群的GMT總結
在嬰兒內接種TetraMenD的同時施用兒科疫苗
目前，按照當前ACIP建議和當地實踐對嬰兒接種常規兒科疫苗。在本研究中，嬰兒同時接種TetraMenD和兒科疫苗。在嬰兒2、4和6個月時施用DTacP(Tripedia)和Hib(ActHIB)。可以接種脊髓灰質炎病毒滅活疫苗(IPV)或口服脊髓灰質炎病毒活疫苗(OPV)；在第一次和第二次注射TetraMenD時(在2個月和4個月時)施用IPV。按照當地實踐接種B型肝炎疫苗；B型肝炎疫苗的施用在一些2個月的受試者中進行，但在4個月或6個月的受試者中不施用。在開展嬰兒階段的該試驗過程中，RotaShield得到許可並且收到了常規使用的ACIP建議。在本試驗中唯一一個受試者在4個月和6個月時接種了RotaShield。
在6個月和7個月時評價了對常規施用的嬰兒疫苗抗原的抗體反應。結果總結於各表中。
試驗中的嬰兒受試者在2、4和6個月時接種DTacP和PRP疫苗；在第3次注射這些疫苗後一個月抽取7-月血液。對於這些疫苗抗原(白喉、破傷風、百日咳FHA、百日咳PT和PRP)的每一種，所觀察到的抗體水平表明在接種TetraMenD的3個劑量組中沒有統計學顯著差異(所有的P值＞0.05)。(見表A-17)
在本試驗中，在嬰兒2個月和4個月時接種IPV。在第2次注射IPV後3個月抽取7-月血液。對於1型和2型脊髓灰質炎，所觀察到的GMT、NA≥1∶4的比例和NA≥1∶8的比例表明在接種TetraMenD的3個劑量組中沒有統計學顯著差異(所有的P值＞0.05)。根據NA≥1∶8的比例可見，在所有接種TetraMenD的3個劑量組中至少95.0％以上表現為抗1型和2型脊髓灰質炎的保護作用。對於3型脊髓灰質炎，1μg、4μg和10μg組的GMT分別為562.7、164.0和113.3。3型脊髓灰質炎各組間的GMT值存在明顯的統計學差異(P＝0.001，ANOVA)。但是，通過NA≥1∶8的比例(分別為100.0％[22/22]、100.0％[21/21]和94.1％[16/17])可見所有接種TetraMenD的3個劑量組中全部表現為抗3型脊髓灰質炎的保護作用。這些比例沒有統計學差異(p＝0.283，Fisher精確性檢驗)。而且，這三種血清型脊髓灰質炎的GMT值均正好位於所公布的在2個月和4個月時兩次接種IPV之後的GMT值範圍之內，並且本試驗也採用了該IPV疫苗接種方案。
在最近一次接種B型肝炎疫苗後的最少5個月時抽取7-月血液。通過GMT和≥10mIU/mL的比例所觀察到的B型肝炎病毒表面抗體水平在接種TetraMenD的3個劑量組中不存在統計學顯著差異(兩個p值均≥0.649)。值得注意的是，本試驗中沒有嬰兒在6個月隨訪時接種B型肝炎疫苗，此時是第3次接種本疫苗的最早推薦時期。這可以解釋為什麼在7個月嬰兒中B型肝炎表面抗體滴度≥10mIU/mL的比例與所公布的疫苗初始劑量之後產生可檢測抗體的嬰兒比例範圍一致，而低於所預計的在全部三次接種後產生保護性抗體水平的嬰兒比例。本研究結果總結於下表。
表A-17III期(嬰兒)-按照TetraMenD劑量水平的7個月的嬰兒中
伴隨疫苗的免疫原性(符合方案數據分析)
(續表A-17)
*GMT的比較使用F-檢驗。百分比的比較使用Fisher精確性檢驗。
+p值＜0.05
實施例11.研究B-在2-10歲的兒童中的1個月和6個月研究
本研究是對2-10歲的健康兒童進行的隨機、陽性對照(active-control)的研究，其中比較了單一劑量的TetraMenD和單一劑量的Menomune。分別在接種前的0天、接種後28天和6個月抽取血液樣品。TetraMenD的總體安全性與Menomune是可比的。本研究結果總結於下表。
SBA-BR抗體滴度分布
表B-1顯示了對於每一血清群的基線期、28天和6個月時SBA-BR抗體滴度分布的頻率。
表B-1疫苗接種後0天、28天和6個月時SBA-BR
抗體滴度的分布(符合方案數據分析)
(續表B-1)
(續表B-1)
(續表B-1)
(續表B-1)
表B-2總結了按照受試者年齡和TetraMenD血清群的滴度幾何均數(GMT)。
表B-2按照受試者年齡和TetraMenD血清群的GMT總結
表B-3顯示了對於血清群A、C、Y和W-135從基線期到28天SBA-BR滴度升高≥4倍的受試者數量和比例。對於每一血清群，TetraMenD組中的百分比高於Menomune組中的百分比。對於血清群A、C、Y和W-135，比例的差異分別為-0.0397、-0.0452、-0.1092和-0.0562。
表B-3符合方案數據分析的初步假設(Primary Hypothesis)檢測總結
n從基線期滴度升高≥4倍的受試者數量。
N所使用群體中受試者總數。
Pt和Pm分別為TetraMenD組和Menomune組中接種疫苗後SBA升高≥4倍的受試者比例。
表B-3總結了接種後28天SBA抗體滴度≥32的受試者的比例。
表B-3接種後28天SBA-BR抗體滴度≥32的受試者
的百分比和數量(符合方案數據分析)
*％n/N。
接種後28天滴度≥32的受試者數量。
本組中具有有效的28天血液樣品的受試者總數。
表B-4總結了接種後28天SBA-BR抗體滴度≥128的受試者比例。
表B-4接種後28天SBA-BR抗體滴度≥128的受試者
的百分比和數量(符合方案數據分析)
*％n/N。
接種後28天滴度≥128的受試者數量。
本組中具有有效的28天血液樣品的受試者總數。
SBA-BR抗體滴度至少升高4倍的受試者比例
表B-5顯示了接種後28天和6個月時SBA抗體滴度較基線期升高≥4倍的受試者比例。在接種TetraMenD 28-56天內，大多數受試者經歷了針對疫苗所含的每一血清群的SBA-BR抗體滴度升高≥4倍。
表B-5接種後28天和6個月時SBA-BR抗體滴度較基線期
升高≥4倍的受試者的百分比和數量(符合方案數據分析)
*％n/N。
較基線期升高≥4倍的受試者數量。
所使用群體中受試者總數。
在0天檢測不到滴度(＜8)而在接種後28天SBA-BR抗體滴度升高≥4倍的受試者的比例
在兩個處理組中並且對於所有疫苗血清群，在基線期檢測不到SBA-BR滴度(＜8)的受試者中的大部分在28天時SBA滴度升高≥4倍(表B-6)。在TetraMenD組中，在0天檢測不到滴度(＜8)而在28天時SBA-BR抗體滴度升高≥4倍的受試者比例為86.21％-98.57％；在Menomune組，比例為75.00-94.64。
表B-6在0天檢測不到滴度(＜8)而在接種後28天SBA-BR
抗體滴度升高≥4倍的受試者的數量和比例
*n每一血清群中在0天時滴度＜8而在28天時滴度≥32的受試者數量。
N每一血清群中在0天時滴度＜8的受試者數量。
百分比的精確95％置信區間。
SBA-BR抗體的GMT和升高的平均倍數
表B-7顯示了基線期、接種後28天和6個月時SBA GMT以及SBAGMT升高的倍數。
表B-7基線期、接種後28天和6個月時SBA-BR
血清學結果(符合方案數據分析)
(續表B-7)
*滴度或升高倍數，其中升高倍數＝28天時的滴度/0天時的滴度。
計算所用的受試者總數。
血清群A、C、W-135和Y的IgG的ELISA結果
表B-8顯示了基線期、接種後28天和6個月時IgG GMC值以及IgGGMC的升高倍數。
表B-8基線期、接種後28天和6個月的
IgG血清學結果(符合方案數據分析)
(續表B-8)
*滴度或升高倍數，其中升高倍數＝28天時的滴度/0天時的滴度
計算所用的受試者總數。
接種本研究疫苗TetraMenD後28-56天，大多數受試者對於疫苗所包含的每一血清群的SBA-BR抗體滴度均升高≥4倍。總體來說，有77％的TetraMenD接種者表現為抗所有血清群抗體滴度均升高4倍。血清群Y的接種前抗體水平高於血清群C或W-135。這可能與這樣一種事實相關，即受試者在此階段天然暴露於血清群Y比先前預想的更普遍。較高的循環抗體水平反映了近期天然暴露的情況，並可能降低了呈現為抗體反應升高4倍或更高的疫苗接種者的比例。與其它血清群相比，這種現象明顯出現於血清群Y反應中。血清群Y受試者抗體滴度呈現4倍升高的比例是56.6％，而血清群C是73.4％，血清群A是87.7％，血清群W-135是91.0％。高接種前抗體水平的現象也可以見於血清群A。這可能是受試者長時間間斷性暴露於各種天然存在的交叉反應抗原的結果。
為了進一步評價預先存在的抗體滴度的影響並研究血清陽轉率(定義為對於任何血清群接種前抗體滴度＜1∶8，而接種後抗體呈現4倍升高的受試者比例)，對接種疫苗所包含的4種血清群中任何一種血清群的接種前抗體滴度＜1∶8的受試者進行單獨分析。在以幼兔作為補體來源的SBA測定法中＜1∶8的抗體滴度被認為是循環抗體為不可檢測水平。當用這種標準來評價受試者時，可見接種TetraMenD後，對於血清群A血清陽轉率為98.6％，對於血清群C為87.9％，對於血清群W-135為96.0％，並且對於血清群Y為86.2％。
