複合菌種降解煤泥水中殘留聚丙烯醯胺的方法與流程
2023-10-23 23:04:27 2
本發明涉及一種複合菌種降解煤泥水中殘留聚丙烯醯胺的方法
背景技術：
煤泥水是煤炭洗選加工過程中產生的一種選煤廢水。目前，煤泥水處理主要採用添加有機高分子絮凝劑和無機絮凝劑來加速煤泥顆粒的絮凝沉降。有機高分子絮凝劑中的聚丙烯醯胺由於具有長分子鏈且側鏈上帶有大量的活性基團被廣泛用來提高煤泥水的絮凝率。但聚丙烯醯胺的大量使用也會帶來一些負面作用：一方面，殘留聚丙烯醯胺聚集在選煤廠循環水中，在加入浮選藥劑前就有部分聚丙烯醯胺吸附在煤泥顆粒上，致使浮選藥劑的吸附能力下降；另一方面，含聚丙烯醯胺的循環水由於得不到及時有效治理而被大量外排，會造成對環境的汙染。因此，對選煤廠煤泥水中殘留聚丙烯醯胺的有效處理具有十分重要的現實意義。
目前，採用複合菌種生物降解法，降解處理煤泥水中殘留聚丙烯醯胺的研究未見報導。由於煤泥水中殘留的聚丙烯醯胺對溼法選煤工藝系統會產生不利影響，含聚廢水外排又會對環境造成一定的危害，因此煤泥水中的殘留聚丙烯醯胺的降解問題正逐漸引起人們的關注。微生物降解法能有效地處理各種難降解汙染物，由於其技術成熟、無二次汙染、運行費用低廉，在環境汙染物處理方面起著重要的作用。微生物降解法將會成為無害化處理煤泥中殘留聚丙烯醯胺的有效手段。
技術實現要素：
本發明要解決的技術問題是提供一種複合菌種降解煤泥水中殘留聚丙烯醯胺的方法，其優點在於：聚丙烯醯胺的降解效果良好，彌補單菌種降解的不足，能充分發揮不同菌種之間的協同作用，降低了各因素對降解效果的限制,增強了降解適應性。
本發明中所用生物材料來源如下：黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)，編號：BKMF-1767，購自廣東省微生物研究所菌種保藏中心；球紅假單胞菌(Rhodopseudomonas sphaeroides),取自中國礦業大學化工學院實驗室的保藏菌種，密封保存於冰箱中。
其中黃孢原毛平革菌的培養條件為：在160rpm，30℃的培養基條件下培養2-4d；球紅假單胞菌的培養條件為：在120rpm，30℃的培養基條件下培養2-4d。
權利要求
1、複合菌種降解煤泥水中殘留聚丙烯醯胺的方法，其特徵是：將球紅假單胞菌菌懸液和黃孢原毛平革菌孢子懸液作為複合降解菌懸液，在一定的聚丙烯醯胺濃度下,將球紅假單胞菌菌懸液和黃孢原毛平革菌孢子懸液按1:X的體積比加入到降解培養基中，調製含聚丙烯醯胺的降解培養基PH至5～7、培養溫度25～50℃等條件下，通過生物降解作用對聚丙烯醯胺進行降解。
2、根據權利要求1所述的複合菌種降解煤泥水中殘留聚丙烯醯胺的方法，其特徵在於：球紅假單胞菌和黃孢原毛平革菌的活化及馴化包括以下步驟：
1)球紅假單胞菌：a、活化培養：從冰箱中取出甘油保存的菌种放置一段時間，用無菌吸管吸取0.3～0.5ml的液體菌種，轉到液體基礎培養基中，培養一段時間後再轉接一次，即可得到復活的球紅假單胞菌；b、馴化培養：在150ml的錐形瓶中加入滅菌的50ml的基礎培養基和20ml含聚丙烯醯胺的滅菌的濃縮池溢流液，然後將活化的0.5ml菌接入錐形瓶中，在搖床中震蕩培養。培養兩天後倒出20ml的上清液，再加入20ml含聚丙烯醯胺的滅菌的濃縮池溢流液，往後每24h倒出20ml的上清液，再加入20ml含聚丙烯醯胺的滅菌的濃縮池溢流液，持續5天。再將菌液按2％的比例接入到250ml的錐形瓶中(含50ml基礎培養基和150ml含聚丙烯醯胺的滅菌的濃縮池溢流液)，3d後每24h倒出50ml的上清液，再加入50ml含聚丙烯醯胺的滅菌的濃縮池溢流液，此過程持續7d,待菌液變渾濁。取馴化液體培養基中的菌接種到相應的固體培養基上，待在恆溫培養箱中長出完好的菌落或成熟的孢子，挑取形態較好的菌落或孢子接種到斜面培養基上進行保藏；