根據對軍隊新兵的檢查結果，Goldschneider提出，使用人補體來源的SBA測定法中≥1∶4的最小抗體滴度與抗血清群C侵襲性疾病的保護作用相關聯。但是，由於測定標準化的需要以及缺乏可靠的人補體來源，所以建議將幼兔補體作為備選來源。看起來腦膜炎球菌對幼兔補體比對人補體更敏感，這導致檢測出更高的抗體滴度。一些作者建議，在使用幼兔補體的SBA測定中，≥1∶128的滴度預示著具有保護作用，而＜1∶8的滴度預示著至少對血清群C易感。儘管這種水平對於評價多糖疫苗是合適的，但是可能並不適用於綴合疫苗。Borrow建議，在接種單價C綴合疫苗並且接種後SBA滴度在8-64之間的受試者中，如果用降低劑量(10μg)的腦膜炎球菌多糖疫苗接種幾個月後證實產生了記憶應答，則表明這些個體同樣也受到了保護，抗體水平達到≥1∶128。對於接種TetraMenD疫苗並且針對每一血清群的SBA-BR滴度≥1∶128的受試者的結果列於表中。當對疫苗所包含每一血清群使用這些標準時，總體來說，接種TetraMenD且接種後SBA-BR滴度≥1∶32的受試者佔96.2％，滴度≥1∶128的佔90.5％。此臨床研究中的一部分血清也用於評價使用幼兔補體和人補體的SBA測定法間的關聯，並且結果在隨後的研究中提供。
在Menomune組中抗血清群C、Y和W-135的總的IgG反應明顯高於接種TetraMenD組。但是，在TetraMenD組中抗血清群A、C、Y和W-135的接種後SBA GMT水平明顯較高。
表B-9提供了各血清群的GMC和GMT滴度的比較。
表B-9各血清群IgG GMC和SBA GMT滴度的對比
綴合疫苗誘導的較低水平的IgG產生了比多糖疫苗更高的殺菌活性，此現象強有力地表明綴合疫苗抗體反應的質量和親和性優於非綴合多糖疫苗產生的抗體。高親和性抗體與功能活性和記憶應答相關。這種效應在一些已公開的研究中也可以見到。
這些資料證實TetraMenD在2-10歲的兒童中具有高度的免疫原性，對於四個血清群中的每一個，在TetraMenD組中所觀察到的GMT均優於Menomune組，並且所達到的滴度預示著存在保護作用。最後，看來TetraMenD產生了針對疫苗所包含每一血清群的較高親和性的抗體反應。
本試驗過程中，在4個特異時間點監測了安全性報告即刻反應(接種後30分鐘內)、接種後第一個7天內的誘發局部和全身反應、接種後28天的時間內所有不良事件以及接種後0天至6個月間的持續AE(0-28天)和嚴重不良事件。
對於所有的受試者，兩個處理組中所報告的大多數局部誘發反應(Local Solicited Reaction)是輕微的並且可以在接種3天內恢復。對於每一處理組局部反應的發生頻率是相似的。在接受TetraMenD的組中58.8％的受試者報告有至少1種局部反應，而在接受Menomune的組中58.3％的受試者有同樣的反應。此外，對青少年肌肉注射單價C CRM197綴合疫苗出現局部反應的比例與本研究中接種TetraMenD出現局部反應的比例非常相似。
大多數所報告AE是不嚴重的、可逆的並且與疫苗無關。本研究中沒有報告新發支氣管哮喘、糖尿病或自身免疫病。
實施例12.研究C-對11-18歲的兒童進行1個月的研究
研究C是對11-18歲的健康兒童進行的隨機的、具有陽性對照的研究，對在0天接受單一劑量的TetraMenD和單一劑量的Menomune的兒童進行比較。分別在0天即接種前和28天抽取血清並分析，如結果中所描述對來自病人血清的一部分進行進一步評價。
對於所有的受試者，兩個處理組中所報告的大多數局部誘發反應是輕微的並且可以在接種2天內恢復。在接受TetraMenD的組的局部反應頻率(72.4％)比接受Menomune的組(34.7％)更普遍。此結果可能是因為綴合疫苗的性質(包含白喉載體蛋白質)而不是因為施用途徑(採用肌肉注射)造成的。該研究結果總結於下表。
表C-1顯示了基線期和接種後28天對於每一血清群的SBA-BR抗體滴度的頻率分布。
表C-10天和接種後28天時SBA-BR抗體
滴度的分布(符合方案數據分析)
(續表C-1)
(續表C-1)
(續表C-1)
表C-2總結了按照受試者年齡及TetraMenD血清群的GMT水平。
表C-2按照受試者年齡及TetraMenD血清群的GMT的總結
表C-3顯示了從基線期到接種後28天時對於血清群A、C、Y和W-135SBA-BR滴度升高≥4倍的受試者數量和百分比。對於每一血清群，在TetraMenD組中的這些百分比高於Menomune組。
表C-3從基線期至接種後28天SBA-BR滴度升高≥4倍
的受試者數量和百分比
SBA-BR抗體滴度≥32的頻率
接種後28天SBA抗體滴度≥32的受試者的比例總結於表C-4。
表C-4接種後28天SBA抗體滴度≥32的受試者
百分比和數量(符合方案數據分析)
*％n/N。
接種後28天滴度≥32的受試者數量。
本組中具有有效的28天血液樣品的受試者總數。
SBA-BR抗體滴度≥128的頻率
接種後28天SBA抗體滴度≥128的受試者比例總結於表C-5。
表C-5接種後28天SBA抗體滴度≥128的受試者
百分比和數量(符合方案數據分析)
*％表示為百分比的n/N。
接種後28天滴度≥128的受試者數量。
本組中具有有效的28天血液樣品的受試者總數。
SBA-BR抗體滴度升高≥4倍的受試者百分出
表C-6顯示了接種後28天SBA抗體滴度比基線期升高≥4倍的受試者百分比。
表C-6接種後28天SBA抗體滴度比基線期
升高≥4倍的受試者百分比和數量
*％表示為百分比的n/N。
自基線期滴度升高≥4倍的受試者數量。
所使用群體的受試者總數。
在0天無法檢測到滴度(＜8)的受試者中在28天SBA-BR抗體滴度升高≥4倍的受試者百分比
在兩個處理組以及對於所有疫苗血清群，在基線期未檢測到SBA滴度(＜8)的受試者中，大部分在28天時SBA滴度升高≥4倍。在0天SBA滴度＜8的受試者中，從基線期到28天SBA滴度升高≥4倍的受試者的比例範圍為98.17％-100.0％(表C-7)。
表C-7在0天未檢測到滴度(＜8)的受試者中，在28天SBA-BR
抗體滴度升高≥4倍的受試者的數量和百分比
*n＝在每一血清群中0天時滴度＜8的受試者中，28天時滴度≥32的受試者數量。
N＝在每一血清群中0天時滴度＜8的受試者數量。
百分比的精確95％置信區間
SBA-BR抗體GMT和升高的平均倍數
表C-8顯示了基線期和接種後28天的SBA GMT以及SBA GMT升高的倍數。
表C-8基線期和接種後28天SBA血清學結果(符合方案數據分析)
*滴度或升高倍數，其中升高倍數＝28天時滴度/0天時滴度。
計算所使用受試者總數。
血清群A、C、W-135和Y的IgG ELISA結果
表C-9顯示了基線期和接種後28天IgG GMC(μg/mL)以及IgG GMC升高的倍數。
表C-9基線期和接種後28天的IgG血清學結果(符合方案數據分析)
*滴度或升高倍數，其中升高倍數＝28天時滴度/0天時滴度。
計算所使用受試者總數。
血清群A、C、Y和W-135的IgM ELISA結果
表C-10顯示了基線期和接種後28天IgM GMC以及IgM GMC的升高倍數。
表C-10基線期和接種後28天的IgM血清學結果(符合方案數據分析)
*滴度或升高倍數，其中升高倍數＝28天時滴度/0天時滴度。
計算所使用受試者總數。
接種本研究疫苗TetraMenD後28-56天內，大多數受試者對於疫苗所包含的每一血清群的SBA-BR抗體滴度均升高≥4倍。總體來說，對於所有血清學，90.7％的TetraMenD接種者的抗體滴度升高4倍。血清群Y的接種前抗體水平比血清群C或W-135的高。這可能與以下事實相關，即血清群Y是目前與美國該年齡階段侵襲性腦膜炎球菌疾病相關的最普遍的血清群，並且天然暴露於該血清群可能為更普遍。較高的循環抗體水平反映了近期天然暴露情況，並可能降低了呈現為4倍或更高抗體反應的疫苗接種者的比例。與其它血清群相比時發現這似乎是對血清群Y反應的情況。對於血清群Y升高4倍的受試者比例是81.8％，而對於血清群C是91.7％，對於血清群W-135是96.7％。高接種前抗體水平的現象也可見於血清群A。這可能是受試者長時間間斷性暴露於多種天然存在的交叉反應抗原中的結果。
為了進一步評價預先存在的抗體滴度的影響並研究血清陽轉率(定義為對於任何血清群接種前抗體滴度＜1∶8，而接種後抗體呈現4倍升高的受試者比例)，對接種疫苗所包含的4種血清群中任何一種血清群的接種前抗體滴度＜1∶8的受試者進行單獨分析。在以幼兔作為補體來源的SBA測定法中＜1∶8的抗體滴度被認為是循環抗體為不可檢測水平。當用這種標準來評價受試者時，可見接種TetraMenD後，對於血清群A血清陽轉率為100％，對於血清群C為98.1％，對於血清群W-135為98.1％，並且對於血清群Y為98.3％。
如在另一個研究中中進行的先前的討論一樣，根據對軍隊新兵的檢查結果，Goldschneider提出，使用人補體來源的SBA測定法中≥1∶4的最小抗體滴度與抗血清群C侵襲性疾病的保護作用相關聯。但是，由於測定標準化的需要以及缺乏可靠的人補體來源，所以建議將幼兔補體作為備選來源。看起來腦膜炎球菌對幼兔補體比對人補體更敏感，這導致檢測出更高的抗體滴度。一些作者建議，在使用幼兔補體的SBA測定中，≥1∶128的滴度預示著具有保護作用，而＜1∶8的滴度預示著至少對血清群C易感。儘管這種水平對於評價多糖疫苗是合適的，但是可能並不適用於綴合疫苗。Borrow建議，在接種單價C綴合疫苗並且接種後SBA滴度在8-64之間的受試者中，如果用降低劑量(10μg)的腦膜炎球菌多糖疫苗接種幾個月後證實產生了記憶應答，則表明這些個體同樣也受到了保護，抗體水平達到≥1∶128。對於接種TetraMenD疫苗並且針對每一血清群的SBA-BR滴度≥1∶128的受試者的結果列於表中。當對疫苗所包含每一血清群使用這些標準時，總體來說，接種TetraMenD且接種後SBA-BR滴度≥1∶128的受試者佔99.2％。使用標準ELISA測定法評價了部分受試者的IgG和IgM反應。接種後，TetraMenD接種者對每一血清群的IgG抗體平均水平＞2μg。在兩個處理組中對每一血清群的IgM反應非常相似。對於血清群C、Y和W-135的IgG反應，Menomune組高於TetraMenD組。然而，接種後對於血清群C、Y和W-135的SBA GMT水平在每一處理組中非常相似，見表C-11。