所述球紅假單胞菌基礎培養基配方為：NH4CL 1g、K2HPO4 0.2g、NaCL 0.5g、NaHCO31g、CH3COONa 2g、酵母膏1g、MnCL2·4H2O 0.3g、微量元素5ml、瓊脂20g、1000ml去離子水、PH＝7，其中微量元素配方為：CuSO4·5H2O 0.4g、ZnSO4·7H2O 0.6g、MgCL2 2g；所述液體培養基配方為：同固體培養基配方，不加入瓊脂；
2)黃孢原毛平革菌：a、活化培養：取在冰箱中斜面保藏的黃孢原毛平革菌，在無菌操作臺上挑取斜面培養基上的孢子接種到新鮮的黃孢原毛平革菌固體培養基上，挑取成熟的孢子再接種到固體培養基上，等長出成熟的孢子作為活化的菌種使用，並置於冰箱中保藏；b、馴化培養：在150ml的錐形瓶中加入滅菌的50ml的基礎培養基和20ml含聚丙烯醯胺的滅菌的濃縮池溢流液，然後將活化的0.5ml菌接入錐形瓶中，在搖床中震蕩培養。培養兩天後倒出20ml的上清液，再加入20ml含聚丙烯醯胺的滅菌的濃縮池溢流液，往後每24h倒出20ml的上清液，再加入20ml含聚丙烯醯胺的滅菌的濃縮池溢流液，持續5天。再將菌液按2％的比例接入到250ml的錐形瓶中(含50ml基礎培養基和150ml含聚丙烯醯胺的滅菌的濃縮池溢流液)，3d後每24h倒出50ml的上清液，再加入50ml含聚丙烯醯胺的滅菌的濃縮池溢流液，此過程持續7d,待菌液變渾濁。取馴化液體培養基中的菌接種到相應的固體培養基上，待在恆溫培養箱中長出完好的菌落或成熟的孢子，挑取形態較好的菌落或孢子接種到斜面培養基上進行保藏；
所述黃孢原毛平革菌基礎培養基配方為：馬鈴薯澱粉20g，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O 1.5g，瓊脂20g，去離子水1000mL，維生素B18mg，PH＝6，其中微量元素配方為：CuSO4·5H2O 0.4g、ZnSO4·7H2O 0.6g、MnCL2·4H2O 0.5g；所述液體培養基配方為：同固體培養基配方，不加入瓊脂。
3、根據權利要求2所述的複合菌種降解煤泥水中殘留聚丙烯醯胺的方法，其特徵在於：球紅假單胞菌和黃孢原毛平革菌馴化培養步驟的條件為：在120rpm，30℃的條件下培養。
4、根據權利要求3所述的複合菌種降解煤泥水中殘留聚丙烯醯胺的方法，其特徵在於：球紅假單胞菌菌懸液和黃孢原毛平革菌孢子懸液分別通過以下步驟製備得到：
1)球紅假單胞菌：接種馴化後的球紅假單胞菌到液體培養基中，置於溫度30℃、轉速120rpm的搖床中震蕩培養40h；再取適量發酵培養液於低速離心機上4000轉離心10min，倒出上清液，用無菌生理鹽水衝洗底部的細菌，採用血球計數器計數，最後配製成109/ml的菌懸液，4℃冰箱保存備用。
2)黃孢原毛平革菌：在30℃培養5d的黃孢原毛平革菌固體培養基上加入10mL的無菌生理鹽水，並用灼燒的接種環刮下一定量的孢子置於盛有玻璃珠的三角瓶。然後，放置30℃200r/min的搖床充分振蕩5h。最後，通過採用血球計數器計數配製成107/ml的孢子懸液，4℃冰箱保存備用。
5、複合菌種降解煤泥水中殘留聚丙烯醯胺的方法，其特徵在於包括以下步驟：