表C-11IgG和IgM對總的殺菌活性的相對作用
*GMC單位是μg/mL
綴合疫苗誘導的較低水平的IgG產生了與多糖疫苗相似的殺菌活性，此現象強有力地表明綴合疫苗抗體反應的質量和親和性優於非綴合多糖疫苗產生的抗體。正是高親和性抗體與功能活性和記憶應答相關。這種效應在一些已公開的研究中也可以見到。
這些資料表明TetraMenD在青少年群體中具有高度的免疫原性。對於兩種疫苗中四個血清群中的每一個，GMT基本上相同，並且所達到的滴度預示著存在保護作用，並且看起來TetraMenD產生了對疫苗所包含的每一血清群的較高親和性的抗體反應。
研究D
研究D是對18-55歲成人進行的隨機的、具有陽性對照的研究，對在0天接受單一劑量的TetraMenD和單一劑量的Menomune的成人進行比較。分別在0天即接種前和28天抽取血清並分析。
一般來說，在安全性方面TetraMenD和Menomune是可比的，尤其是已報告的誘發局部反應(0-7天)、誘發全身反應(Solicited SystemicReaction)(0-天)、非誘發不良事件(Unsolicited Adverse Event)(0-28天)、非誘發明顯不良事件和SAE(29天-6個月)以及嚴重不良事件(0-6個月)出現的比例都是Menomune的2-3％。本研究結果提供於下表。
SBA-BR抗體滴度的分布
表D-1顯示了基線期和接種後28天對於每一血清群的SBA-BR抗體滴度的頻率分布。
表D-1在0天和接種後28天SBA-BR抗體滴度的分布(符合方案數據分析)
(續表D-1)
表D-2總結了按照受試者年齡和TetraMenD血清群的滴度幾何均數(GMT)。
表D-2按照受試者年齡和TetraMenD血清群的GMT總結
(續表D-2)
表D-3顯示了從基線期到接種後28天對於血清群A、C、Y和W-135SBA-BR滴度升高≥4倍的受試者的數量和百分比。在TetraMenD組中對於血清群A(1028/1278，80.4％)；C(1131/1278，88.5％)；Y(941/1278，73.6％)和W-135(1142/1278，89.4％)的受試者的數量和百分比與Menomune組中對於血清群A(929/1099，84.5％)；C(985/1099，89.6％)；Y(872/1099，79.3％)和W-135(1036/1099，94.3％)的受試者的數量和百分比是可比的。
表D-3按照血清群的從基線期SBA-BR滴度升高≥4倍
的受試者的數量和百分比
*檢驗零假設H0PMenomune-PTetraMenD≥0.10對HaPMenomune-PTetraMenD＜0.10。
n＝從基線期滴度升高≥4倍的受試者數量/N＝符合方案數據分析的受試者的總數。
TetraMenD組中接種後SBA-BR滴度從基線期升高≥4倍的受試者的百分比。
§PMenomuneMenomune組中接種後SBA-BR滴度從基線期升高≥4倍的受試者的百分比。
SBA-BR抗體滴度≥32的頻率
接種後28天SBA-BR抗體滴度≥32的受試者比例總結於表D-4。
表D-4接種後28天SBA抗體滴度≥32的受試者
的百分比和數量(符合方案數據分析)
*％n/N。
接種後28天滴度≥32的受試者數量/N該組中具有有效28天血液樣品的受試者總數。
SBA-BR抗體滴度≥128的頻率
接種後28天SBA-BR抗體滴度≥128的受試者的比例總結於表D-5。
表D-5接種後28天SBA抗體滴度≥128的受試者
的百分比和數量(符合方案數據分析)
*％n/N。
接種後28天滴度≥128的受試者數量。
該組中具有有效28天血液樣品的受試者總數。
表D-6通過基線期共變量調整的GMT對處理效果的分析
從0天到28天滴度差異的反應(符合方案數據分析)*
*處理效果的反對數計算為2的處理效果(Menomune-TetraMenD)的乘冪。
SBA-BR抗體滴度至少升高≥4倍的受試者的比例
表D-7顯示了從基線期至接種後28天SBA抗體滴度較升高≥4倍的受試者的比例。
表D-7從基線期至接種後28天SBA抗體滴度較升高≥4倍
的受試者的數量和百分比
*％n/N。
從基線期滴度升高≥4倍的受試者數量。
每一血清群中抽取血液的受試者數量。
在0天未檢測到滴度(＜8)的受試者中，在28天SBA-BR抗體滴度升高≥4倍的受試者的比例
表D-8顯示了在0天未檢測到滴度(＜8)的受試者中，在28天SBA-BR抗體滴度升高≥4倍的受試者的比例。在兩個處理組中並且對於所有的疫苗血清群，在基線期未檢測到滴度(＜8)的受試者中的大多數在28天時SBA滴度升高了≥4倍。在0天滴度＜8的受試者中，從基線期至28天SBA滴度升高≥4倍的受試者比例範圍在TetraMenD組中為90.7％-100.0％，並且在Menomune組中為96.9％-99.3％。
表D-8在0天未檢測到滴度(＜8)的受試者中，在28天
SBA-BR抗體滴度升高≥4倍的受試者的比例
*％n/N。
在每一血清群中在0天滴度＜1∶8而在28天滴度≥1∶32的受試者數量。
在每一血清群中在0天滴度＜1∶8的受試者數量。
表D-9顯示了基線期和接種後28天SBA GMT以及SBA GMT的升高倍數。
表D-9按照血清群的抗體滴度幾何均數(GMT)
和GMT升高倍數的總結(符合方案數據分析)
*滴度或升高倍數，其中升高倍數＝28天時滴度/0天時滴度。
每一血清群中抽取血液的受試者數量。注意有一個受試者沒有取成第二次血液樣品。
根據正常分布的近似值計算GMT的95％CI。
接種本研究疫苗TetraMenD後28-56天內，大多數受試者對於疫苗所包含的每一血清群的SBA-BR抗體滴度均升高≥4倍。針對血清群A、C、Y和W-135的抗體滴度升高≥4倍的受試者的比例分別是80.4％、88.5％、73.6％和89.4％。血清群Y的接種前抗體水平比血清群C或W-135的高。這可能與以下事實有關，即血清群Y是目前與美國該年齡階段侵襲性腦膜炎球菌疾病相關的最普遍的血清群，並且暴露於該血清群可能為更普遍。較高的循環抗體水平反映了近期天然暴露情況，並可能降低了呈現為4倍或更高抗體反應的疫苗接種者的比例。與其它血清群相比時發現這似乎是對血清群Y反應的情況。對於血清群Y升高4倍的受試者比例是73.6％，而對於血清群C是88.5％，對於血清群W-135是89.4％。高接種前抗體水平的現象也可見於血清群A。這可能是受試者長時間間斷性暴露於多種天然存在的交叉反應抗原中的結果。
為了進一步評價預先存在的抗體滴度的影響並研究血清陽轉率(定義為對於任何血清群接種前抗體滴度＜1∶8，而接種後抗體呈現4倍升高的受試者比例)，對接種疫苗所包含的4種血清群中任何一種血清群的接種前抗體滴度＜1∶8的受試者進行單獨分析。在以幼兔作為補體來源的SBA測定法中＜1∶8的抗體滴度被認為是循環抗體為不可檢測水平。當用這種標準來評價受試者時，可見接種TetraMenD後，對於血清群A血清陽轉率為100％，對於血清群C為99.4％，對於血清群W-135為96.5％，並且對於血清群Y為90.7％。
如在另一個研究中中進行的先前討論一樣，根據對軍隊新兵的檢查結果，Goldschneider提出，使用人補體來源的SBA測定法中≥1∶4的最小抗體滴度與抗血清群C侵襲性疾病的保護作用相關聯。建議將幼兔補體作為備選來源，但是看起來腦膜炎球菌對幼兔補體比對人補體更敏感，這導致檢測出更高的抗體滴度。一些作者建議，在使用幼兔補體的SBA測定中，≥1∶128的滴度預示著具有保護作用，而＜1∶8的滴度預示著至少對血清群C易感。儘管這種水平對於評價多糖疫苗是合適的，但是可能並不適用於綴合疫苗。Borrow建議，在接種單價C綴合疫苗並且接種後SBA滴度在8-64之間的受試者中，如果用降低劑量(10μg)的腦膜炎球菌多糖疫苗接種幾個月後證實產生了記憶應答，則表明這些個體同樣也受到了保護，抗體水平達到≥1∶128。當對疫苗所包含每一血清群應用這些標準時，在接受TetraMenD的受試者中，接種後針對血清群A、C、Y和W-135的SBA-BR滴度≥1∶128的受試者百分比分別是99.8％、98.7％、96.9％和97.1％。
實施例13.研究E-對10-18歲兒童中進行的Td加強免疫研究
如通過測定具有針對破傷風和白喉滴度的可接受反應的受試者的比例，本研究比較了破傷風和白喉類毒素(Td)在接受試驗性四價腦膜炎球菌白喉綴合疫苗(即TetraMenD)並伴隨Td的組中的加強反應與在接受Td和安慰劑組中的反應。可接受反應定義為在接種後28天，從具有預先定義的低接種前滴度的受試者的基線期值升高至少4倍，和從預先定義的高接種前滴度的受試者的基線期值升高至少2倍。
為了比較TetraMenD和Td一起施用時對血清群A、C、Y和W-135的抗體反應與Td疫苗施用後28天再施用TetraMenD中的反應，測定了針對每一血清群滴度至少升高4倍的受試者的比例。
本實驗是隨機、改良雙盲、陽性對照的多中心試驗，將1024位受試者隨機分成兩個處理組A和B。
在11-17歲的兒童中選擇出作為常規兒童免疫接種方案一部分將會進行正常Td疫苗免疫的個體。此外，此年齡範圍兒童已經被確認為發展成侵襲性腦膜炎球菌疾病的高危人群，並且將是腦膜炎球菌綴合疫苗一經許可後最可能接種的候選人群。為了正確評價疫苗的安全性，採用了一種使用安慰劑作為對照的改進雙盲設計。第一次隨訪時，注射疫苗的護士是非盲的，根據方案施用於每一手臂；TetraMenD(IM)或安慰劑接種於右臂，Td接種於左臂。第二次隨訪時，每一處理組均左臂接種。檢測局部和全身反應和不良事件的評價護士是不知情的。
在11-17歲的兒童中選擇出作為常規兒童免疫接種方案一部分將會進行正常Td疫苗免疫的個體。此外，此年齡範圍兒童已經被確認為發展成侵襲性腦膜炎球菌疾病的高危人群，並且將是腦膜炎球菌綴合疫苗一經許可後最可能接種的候選人群。
在接種前0天(基線期)和第1次接種後28天，抽取用於血清學測試的血液樣品(至少5mL全血)。在第二次隨訪後28天從受試者第3次抽血。測試每一時間點血清中的腦膜炎球菌血清群A、C、Y和W-135、抗白喉抗體以及抗破傷風抗體。
為了評價TetraMenD接種者的抗體功能，對所有可得樣品進行針對每一疫苗血清群的利用幼兔補體的SBA(SBA-BR)測定分析。一個免疫學的判定終點是每一處理組中SBA-BR滴度升高≥4倍的受試者比例。通過測試血清保護Vero細胞免受白喉毒素攻擊的能力來測定抗白喉抗體的水平。通過間接酶聯免疫吸附測定(ELISA)測定抗破傷風抗體的水平。
本研究通過檢測GMT值，比較了兩組受試者對TetraMenD血清群A、C、Y和W-135的抗體反應，一組來自前面的研究即研究C，其中受試者接受一次劑量的TetraMenD，另一組為接種Td的同時以及28天後施用TetraMenD的受試者。
用於血清學分析的血清樣品取自接種前基線期(0天)、接種後28天(窗口期(window)+28天)和6個月。在接種前以及接種後28天檢測針對破傷風類毒素和白喉類毒素(Td)疫苗的抗體滴度。
測定所有可得接種前和接種後28天血液樣品中抗腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、Y和W-135的SBA-BR抗體滴度。總體上，組A和組B的安全性是可比的。研究結果總結於下表。
表E-1按照受試者年齡和血清群的GMT水平總結
表E-2顯示了在28天破傷風和白喉抗體升高至少4倍或2倍的受試者的數量和比例。
表E-2在28天破傷風和白喉抗體升高至少4倍或2倍
的受試者的數量和比例
抗破傷風和白喉抗體滴度和抗血清群A、C、Y和W-135的SBA抗體滴度
表E-2顯示了在28天時抗破傷風和白喉抗體升高至少4倍或2倍的受試者的數量和比例。對於破傷風和白喉比例的差異分別為2.78和-2.73。
表E-2接種破傷風和白喉疫苗後28天破傷風和白喉抗體反應升高至少4倍
或2倍的受試者總數和比例，初步假設1(符合方案數據分析)
表E-3顯示了28天時抗血清群A、C、Y和W-135的抗體滴度升高至少4倍的受試者的數量和比例。
表E-3在接種TetraMenD後28天SBA-BR滴度升高≥4倍的
受試者的數量和比例，初步假設2(符合方案數據分析)
表E-4顯示了在基線期具有高的白喉和破傷風滴度的受試者的數量以及在28天時滴度升高2倍的受試者的數量和比例。
表E-4在基線期具有高的白喉和破傷風接種前滴度受試者的數量(％)以及
在28天時滴度升高2倍的受試者的數量和比例，符合方案數據分析
表E-5顯示了在基線期具有低的白喉和破傷風滴度的受試者的數量以及在28天時滴度升高4倍的受試者的數量和比例。
表E-5在基線期具有低的白喉和破傷風接種前滴度受試者的數量(％)以及
在28天時滴度升高2倍的受試者的數量和比例，符合方案數據分析
表E-6顯示了伴隨TetraMenD或安慰劑進行破傷風和白喉疫苗接種後28天，破傷風和白喉抗體滴度≥1.0IU/ml的受試者的數量和比例。
表E-6接種破傷風和白喉疫苗後28天，破傷風和白喉抗體滴度
≥1.0IU/ml的受試者的數量和比例，(符合方案數據分析)
表E-7顯示了在破傷風和白喉疫苗接種(伴隨TetraMenD或安慰劑施用)後28天，抗破傷風和白喉抗體滴度的幾何均數(GMT)。
表E-7在破傷風和白喉疫苗接種後28天，抗破傷風和白喉抗體
滴度的幾何均數(GMT)比較，(符合方案數據分析)[1]
表E-8顯示了接種TetraMenD後28天，抗血清群A、C、Y和W-135SBA-BR抗體滴度的幾何均數(GMT)。對於血清群A、C、Y和W-135GMT比率分別是0.92、0.42、0.39和0.32。
表E-8在接種TetraMenD後28天，SBA-BR抗體滴度
的幾何均數(GMT)的比較，(符合方案數據分析)[1]
表E-9顯示了在Td+TetraMenD，安慰劑組接種TetraMenD後28天抗血清群A、C、Y和W-135SBA-BR抗體滴度的幾何均數(GMT)和研究MTA02中的相應結果。對於血清群A、C、Y和W-135的GMT比率分別是0.48、0.38、0.34和0.39。
表E-9在Td+TetraMenD，安慰劑組中接種TetraMenD後28天SBA-BR的 抗體滴度幾何均數(GMT)與研究C中相應結果的比較，(符合方案數據分析)
表E-10顯示了在Td+安慰劑，TetraMenD組接種TetraMenD後28天抗血清群A、C、Y和W-135SBA-BR的抗體滴度幾何均數(GMT)和研究MTA02中的相應結果。對於血清群A、C、Y和W-135，GMT比率分別是0.53、0.90、0.99和1.05。
表E-10在組B中接種TetraMenD後28天SBA-BR抗體滴度的幾何均數 (GMT)與研究C中相應結果的比較，觀察假設(Observational Hypothesis)
(符合方案數據分析)[1]
表E-11顯示了符合方案數據分析中按照血清群的接種TetraMenD後0天和28天SBA-BR抗體滴度分布(SBA-BR滴度從＜8至1024)。
表E-11按照血清群的接種TetraMenD後0天和28天SBA-BR
抗體滴度的分布(符合方案數據分析)(SBA-BR滴度從＜8至1024)
表E-12顯示了符合方案數據分析中按照血清群的接種TetraMenD後0天和28天SBA-BR抗體滴度分布(SBA-BR滴度從2048至524288)。
表E-12根據血清群的接種TetraMenD後0天和28天SBA-BR抗體滴度
的分布(符合方案數據分析)(SBA-BR滴度從2048至524288)
表E-13抗體滴度的總結破傷風和白喉滴度的分布
(符合方案數據分析)[1]
為了取得與許可的Td疫苗伴隨施用的MCV-4疫苗的安全性和免疫原性，在健康的10-17歲青少年中開展了相關性研究。簡而言之，在多中心隨機試驗中，對健康的10-17歲(平均年齡12.9歲)青少年同時(n＝509)或者在分開一個月的不同隨訪時(n＝512)接種TetraMenD(MCV-4)+Td。在接種後8天和28天對分別接種和伴隨接種的兩種疫苗進行安全性評價。通過抗白喉和破傷風的抗體滴度以及抗腦膜炎球菌血清群的血清殺菌活性(SBA)來評價接種前和接種4周後的免疫反應。單獨接種Td的受試者的安全性方面與接種Td+TetraMenD的受試者的安全性方面相似。Td+TetraMenD伴隨施用不幹擾對破傷風或者白喉類毒素的免疫應答。對四種血清群的SBA反應總結於下表E-14。
表E-14對四種血清群的SBA反應
本研究顯示同時施用Td和TetraMenD是安全的，所測試受試者耐受性良好。伴隨施用TetraMenD+Td不會對針對破傷風和白喉類毒素的免疫應答產生不利影響。MCV-4與Td同時施用可以增強對血清群C、Y和W135多糖的免疫應答。本研究中所觀察到的增強免疫應答是令人驚訝和意料之外的。
實施例14.對使用幼兔補體和使用人補體的腦膜炎奈瑟氏球菌血清群C、W-135和Y血清殺菌力測定的比較
來自研究A中III期臨床試驗的一部分血清樣品用於本研究，以便將抗血清群C、W-135和Y的SBA-BR滴度結果與SBA-HC滴度結果進行比較。本試驗中登記的受試者年齡至少為2歲但還不到11歲，而且將每位受試者隨機指定為兩個疫苗接種組之一。在基線期(接種疫苗前)和接種後28天從每位受試者抽取大約5mL全血。在收集後4小時內，將來自受試者的血液樣品離心。從血凝塊中取出血清，轉移至標記好的冷凍管並貯存於-20℃或更冷的溫控冰箱中。本報告分析中使用的所有血液樣品均來自在臨床研究中登記的第一批受試者的雙份血清，並且具有足夠的體積以完成全部計劃測試。除了一個樣品來自4歲的受試者以外，其餘所有樣品均來自2歲至3歲的受試者。有兩個受試者為意向性分析類(intent-to-treatcategory)。其中一個來自TetraMenD疫苗接種組(接種後28天的血液樣品在24天時就收集了)，另一個來自Menomune疫苗接種組(接種後28天的血液樣品在9天時就收集了)。