1)在降解培養基中加入體積比為1:X球紅假單胞菌菌懸液和黃孢原毛平革菌孢子懸液，攪拌均勻，其中：球紅假單胞菌菌懸液和黃孢原毛平革菌孢子懸液按(1～5)％的比例加入降解培養基中；
2)調製含聚丙烯醯胺的降解培養基PH至4～9、培養溫度25～50℃、搖床轉速70～170r/min。
6、根據權利要求5所述的複合菌種降解煤泥水中殘留聚丙烯醯胺的方法，其特徵在於：所述的複合菌降解試驗中基礎培養基：馬鈴薯澱粉20g，葡萄糖20g，KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O 1.5g，瓊脂20g，去離子水1000mL，維生素B1 8mg，PH＝6；液體培養基：同上不加入瓊脂；降解培養基：葡萄糖2g、酒石酸銨0.2g、MgSO4 1g、KH2PO4 3g、維生素B1 8mg，微量元素10ml、去離子水1000mL、Ph＝6，其中微量元素：CuSO4·5H2O 0.4g、ZnSO4·7H2O 0.6g、MnCL2·4H2O 0.5g。
7、根據權利要求5所述的複合菌種降解煤泥水中殘留聚丙烯醯胺的方法，其特徵在於：選擇混合菌的接種量分別為(2～4)％。
8、根據權利要求7所述的複合菌種降解煤泥水中殘留聚丙烯醯胺的方法，其特徵在於：所述調節含聚丙烯醯胺的降解培養基PH至5～7。
9、根據權利要求8所述的複合菌種降解煤泥水中殘留聚丙烯醯胺的方法，其特徵在於：所述調節含聚丙烯醯胺的降解培養基溫度至30～35℃。
10、根據權利要求9所述的複合菌種降解煤泥水中殘留聚丙烯醯胺的方法，其特徵在於：所述調節降解試驗搖床轉速130～150r/min。
本發明不同於現有技術之處在於：目前選煤廠中含聚丙烯醯胺的煤泥水對整個工藝的影響已經逐漸引起選煤工作者的注意，但是對選煤廠煤泥水中聚丙烯醯胺採用複合菌種生物降解的研究鮮有報導。本發明是從對聚丙烯醯胺有較好降解效果的菌株中挑選出黃孢原毛平革菌和球紅假單胞菌進行研究，首先是利用含有聚丙烯醯胺殘留的選煤循環水對所選菌株進行誘導馴化，然後將兩種不同的菌株複合對聚丙烯醯胺進行降解試驗。本發明解決的技術問題是提供了一種降解煤泥水中殘留聚丙烯醯胺的複合菌種和使用該複合菌種降解煤泥水中殘留聚丙烯醯胺的方法，其優點在於降解效果良好，彌補了單菌種不足，能充分發揮菌株間的協同作用，降低了各因素對降解效果的限制，增強了降解適應性。
下面結合附圖對本發明做進一步說明。
附圖說明
圖1球紅假單胞菌和黃孢原毛平革菌複合菌與單一菌種降解煤泥水中殘留聚丙烯醯胺的降解率對比。其中■表示球紅假單胞菌和黃孢原毛平革菌複合菌；△表示球紅假單胞菌；◇表示黃孢原毛平革菌；橫坐標表示應用實例，縱坐標表示降解率(％)。
具體實施方式
煤泥水中殘留聚丙烯醯胺的降解效果以聚丙烯醯胺的降解率來衡量，降解率越高，降解效果越好。通過測試生物降解前後聚丙烯醯胺濃度的變化，即可表示出聚丙烯醯胺的降解率η。
式中：C0為生物降解前聚丙烯醯胺質量濃度，mg/L；
Ct為生物降解後聚丙烯醯胺質量濃度，mg/L。
以下實例中所用降解培養基為含有聚丙烯醯胺的選煤廠濃縮池溢流液為基礎的培養基。濃縮池溢流液取自淮南礦業集團望峰崗選煤廠，為煤泥水經過聚丙烯醯胺處理過的溢流液，在實驗室中過濾後使用。
實例1
1)取含100ml降解培養基的錐形瓶，其中聚丙烯醯胺的濃度為100mg/L，將2％的黃孢原毛平革菌孢子懸液和2％的球紅假單胞菌菌懸液一同加入到降解培養基中；
2)用筆型pH計調節培養基的pH值為5，放置於30℃、130r/min的震蕩培養箱中連續培養6天；