提前篩選出適於每一血清群特異性分析的幼兔補體(Pel-Freez，Clinical Systems LLC，Brown Deer，WI，產品編號31038)。適宜性標準包括與使用先前合格批次的家兔補體對所定義部分的血清樣品(兩倍稀釋內)進行的SBA-BR檢測結果相一致。也可以使用滿足對參考血清和對照樣品的預先確定滴度的標準。將2.5ml兔補體的等分試樣貯存於-70℃或溫度更低直至準備分析。將等分試樣融化一次使用然後丟棄。
為了鑑定能夠用於SBA-H的補體源，通過ELISA篩選所登記受試者血清的抗腦膜炎球菌多糖的IgG和IgM水平，並用SBA-BR測試功能性抗體。選擇人類來源補體所確定標準如下(1)當使用SBA-BR測定法測定時缺乏可檢測的抗體；(2)當在測定法中用作補體源時缺乏內在的殺菌活性；(3)當在一組陰性對照中用作補體源時得出的結果是可以接受的，其中使用Ray Borrow博士在獨立的外部實驗室確定的先前具有陰性測試結果的血清，和(4)在一組24個樣品中的再現性可以接受。用於每一血清群特異性測定法中的外源性補體源來自不同的受試者。沒有一種補體來源用於一種以上血清群的測定法。同樣，在SBA測定法中使用的三個補體源中，對於每一血清群使用來自單一供體的補體源。
血清群C
來自具有可接受的低ELISA值(對於IgG和IgM都小於0.5μg/ml)的幾個受試者的血清用來證明殺菌活性。
血清群Y
用於血清群Y SBA-H的補體源選自收集方案中登記的受試者。來自補體的血清通過ELISA顯示為低水平的血清群Y IgG和IgM抗體，並且在SBA-BR測定中是陰性的。當該來源的血清用於SBA中時沒有內在殺菌活性。
血清群W-135
用於血清群W-135SBA-H的補體源選自收集方案中登記的受試者。來自補體源的血清通過ELISA顯示為低水平的血清群W-135IgG和IgM抗體，並且在SBA-BR測定中是陰性的。當該來源的血清用於SBA中時沒有內在殺菌活性。
血清殺菌了測定
簡而言之，腦膜炎球菌血清群C、Y和W-135菌株來自美國疾病控制中心，Atlanta，GA(CDC)。由剛剛融化的血清群C、Y和W-135的工作種子批製備用於測定的細菌靶菌株。每管劃線接種於一個Thayer Martin平板，於37℃±0.5℃、5％CO2條件下培養過夜。第二天，用無菌拭子挑取單個菌落，並接種於已預熱至室溫的新鮮Thayer Martin平板的整個表面。將平板於37℃±0.5℃、5％CO2培養4小時，以獲取細菌生長匯合後形成的亮的菌幕，用無菌拭子收集後懸浮培養於Dulbeccos PBS+0.1％葡萄糖緩衝液中達到規定的光密度(600nm處的吸光度)。用Dulbeccos PBS+0.1％葡萄糖緩衝液製備規定濃度細菌的工作液，工作液須維持於室溫且在製備後30分鐘內使用。
將測試血清樣品於56℃熱處理30分鐘以失活內源性補體。向96孔微量滴定板的所有孔中加入Dulbeccos PBS+0.1％葡萄糖緩衝液，然後將測試血清以連續倍比稀釋分配於板內，留下最後兩列孔作為補體和血清對照孔。每塊板中包括一個補體列([第11列]-血清/+補體)和一個血清對照列([第12列]+血清/-補體)。
將剛剛融化的補體與工作濃度的細菌混合，並將混合物分別加入微量滴定板除血清對照孔之外的所有孔中。將未添加補體的細菌加入到血清對照孔中。蓋上滴定板並置於板振蕩器上振蕩1分鐘，然後轉移至37℃±0.5℃的CO2培養箱。對於血清群A測定，培養時間是90分鐘，而對於血清群C、Y和W-135測定，培養時間是60分鐘。培養後，向所有孔中小心加入100μl 50℃±1℃的瓊脂糖覆層培養基，避免產生氣泡。在室溫中將微量滴定板蓋板微微敞開(避免形成水蒸汽)放置10分鐘後，蓋上蓋板並轉移到幹的(沒有額外的溼氣)5％CO2培養箱中，37℃±0.5℃條件下培養20±4小時。此次培養後，計數每孔中細菌菌落的數量。計算出補體對照孔中的每孔菌落的平均數，並除以2得到T0時的50％生存率。每一未知血清的殺菌滴度表示為與T0時50％生存率相比較達到≥50％致死的最終倒數型血清稀釋度。在SBA-BR中，樣品的起始稀釋倍數為1∶8。對於SBA-H，如原始測定法中所述，樣品的起始稀釋倍數低至1∶4。將文中描述的用於血清群A測定的SBA-BR方法與標準的SBA方法(CDC)和Manchester PublicHealth Laboratory Services，Meningococcal Reference Unit，Manchester，UK所執行的SBA方法(PHLS)進行比較，並列於表14-1。
表14-1血清殺菌力試驗方法的比較
參考血清(CDC供體-R21654-3430107)從CDC的George Carlone博士得到，為瓶裝的凍乾粉末，貯存於2℃至8℃直至使用。需要時，將每瓶粉末用0.5ml無菌水再水化，並以100μl的等分試樣工作液貯存於-80℃至-40℃。在這些條件下重新配製的參考血清的滴度是1∶256±1，這是血清群A、C、Y和W-135的標準化SBA-BR中的兩倍稀釋液。
在每天測定中的一組板中的不同板中對參考血清測定兩次。
對於血清群A、C、Y和W-135的群特異兔抗血清從Difco購得，為瓶裝凍乾粉末，使用前貯存於2℃至8℃。需要時，將每瓶粉末用1ml無菌水再水化，並以50μl的等分試樣貯存於-80℃至-40℃，以用作SBA中的質量控制樣品的。
為了確定臨床血液樣品中補體介導的對腦膜炎奈瑟氏球菌血清群C、Y和W-135的抗多糖殺菌活性，文中提供了使用幼兔補體的血清殺菌力試驗(SBA-BR)結果，該結果在精度、稀釋度(線性)、特異性和檢測限是完全有效的。為了建立測定法的精度，使用同一批血清樣品在連續的5天內重複進行SBA-H測定(對於血清群C)。
SBA-BR敏感性和特異性的計算
使用1∶4和1∶8的SBA-H基準滴度將從SBA-BR中得到的滴度分成真陽性(TP)(和假陽性[FP])和真陰性(TN)(和假陰性[FN])。敏感性按照TP/(TP+FN)來計算，特異性按照TN/(TN+FP)來計算。這些計算結果均用百分數來表示。
SBA-BR對SBA-H的SBA滴度分布的比較
表1和表4顯示了對於血清群C的免疫接種前和免疫接種後28天的SBA滴度，表2和表5顯示了對於血清群Y的免疫接種前和免疫接種後28天的SBA滴度，表3和表6顯示了對於血清群W-135的免疫接種前和免疫接種後28天的SBA滴度。在下面的分部分中總結了通過比較來自兩種補體源(BR和H)的測定結果對免疫接種前和免疫接種後SBA滴度的分析。
血清群C的SBA滴度分布
在101個免疫接種前血清樣品中，有63個為如下所定義的陰性，該定義即具有＜1∶4的SBA-H滴度和＜1∶8的SBA-BR滴度。有27個免疫接種前樣品用SBA-H測定時是陰性的(＜1∶4)，但用SBA-BR測定時是陽性的(≥1∶8)。使用＜1∶8的SBA-BR截斷滴度(cut off titer)的假陽性率為30％。在較高的SBA-BR截斷滴度時假陽性率降低了，在1∶128的截斷滴度時假陽性率小於20％並且在1∶512的截斷滴度時假陽性率小於10％。有7樣品為SBA-H測定陽性(≥1∶4)而SBA-BR測定陰性(＜1∶8)。
在免疫接種後血清中，48個樣品為SBA-H測定陰性，但通過SBA-BR測定時僅有11個為陰性。SBA-BR測定為陰性的11個樣品中，有3個為SBA-H測定陽性。在綴合疫苗接種組中的51個免疫接種後樣品中有17個(32％)為SBA-H測定陰性，但SBA-BR測定陽性(≥1∶8)。對於多糖疫苗接種組，50個免疫接種後樣品中有23個(46％)為SBA-H測定陰性，但SBA-BR滴度測定陽性(≥1∶8)。
根據免疫接種後血清的陽性反應，101個樣品中有90個(89％)為SBA-BR測定陽性(≥1∶8)，但是只有53個(52％)為SBA-H測定陽性(≥1∶4)。當比較來自兩個疫苗接種組的SBA滴度(BR對H)時，發現它們的陽性反應率具有明顯差異。對於綴合疫苗接種組中的51個免疫接種後樣品，有33個(65％)為SBA-H測定陽性(≥1∶4)且SBA-BR測定陽性(≥1∶8)。當SBA-BR滴度閾值(threshold titer)為≥1∶64或更高時，則改善了SBA滴度間(BR對H)一致性。在多糖疫苗接種組中的50個樣品中，有17個(34％)為SBA-H測定陽性(≥1∶4)且SBA-BR測定陽性(≥1∶8)。當SBA-BR滴度閾值為≥1∶512或更高時，則改善了SBA滴度間(BR對H)的一致性。
血清群Y的SBA滴度分布
與血清群C免疫接種前血清不同，僅有9個血清群Y免疫接種前樣品為如下所定義的陰性，該定義即具有＜1∶4的SBA-H滴度和＜1∶8的SBA-BR滴度。在61個免疫接種前樣品中，有52個為SBA-H測定陰性(＜1∶4)但SBA-BR測定陽性(≥1∶8)。使用＜1∶8的SBA-BR截斷滴度的假陽性率為85％。在較高的SBA-BR截斷滴度時假陽性率降低了，在1∶256的截斷滴度時假陽性率小於15％並且在1∶512的截斷滴度時假陽性率小於2％。2個樣品為SBA-H測定陽性(≥1∶4)但SBA-BR測定陰性(＜1∶8)。
在免疫接種後血清樣品中，沒有一個是SBA-H滴度＜1∶4且SBA-BR滴度＜1∶8。19個樣品通過SBA-H測定為陰性(＜1∶4)但為SBA-BR測定陽性(≥1∶8)。如對於血清群C所指出，假陰性結果的比例是有差異的。在綴合疫苗接種組中，48個樣品中有5個(9％)為SBA-H測定陰性(＜1∶4)但為SBA-BR測定陽性。在多糖疫苗接種組中，52個樣品中有14個(27％)為SBA-H測定陰性(＜1∶4)但為SBA-BR測定陽性。
對於血清群Y免疫接種後血清的陽性反應，兩個SBA滴度(BR對H)具有良好的一致性。對於100個總樣品中，所有100個免疫接種後樣品為SBA-BR滴度≥1∶8，並且有81個樣品的SBA-H滴度≥1∶4。如對於血清組C的SBA反應中所指出，與多糖疫苗接種組的SBA滴度(RB對H)相比，綴合疫苗接種組的SBA滴度(RB對H)間具有較好的相關性。在綴合疫苗接種組的48個免疫接種後樣品中，有43個(90％)為SBA-H測定陽性(≥1∶4)且SBA-BR測定陽性(≥1∶8)。在48個樣品中只有一個樣品的SBA-BR滴度小於1∶32，且該樣品為SBA-H測定陽性(≥1∶4)。在多糖疫苗接種組中，SBA滴度間(BR對H)的一致性不好。在52個免疫接種後樣品中，只有38個樣品(73％)的SBA-H滴度≥1∶4且SBA-BR滴度≥1∶8。在SBA-BR滴度≥1∶128時，多糖疫苗接種組中免疫接種後血清的SBA滴度間(BR對H)一致性得到改善。
血清群W-135的SBA滴度分布
對於血清群W-135，在100個樣品中有54個(54％)為陰性，其中SBA-H滴度＜1∶4且SBA-BR滴度＜1∶8。在81個免疫接種前樣品中，有27個為SBA-H測定陰性(＜1∶4)但SBA-BR測定陽性(≥1∶8)。使用＜1∶8的SBA-BR截斷滴度的假陽性率為33％。在較高的SBA-BR截斷滴度時，假陽性率降低了，在1∶128的截斷滴度時假陽性率小於15％，並且在1∶256的截斷滴度時假陽性率小於5％。11個樣品為SBA-H測定陽性(≥1∶4)但為SBA-BR測定陰性(＜1∶8)。
在免疫接種後樣品中，有3個為SBA-H測定陰性(＜1∶4)且SBA-BR測定陰性(＜1∶8)。39個免疫接種後樣品為SBA-H測定陰性(＜1∶4)，但SBA-BR滴度陽性(≥1∶8)。在綴合疫苗接種組，47個樣品中有11個(23％)為SBA-H測定陰性但SBA-BR測定陽性。在多糖疫苗接種組，53個樣品中有28個(53％)為SBA-H測定陰性但SBA-BR測定陽性。
免疫接種後樣品SBA-BR和SBA-H滴度間一致性與血清群C的相當，但不如血清群Y。如在血清群C和血清群Y中所提到，與比較兩個疫苗接種組時，對於W-135血清群的兩種SBA滴度間(BR對H)一致性有顯著差異。與多糖疫苗接種組相比，綴合疫苗接種組中兩種SBA滴度間(BR對H)一致性較好。在綴合疫苗接種組47個免疫接種後樣品中，有36個(77％)樣品為SBA-H滴度≥1∶4，並且全部樣品為SBA-BR測定陽性(≥1∶8)。來自綴合疫苗接種組的所有樣品的免疫接種後SBA-BR滴度≥1∶32。對於多糖疫苗接種組的免疫接種後樣品滴度，兩種SBA滴度間的相關性不好，53個樣品中僅有22個樣品(42％)的SBA-H滴度≥1∶4並且50個樣品(94％)的SBA-BR滴度≥1∶8。
表1對於血清群C，通過SBA-H測定為
陽性和陰性血清中的SBA-BR滴度的比較
表2對於血清群Y，通過SBA-H測定為
陽性和陰性血清中的SBA-BR滴度比較
表3對於血清群W-135，通過SBA-H測定為
陽性和陰性血清中的SBA-BR滴度比較
表4通過SBA-BR和SBA-H測定的血清群C滴度分布的總結
1樣品總數為101。
表5通過SBA-BR和SBA-H測定的血清群Y滴度分布的總結
1樣品總數為100。
表6通過SBA-BR和SBA-H測定的血清群W-135滴度分布的總結
1樣品總數為100。
SBA-BR和SBA-H滴度的敏感性和特異性比較
在進行兩種滴度的敏感性和特異性評價時，將SBA-BR滴度與SBA-H的保護滴度1∶4和1∶8進行比較。在該分析中使用了免疫接種前和免疫接種後的兩種血清。使用1∶4和1∶8的SBA-H基準滴度，計算了對於3個血清組的特異性和敏感性，並總結於表7、9和10。依次討論對於每一血清組的敏感性和特異性分析。
對於血清群C，相對於1∶4和1∶8的SBA-H滴度，SBA-BR的閾值滴度為1∶8、1∶16和1∶32的敏感性大於80％。但是，這些SBA-BR滴度的特異性低於60％。在1∶64的SBA-BR滴度時特異性增加超過60％，在1∶128的SBA-BR滴度時特異性超過70％。對於該後兩種SBA-BR滴度，其特異性開始降低。在1∶64的SBA-BR閾值滴度時，敏感性在75和78％之間，但在1∶128的SBA-BR滴度時敏感性降至62和65％之間。在SBA-BR滴度＞1∶64時特異性繼續增加，範圍分別從1∶128時的73％升至1∶256時的83％。但是，其敏感性由43％降至低於20％。對於血清群C，在敏感性和特異性間達到最佳平衡的SBA-BR滴度範圍是1∶32和1∶128之間。本試驗中對於血清群C的敏感性和特異性結果與Santos GF等人(Santos GF等人，2001.Clin.Diagn.Lab.Immunol.8616-623)通過不同組的血清樣品和試劑得到的結果(表8)是可比的，就Santos的結果來說，敏感性和特異性達到最好平衡是在SBA-BR滴度1∶64和1∶128之間，與之相對，兩個SBA-H滴度為1∶4和1∶8。
表7對於血清群C，在SBA-H保護滴度時
SBA-BR滴度的敏感性和特異性
表8如Santos等人，2001.Clin.Diagn.Lab.Immunol.8616-623中所報導， 對於血清群C，在SBA-H保護滴度時SBA-BR滴度的敏感性和特異性
對於血清群Y，當SBA-BR閾值滴度在1∶8到1∶64的範圍內時敏感性最高，但是如所期望的那樣，在更高的SBA-BR閾值滴度時敏感性降低。與血清群C的結果相比，血清群Y的特異性結果起始非常低，直到SBA-BR閾值滴度為1∶128時，特異性才達到高於50％的水平。對於血清群Y，敏感性和特異性達到最佳平衡的SBA-BR滴度位於1∶64和1∶256之間的範圍內。在1∶256時，敏感性降至大約55％，但是特異性從35％左右(mid-30％)升至大約82-83％。
表9對於血清群Y，在SBA-H保護滴度時
SBA-BR滴度的敏感性和特異性
對於血清群W135，敏感性數值與血清群C的敏感性數值更接近，但對於所有三種血清群而言總體模式相同。在SBA-BR閾值滴度為1∶8時敏感性以較高的數值開始，在滴度≥1∶128時敏感性降低。同樣，在SBA-BR閾值滴度為1∶8時特異性以較低數值開始，直到滴度為1∶256時才突破較低的水平。如對於血清群Y所觀察到的一樣，對於血清群W135，敏感性和特異性達到最佳平衡時的SBA-BR滴度範圍為1∶64和1∶256之間。
表10對於血清群W-135，在SBA-H保護滴度時
SBA-BR滴度的敏感性和特異性
表11總結了相對於免疫接種後SBA-BR滴度，血清群C、Y和W135的使用幼兔補體或人補體的SBA滴度升高4倍的比例。該分析分別在綴合疫苗接種組(TetraMenD)和多糖疫苗接種組(Menomune)中開展，並且兩組分析示於表11。當比較三個血清群和兩個疫苗接種組中所誘導的殺菌反應時，在四四升高模式中存在一些可觀察到的差異。對於每一血清群和兩個疫苗接種組，依次討論反應模式。
表11通過SBA-BR和SBA-H測定的腦膜炎球菌多糖
滴度升高4倍的分層比較比率1
1此表顯示為通過SBA-BR滴度、疫苗和血清群各層次進行的、如每一測定法中所測定(免疫接種前和免疫接種後28天的成對樣品)的SBA滴度升高4倍的比率(和百分比)。
對於血清群C，在綴合疫苗接種組中SBA-BR對SBA-H之間升高4倍的受試者比率密切一致。在此疫苗接種組內出現這樣一種趨勢，即在低的免疫接種後滴度如1∶32-1∶128時，SBA-H升高4倍的受試者比率滯後於的SBA-BR升高4倍的受試者比率。但是，當免疫接種後SBA-BR滴度≥1∶256時，通過SBA-H測定的達到升高4倍的受試者數量多於通過SBA-BR測定的達到升高4倍的受試者數量。通過比較，兩種補體源測定法間升高倍數的這種差異較小，並且可能是由於較高的免疫接種前SBA-BR滴度改變了達到SBA-BR升高4倍的比率。對於多糖疫苗接種組，SBA-BR對SBA-H之間的升高4倍的比率的一致性不如綴合疫苗接種組那樣相近。同樣，沒有明顯的趨勢顯示在較高的免疫接種後SBA-BR滴度時多糖疫苗接種組的SBA-H的4倍升高的比率比綴合疫苗接種組的更加敏感。
對於血清群Y，兩個疫苗接種組中SBA-H和SBA-BR的4倍升高比率之間一致性非常接近。與血清群C的免疫接種後SBA-BR滴度相比，兩個疫苗接種組中的免疫接種後SBA-BR滴度很少有低於1∶32的。因為該原因，與血清群C相比，對於血清群Y達到SBA-BR和SBA-H升高4倍的受試者比例出現在較高的免疫接種後SBA-BR滴度。對於血清群Y，在綴合疫苗接種組中當免疫接種後SBA-BR滴度為1∶128時，升高4倍的受試者比例增加至≥50％，然而對於血清群C，此時的綴合疫苗接種組的SBA-BR閾值滴度則是1∶32。
與其它兩種血清群相比，血清群W135的SBA-H和SBA-BR升高4倍的比率之間的一致性不是很接近。如對於血清群Y中所觀察的一樣，在兩個疫苗接種組中只有有限數量的受試者其免疫接種後SBA-BR滴度小於1∶32。在SBA-BR滴度≥1∶256時，SBA滴度中升高4倍的比率之間(BR對H)是一致的。如與在血清群C中所提到的一樣，兩個疫苗接種組之間的升高4倍(BR對H)的比例存在差異，這種差異對於血清群Y是不明顯的。與其它兩種血清群多糖疫苗接種組中SBA滴度升高4倍的比率相比，多糖疫苗接種組中血清群W135的SBA滴度(BR對H)中升高4倍的比率間的一致性是最差的。