3)培養期間每天用UV-5100紫外分光光度計於660nm處測定降解培養基的吸光度，與標準進行比較便可得到相應的聚合物的濃度，得到降解率為32.5％。在其他條件不變的情況下，將聚丙烯醯胺生物降解菌換成2ml球紅假單胞菌菌懸液，降解率為21.9％，將聚丙烯醯胺生物降解菌換成2ml換成黃孢原毛平革菌孢子懸液，降解率為31.5％。
實例2
1)取含100ml降解培養基的錐形瓶，其中聚丙烯醯胺的濃度為100mg/L，將3％的黃孢原毛平革菌孢子懸液和3％的球紅假單胞菌菌懸液一同加入到降解培養基中；
2)用筆型pH計調節培養基的pH值為6，放置於30℃、140r/min的震蕩培養箱中連續培養6天；
3)培養期間每天用UV-5100紫外分光光度計於660nm處測定降解培養基的吸光度，與標準進行比較便可得到相應的聚合物的濃度，得到降解率為34.7％。在其他條件不變的情況下，將聚丙烯醯胺生物降解菌換成3ml球紅假單胞菌菌懸液，降解率為23.2％，將聚丙烯醯胺生物降解菌換成3ml換成黃孢原毛平革菌孢子懸液，降解率為32.2％。
實例3
1)取含100ml降解培養基的錐形瓶，其中聚丙烯醯胺的濃度為100mg/L，將4％的黃孢原毛平革菌孢子懸液和4％的球紅假單胞菌菌懸液一同加入到降解培養基中；
2)用筆型pH計調節培養基的pH值為7，放置於30℃、150r/min的震蕩培養箱中連續培養6天；
3)培養期間每天用UV-5100紫外分光光度計於660nm處測定降解培養基的吸光度，與標準進行比較便可得到相應的聚合物的濃度，得到降解率為33.4％。在其他條件不變的情況下，將聚丙烯醯胺生物降解菌換成4ml球紅假單胞菌菌懸液，降解率為22.9％，將聚丙烯醯胺生物降解菌換成4ml換成黃孢原毛平革菌孢子懸液，降解率為31.4％。
實例4
1)取含100ml降解培養基的錐形瓶，其中聚丙烯醯胺的濃度為100mg/L，將3％的黃孢原毛平革菌孢子懸液和3％的球紅假單胞菌菌懸液一同加入到降解培養基中；
2)用筆型pH計調節培養基的pH值為5，放置於35℃、150r/min的震蕩培養箱中連續培養6天；
3)培養期間每天用UV-5100紫外分光光度計於660nm處測定降解培養基的吸光度，與標準進行比較便可得到相應的聚合物的濃度，得到降解率為34.8％。在其他條件不變的情況下，將聚丙烯醯胺生物降解菌換成3ml球紅假單胞菌菌懸液，降解率為26.5％，將聚丙烯醯胺生物降解菌換成3ml換成黃孢原毛平革菌孢子懸液，降解率為33.9％。
實例5
1)取含100ml降解培養基的錐形瓶，其中聚丙烯醯胺的濃度為100mg/L，將4％的黃孢原毛平革菌孢子懸液和4％的球紅假單胞菌菌懸液一同加入到降解培養基中；
2)用筆型pH計調節培養基的pH值為6，放置於35℃、130r/min的震蕩培養箱中連續培養6天；
3)培養期間每天用UV-5100紫外分光光度計於660nm處測定降解培養基的吸光度，與標準進行比較便可得到相應的聚合物的濃度，得到降解率為35.5％。在其他條件不變的情況下，將聚丙烯醯胺生物降解菌換成4ml球紅假單胞菌菌懸液，降解率為25.7％，將聚丙烯醯胺生物降解菌換成4ml換成黃孢原毛平革菌孢子懸液，降解率為34.7％。
實例6
1)取含100ml降解培養基的錐形瓶，其中聚丙烯醯胺的濃度為100mg/L，將2％的黃孢原毛平革菌孢子懸液和2％的球紅假單胞菌菌懸液一同加入到降解培養基中；
2)用筆型pH計調節培養基的pH值為7，放置於35℃、140r/min的震蕩培養箱中連續培養6天；