為了測定用許可的四價腦膜炎球菌多糖疫苗(Menomune)或者用試驗的四價腦膜炎球菌多糖綴合疫苗(TetraMenD)接種的2-3歲受試者中血清樣品的滴度，將使用幼兔補體的血清殺菌力試驗(SBA-BR)與相應的使用人補體的血清殺菌力試驗(SBA-H)相比較。用於血清群C、Y和W135的補體源是經鑑定的並且用於支持該種SBA比較。使用2種方法分析了來自該比較研究中的SBA結果。在一種方法中，通過測定兩個疫苗接種組的免疫接種前和免疫接種後滴度得到SBA-BR和SBA-H數據，並將數據混合用於分析。在第二種方法中，對來自兩個疫苗接種組的免疫接種前和免疫接種後滴度分別進行分析。該分析的目標之一是描述與陰性SBA-H血清滴度具有最佳相關性的SBA-BR血清滴度。第二個目標是確定與使用人補體試驗中測定的與對血清群C有保護作用相關聯的陽性滴度具有最佳相關性的使用幼兔補體所測定的滴度，並推斷出對於血清群Y和W135的保護性殺菌滴度。我們實驗室已經公布了嘗試建立針對血清群C的SBA-BR相關聯的保護性閾值的結果。本研究的結果將與那些公布的結果相比較。最近，對使用兩種補體源所測定的免疫接種前和免疫接種後血清SBA滴度升高4倍的比率進行了比較。
僅僅針對血清群C建立了SBA滴度與抵抗疾病的保護作用之間的關聯。對於血清群C，與保護作用關聯的SBA是在使用人補體的SBA測定中確定的。對於其它血清群，假設與血清群C中保護作用關聯的SBA-H(SBA滴度為1∶4)同樣適用。對與血清群C的1∶4的SBA滴度相關聯的SBA-BR滴度的定義在血清群間是不同的。在定義與陰性SBA-H血清滴度最佳關聯的SBA-BR方面，將免疫接種前和免疫接種後血清中＜1∶8的SBA-BR滴度比作＜1∶4的SBA-H滴度。所使用的＜1∶8的SBA-BR滴度是部分地基於WHO/CDC關於血清群C SBA滴度(BR對H)的比較研究結果以及最新發現，即＜1∶4的SBA-BR滴度與爆發於英國大學的血清群C疾病的易感性相關(Jones，G.R.等人，2000.J.Infect.Dis.1811172-1175)。
根據本研究得到的SBA滴度(BR對H)，對於血清群C使用＜1∶8的SBA-BR截斷滴度的假陽性率為30％。使用較高的SBA-BR截斷滴度可以改善假陽性率，如下在≥1∶16時假陽性率降至26％；在≥1∶32時假陽性率降至24％，在≥1∶64時假陽性率降至22％，在≥1∶128時假陽性率降至18％，在≥1∶256時假陽性率降至14％，並且在≥1∶512時假陽性率降至2％。升高SBA-BR截斷滴度的確改善了對對應於＜1∶4的SBA-H滴度的陰性滴度定義的準確性，但是當使用較高的SBA-BR截斷滴度時，區分陽性反應和陰性反應的敏感性則非常低。本報告資料顯示，當截斷滴度為1∶8、1∶16或1∶32時，SBA-BR的敏感性最高(81-84％)。SBA-BR滴度大於1∶32時，其敏感性降至80％以下。但是，當截斷滴度為1∶8、1∶16和1∶32時該測定法的特異性為最低，範圍在51-58％之間。在選擇與人補體測定的陰性滴度相關聯的截斷滴度時，要在敏感性、特異性和假陽性率之間取得平衡。指定1∶32作為SBA-BR截斷滴度將導致無謂地含棄真陽性應答反應者。該研究結果指出，≥1∶16的SBA-BR滴度可能是更合適的截斷滴度。根據WHO/CDC的研究分析(＜1∶8)和英國大學的爆發分析(＜1∶4)，認為在該滴度之上至少2倍稀釋的滴度是具有保護性的。
對於血清群W135和Y的測定法中保護性截斷滴度的確定來自這樣一種假設即它們的殺菌抗體保護作用與血清群C疾病的類似並且與對應於人補體測定中陰性滴度的殺菌滴度相似。對於血清群Y，使用＜1∶8的SBA-BR截斷滴度的假陽性率相當高，達到85％，而對於血清群C為30％。但是，和血清群C一樣，增加SBA-BR截斷滴度可以降低假陽性率。SBA-BR截斷滴度為1∶16時假陽性率降至84％，在1∶32時假陽性率是75％，在1∶64時假陽性率是61％，在1∶128時假陽性率是38％，在1∶256時假陽性率是13％，並且在1∶512時假陽性率是2％。即使血清群Y的假陽性率在開始時比血清群C高很多，但是當截斷滴度≥1∶128時，兩種血清群測定中的假陽性率就變得相當接近了。然而，如此高的截斷滴度，可能誇大了陽性反應的閾值滴度。根據敏感性和特異性分析，當SBA-BR截斷滴度為1∶8-1∶32時敏感性達到最大值，範圍為95-98％。但是，和血清群C一樣，在這些SBA-BR滴度時特異性相應地較低，範圍為11-18％。當SBA-BR滴度為次高(1∶64)時，敏感性從95％降至88％，但特異性急劇升至35％。在血清群Y測定中＜1∶64的截斷滴度與人補體測定中的陰性滴度最相當。
對於血清群W135，在＜1∶8的SBA-BR截斷滴度時假陽性率為33％，這與血清群C相似。就像在血清群C和Y中提到的一樣，在較高的SBA-BR截斷滴度時，假陽性率降至較低的水平。當SBA-BR截斷滴度為1∶16時假陽性率降至32％，在1∶32時假陽性率降至28％，在1∶64時假陽性率降至26％，在1∶128時假陽性率降至12％，在1∶256時假陽性率降至4％，且在1∶512時假陽性率降至0％。SBA-BR滴度範圍在1∶8-1∶64之間時敏感性最高(86％-81％)。如所預期，在此SBA-BR滴度範圍內，特異性最低(46％-52％)。即使血清群W135的假陽性率開始時比血清群Y低很多，但是與人補體測定的陰性滴度最相當的截斷滴度是＜1∶64。
對於三個血清群，已經確定了對應於人補體測定中陰性滴度的滴度，對超過這些水平的SBA-BR滴度進行了作為陽性反應的閾值滴度分析。對於血清群C，陽性反應的閾值滴度是≥1∶16，對於血清群Y，陽性反應的閾值滴度是≥1∶64，對於血清群W135，陽性反應的閾值滴度是≥1∶64。對於血清群C來說，≥1∶128的SBA-BR閾值滴度提供了良好的保證，即相對於1∶4或者1∶8的SBA-H滴度達到了保護性滴度並且保護性滴度與血清群C的1∶4的有效SBA-H滴度相關聯。此閾值滴度與WHO/CDC的有關血清群C的數據集合和Santos的數據集合非常相近。就象這兩種研究中提到的那樣，滴度≥1∶128高度預示著具有保護作用，但是SBA-BR滴度小於1∶128可能也具有保護性。對於WHO/CDC和Santos的數據集合，1∶8、1∶16、1∶32、1∶64的SBA-BR滴度被作為不確定滴度。因為文中作為對於血清群C的數據集合提到小於1∶16的SBA-BR滴度被視為陰性，則該分析中不確定滴度為1∶16-1∶64，而1∶16-1∶64的滴度恰恰是另外兩個研究所得到結果的一個子集。在所有的這些分析中，正是對SBA-BR滴度與二十世紀60年代所收集的天然保護性數據相關聯的SBA-H滴度(1∶4或1∶8)進行比較。
最近，人們已經努力將單價血清群C綴合物在英國的功效數據同SBA-BR滴度直接聯繫起來(Miller E，等人，2002，Vaccine 20S58-S67)。在此分析中，發現≥1∶8和≥1∶128的SBA-BR滴度與迄今收集的功效數據有很好的相關性，這些數據是從接種單一劑量單價血清群C綴合物的15-17歲受試者中得到的結果。但是，當Miller及其同事對幼兒組(12-30個月)進行同樣的分析時，他們發現≥1∶8的SBA-BR滴度與功效有很好的一致性，但是當SBA-BR滴度≥1∶128時沒有如此接近的一致性。Miller於2002年9月1-6日在挪威奧斯陸(Oslo)舉行的第13屆國際致病性奈瑟菌屬(Neisseria)大會上展示了另外的數據，其中在接種後一個月達到SBA-BR滴度≥1∶64的受試者的預測效能處於對於該年齡組的所觀察功效的95％置信區間之外。這些數據支持這樣一種觀點，即1∶8-1∶64不確定區域內的SBA-BR滴度有助於確保保護作用。根據該研究分析，1∶16-1∶64的SBA-BR滴度同樣也有助於確保對於血清群C的保護作用。
在血清群Y測定中，在1∶64的SBA-BR滴度時特異性僅為35％，但是當截斷滴度升高到1∶128和1∶256時，特異性分別升高至59％和84％。≥1∶256的閾值滴度很好地保證了人補體測定中1∶4和1∶8的保護性滴度。但是，對於血清群Y，在1∶128的閾值滴度時，敏感性和特異性達到了較好的平衡。與同SBA-H保護性滴度相關聯的血清群C的SBA-BR滴度1∶16-1∶64的相應範圍相比，血清群Y的SBA-BR滴度範圍1∶64-1∶128代表了滴度的不確定範圍。
在血清群W-135測定中，在1∶64的SBA-BR滴度時特異性為52％，但是當滴度升高到1∶128和1∶256時，特異性分別升高至64％和77％。和血清群Y一樣，≥1∶256的閾值滴度很好地保證了人補體測定中1∶4和1∶8的保護性滴度。與血清群Y一樣，當對於血清群W135，閾值滴度為1∶128時，敏感性和特異性達到了較好的平衡。與同本研究中SBA-H保護性滴度相關聯的血清群C的SBA-BR滴度1∶16-1∶64的範圍相比，血清群W-135的SBA-BR滴度範圍1∶64-1∶128代表了滴度的不確定範圍。
對於每一血清群計算了殺菌滴度中的4倍升高，並且使用兩種測定法按照疫苗接種組分別進行分析。應當指出，對於全部三種血清群在SBA滴度(BR和H)中的4倍升高通常在較高的免疫接種後SBA-BR滴度中檢測到。按照血清群和按照疫苗接種組分析，SBA滴度(BR對H)的4倍升高均不同。對於血清群C，在較低的免疫接種後SBA-BR滴度的情況下，使用人補體測定的升高4倍的受試者比率比使用幼兔補體測定的滴度升高4倍的受試者比率要低。然而，在較高的免疫接種後SBA-BR滴度的情況下，使用人補體測定的4倍升高的受試者比率比較高。該模式似乎表明，在低的免疫接種後SBA-BR滴度時，使用人補體的測定法的敏感性比使用幼兔補體的測定法的敏感性低，但在高的免疫接種後SBA-BR滴度時，情況相反，也就是說，使用人補體的測定法變得更加靈敏。當測定樣品來自多糖疫苗接種組時，這種模式不明顯。當使用人補體的測定法時，這些樣品中滴度升高4倍的受試者比率較低。儘管還無法解釋樣品類型間出現的這種結果，但這的確表明對於具有較低滴度殺菌活性的血清樣品，使用人補體的測定法缺乏敏感性。
對於血清群Y，使用兩種補體源進行比較後發現SBA滴度4倍升高的比率非常一致。與多糖疫苗接種組相比，綴合疫苗接種組中SBA滴度(BR和H)4倍升高的比率稍高，但是這種差異不如血清群C組中的大。
對於血清群W135，在兩個疫苗接種組的使用人補體或幼兔補體的SBA滴度升高4倍的比率的一致性不如其它兩種血清群好。在兩個疫苗接種組中SBA-BR滴度4倍升高的情況非常好，但是SBA-H滴度4倍升高的比率比其它兩種血清群低。在多糖疫苗接種組中SBA-H滴度4倍升高的受試者比率相當低，並且比其它兩種血清群SBA-H滴度4倍升高的比率都要低。
使用BR補體的SBA滴度4倍升高已經成為註冊腦膜炎球菌多糖疫苗的基準。最近，人們努力將SBA-BR滴度的4倍升高與臨床療效結合起來，此臨床療效是來自英國對單價血清群C綴合疫苗註冊後的監視資料(Borrow R，等人，2001，Infect.Immun.691568-1573)。根據本分析，單價血清群C綴合疫苗對於12-30個月的幼兒的功效在第一次劑量後的16個月內估計為88％(69-95％)。對於該年齡組，在單價血清群C綴合疫苗一次劑量之後，達到SBA-BR滴度4倍升高的受試者比例為89-100％。
文中提供的SBA-BR資料提供了殺菌滴度值，與使用人補體作為補體源測定法中對於血清群C所獲得的殺菌滴度值具有可比性。因此，這些SBA-BR滴度與最初的研究有關，最初的研究確定了對血清群C腦膜炎球菌疾病保護性免疫的替代物，並且這些SBA-BR滴度支持對文中提供的保護作用的臨床結果的外推，並且對於血清群C的SBA-BR滴度與其它實驗室報導的那些結果是可比的。通過與血清群C模型的類比，使用人補體的SBA在確定針對血清群Y和W-135莢膜多糖的血清群特異性反應中的表現支持用於確定殺菌滴度的SBA-BR與血清群Y和W-135具有關聯性。
權利要求
1.在病人體內增強腦膜炎球菌疫苗免疫原性的方法，由此在施用腦膜炎球菌疫苗的同時或者6個月內向病人施用包含白喉、破傷風、百日咳FHA、百日咳PT或PRP抗原的疫苗。
2.根據權利要求1所述的方法，其中腦膜炎球菌疫苗包含腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)血清型A、C、W-135或Y中的一種或一種以上的莢膜多糖。
3.根據權利要求2所述的方法，其中腦膜炎球菌疫苗包含腦膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W-135或Y中的兩種或兩種以上的莢膜多糖。
4.根據權利要求3所述的方法，其中腦膜炎球菌疫苗包含腦膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W-135或Y中的三種或三種以上的莢膜多糖。
5.根據權利要求4所述的方法，其中腦膜炎球菌疫苗包含腦膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W-135或Y莢膜多糖的每一種。
6.根據權利要求1所述的方法，其中在施用腦膜炎球菌疫苗的同時或者3個月內向病人施用包含白喉、破傷風、百日咳FHA、百日咳PT或PRP抗原的疫苗。
7.根據權利要求6所述的方法，其中在施用腦膜炎球菌疫苗的同時或者1個月內向病人施用包含白喉、破傷風、百日咳FHA、百日咳PT或PRP抗原的疫苗。
8.根據權利要求7所述的方法，其中在施用腦膜炎球菌疫苗的同時向病人施用包含白喉、破傷風、百日咳FHA、百日咳PT或PRP抗原的疫苗。
9.根據權利要求1所述的方法，其中在施用腦膜炎球菌疫苗的同時或者6個月內向病人施用包含白喉或破傷風抗原的疫苗。
10.根據權利要求1所述的方法，其中在施用腦膜炎球菌疫苗的同時或者3個月內向病人施用包含白喉或破傷風抗原的疫苗。
11.根據權利要求1所述的方法，其中在施用腦膜炎球菌疫苗的同時或者2周內向病人施用包含白喉或破傷風抗原的疫苗。
12.根據權利要求1所述的方法，其中腦膜炎球菌疫苗是多糖-蛋白質綴合物，其中多糖是腦膜炎奈瑟氏球菌多糖血清型A、C、W-135或Y並且蛋白質是載體蛋白質。
13.根據權利要求12所述的方法，其中腦膜炎球菌疫苗包含腦膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W-135或Y中的兩種或兩種以上的莢膜多糖。
14.根據權利要求13所述的方法，其中腦膜炎球菌疫苗包含腦膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W-135或Y中的三種或三種以上的莢膜多糖。
15.根據權利要求14所述的方法，其中腦膜炎球菌疫苗包含腦膜炎奈瑟氏球菌血清型A、C、W-135或Y莢膜多糖的每一種。
16.根據權利要求12-15中任意一項所述的方法，其中載體蛋白質包含細菌毒素或類毒素或者細菌外膜蛋白。
17.根據權利要求12-15中任意一項所述的方法，其中載體蛋白質包含白喉毒素、白喉類毒素、CRM197、破傷風類毒素、百日咳類毒素、大腸桿菌(E.coli)LT、大腸桿菌ST、外毒素A、外膜複合物c(OMPC)、孔蛋白、運鐵蛋白結合蛋白、肺炎鏈球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌粘附素蛋白質(PsaA)、卵清蛋白、鑰孔血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或結核菌素純化蛋白衍生物(PPD)。
18.根據權利要求12-15中任意一項所述的方法，其中載體蛋白質包含白喉毒素、白喉類毒素、CRM197、破傷風類毒素、外毒素A或外膜複合物c(OMPC)。
19.根據權利要求12-15中任意一項所述的方法，其中載體蛋白質包含白喉毒素、白喉類毒素或CRM197。
20.根據權利要求12-15中任意一項所述的方法，其中載體蛋白質包含白喉毒素或白喉類毒素。
21.根據權利要求1所述的方法，其中腦膜炎球菌疫苗在每毫升液體中包含大約0.5μg至大約15μg的血清型A、C、W-135或Y的腦膜炎奈瑟氏球菌多糖。
22.根據權利要求21所述的方法，其中腦膜炎球菌疫苗在每毫升液體中包含大約0.5μg至大約15μg的血清型W-135或Y的腦膜炎奈瑟氏球菌多糖。
23.根據權利要求21所述的組合物，其中載體蛋白質是白喉毒素或類毒素。
24.根據權利要求1所述的組合物，其中還包含佐劑。
25.根據權利要求24所述的組合物，其中佐劑包含氫氧化鋁、磷酸鋁或它們的組合。
26.根據權利要求24所述的組合物，其中組合物包含磷酸鈉、氯化鈉或它們的組合。
27.根據權利要求1所述的組合物，其中莢膜多糖選自A和W-135；Y和W-135；C和Y；C和W-135；A、C和Y；A、C和W-135；C、Y和W-135；A、Y和W-135以及A、C、Y和W-135。
28.根據權利要求57-60中任意一項所述的方法，其中疫苗組合物不包含佐劑。
29.通過施用包含根據權利要求1所述綴合物的疫苗組合物對病人進行抗腦膜炎奈瑟氏球菌免疫接種的方法，由此與施用前血清GMT或IgG滴度相比在接種疫苗28天內病人的血清GMT或IgG滴度升高4倍或更多。
30.通過施用包含根據權利要求1所述綴合物的疫苗組合物對病人進行抗腦膜炎奈瑟氏球菌免疫接種的方法，由此與施用前SBA-BR滴度相比在接種疫苗20-40天內病人的血清SBA-BR滴度為1∶32或更高。
31.通過施用包含根據權利要求1所述綴合物的疫苗組合物對病人進行抗腦膜炎奈瑟氏球菌免疫接種的方法，由此與施用前SBA-BR滴度相比在接種疫苗20-40天內病人的血清SBA-BR滴度為1∶64或更高。
32.通過施用包含根據權利要求1所述綴合物的疫苗組合物對病人進行抗腦膜炎奈瑟氏球菌免疫接種的方法，由此與施用前SBA-BR滴度相比在接種疫苗20-40天內病人的血清SBA-BR滴度為1∶128或更高。
全文摘要
本發明是增強抗腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)血清型A、C、W－135和Y免疫原性的方法。
文檔編號A61K39/385GK1819843SQ20048001930
公開日2006年8月16日 申請日期2004年5月7日 優先權日2003年5月7日
發明者R·P·賴亞爾 申請人:安萬特巴斯德公司