3)培養期間每天用UV-5100紫外分光光度計於660nm處測定降解培養基的吸光度，與標準進行比較便可得到相應的聚合物的濃度，得到降解率為36.5％。在其他條件不變的情況下，將聚丙烯醯胺生物降解菌換成2ml球紅假單胞菌菌懸液，降解率為24.8％，將聚丙烯醯胺生物降解菌換成2ml換成黃孢原毛平革菌孢子懸液，降解率為33.2％。
實例7
1)取含100ml降解培養基的錐形瓶，其中聚丙烯醯胺的濃度為100mg/L，將4％的黃孢原毛平革菌孢子懸液和4％的球紅假單胞菌菌懸液一同加入到降解培養基中；
2)用筆型pH計調節培養基的pH值為5，放置於40℃、140r/min的震蕩培養箱中連續培養6天；
3)培養期間每天用UV-5100紫外分光光度計於660nm處測定降解培養基的吸光度，與標準進行比較便可得到相應的聚合物的濃度，得到降解率為31.2％。在其他條件不變的情況下，將聚丙烯醯胺生物降解菌換成4ml球紅假單胞菌菌懸液，降解率為21.7％，將聚丙烯醯胺生物降解菌換成4ml換成黃孢原毛平革菌孢子懸液，降解率為30.5％。
實例8
1)取含100ml降解培養基的錐形瓶，其中聚丙烯醯胺的濃度為100mg/L，將2％的黃孢原毛平革菌孢子懸液和2％的球紅假單胞菌菌懸液一同加入到降解培養基中；
2)用筆型pH計調節培養基的pH值為6，放置於40℃、150r/min的震蕩培養箱中連續培養6天；
3)培養期間每天用UV-5100紫外分光光度計於660nm處測定降解培養基的吸光度，與標準進行比較便可得到相應的聚合物的濃度，得到降解率為33.8％。在其他條件不變的情況下，將聚丙烯醯胺生物降解菌換成2ml球紅假單胞菌菌懸液，降解率為22.9％，將聚丙烯醯胺生物降解菌換成2ml換成黃孢原毛平革菌孢子懸液，降解率為32.5％。
實例9
1)取含100ml降解培養基的錐形瓶，其中聚丙烯醯胺的濃度為100mg/L，將3％的黃孢原毛平革菌孢子懸液和3％的球紅假單胞菌菌懸液一同加入到降解培養基中；
2)用筆型pH計調節培養基的pH值為7，放置於40℃、130r/min的震蕩培養箱中連續培養6天；
3)培養期間每天用UV-5100紫外分光光度計於660nm處測定降解培養基的吸光度，與標準進行比較便可得到相應的聚合物的濃度，得到降解率為32.4％。在其他條件不變的情況下，將聚丙烯醯胺生物降解菌換成3ml球紅假單胞菌菌懸液，降解率為22.3％，將聚丙烯醯胺生物降解菌換成3ml換成黃孢原毛平革菌孢子懸液，降解率為31.2％。
本發明所述聚丙烯醯胺降解複合菌種是將球紅假單胞菌菌懸液與黃孢原毛平革菌孢子懸液按1:X的體積比混合，並對煤泥水中殘留聚丙烯醯胺進行降解試驗。從實例1-9來看，複合菌種降解煤泥水中殘留聚丙烯醯胺平均降解率為33.87％；球紅假單胞菌單一菌種降解煤泥水中殘留聚丙烯醯胺，平均降解為23.54％；黃孢原毛平革菌單一菌種降解煤泥水中殘留聚丙烯醯胺，平均降解率為32.34％。從上述實施例可以看出，複合菌種的降解效果要優於單一菌種。球紅假單胞菌和黃孢原毛平革菌協同作用一方面提高了降解率，另一方面降低了其它因素對降解效果的限制和影響，降解的適應性更強。
以上所述的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，並非對本發明的範圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通技術人員對本發明的技術方案作出的各種變形和改進，均應落入本發明權利要求書確定的保護範圍內。