蛋白酶的製作方法

2023-10-31 07:11:27

專利名稱：蛋白酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及具有蛋白酶活性的與擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)蛋白酶同源的分離多肽，還涉及編碼該多肽的分離的核酸序列。此外，本發明涉及核酸構建體，載體，以及包含這些核酸序列的包括轉基因植物和非人動物的宿主細胞，還涉及生產及使用此蛋白酶的方法，尤其在動物飼料中。
本發明的蛋白酶具有高度的特異活性。公開了與蛋白酶的高特異活性有關的特有結構特徵，該蛋白酶屬於肽酶家族S2A或S1E。
背景技術：
WO88/03947中公開了源於擬諾卡氏菌(Nocardiopsis sp.)NRRL 18262和達松維爾擬諾卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)NRRL 18133的蛋白酶。DK申請no.1996 00013中公開了源於擬諾卡氏菌NRRL 18262的蛋白酶的DNA和胺基酸序列。WO 01/58276公開了與源於擬諾卡氏菌NRRL 18262的蛋白酶有關的酸穩定性蛋白酶，以及源於Nocardiopsis alba DSM 14010的蛋白酶在動物飼料中的應用。然而，這些蛋白酶具有低的特異活性。
JP 2-255081-A公開了源於擬諾卡氏菌株系OPC-210(FERM P-10508)的蛋白酶，但沒有序列信息。該株系(strain)已不能獲得，因為其保藏已撤消。
DD20043218公開了源於Nocardiopsis dassonvillei株系ZIMET 43647的蛋白水解製劑，然而沒有序列信息。該株系看起來已無法獲得。
公布於本發明首次申請日之後的JP 2003284571-A公開了源於擬諾卡氏菌TOA-1(FERM P-18676)的蛋白酶的胺基酸序列和相應的DNA序列。該序列已登錄到GENESEQP，條目號為no.ADF43564。
最為同源的已有非擬諾卡氏菌蛋白酶是SapII_Streptomyces_sp_sptrembl_q55353，其成熟部分與SEQ ID NO2和6的成熟部分分別具有61.5％和63.5％的胺基酸同一性。相應的DNA與SEQ ID NO1和5分別具有70.3％和72.7％的同一性。相關的鏈黴菌(Streptomyces)蛋白酶的成熟部分即SapII_Streptomyces_sp_sptrembl_q55352與SEQ ID NO1的成熟部分具有稍高的同一性百分率，即70.8％。
本發明的目的是提供具有高特異活性的與擬諾卡氏菌蛋白酶同源的蛋白酶，尤其是具有用於動物飼料和/或洗滌劑潛力的蛋白酶。
發明概述已分離並鑑定了具有高特異活性的蛋白酶，即源於Nocardiopsis albaDSM 15647(見SEQ ID NO1和2)的蛋白酶，和源於Nocardiopsisdassonvillei subsp.dassonvillei DSM 43235(見SEQ ID NO5和6)的蛋白酶。
第一個方面，本發明涉及具有蛋白酶活性的分離的多肽，且在pH7.5和25℃下具有至少39AU/g的針對血紅蛋白的特異活性，其中多肽選自下組(a)具有與SEQ ID NO2的1至188位胺基酸，和/或SEQ ID NO6的1-192位胺基酸具有至少65％同一性的胺基酸序列的多肽；(b)由在低嚴謹條件下與SEQ ID NO1的502-1065位核苷，和/或SEQ ID NO5的568-1143位核苷酸雜交的核酸序列所編碼的多肽；(c)由與SEQ ID NO1的502-1065位核苷，和/或SEQ ID NO5的568-1143位核苷具有至少74％同一性的核酸序列所編碼的多肽。本發明還涉及編碼這樣的蛋白酶的分離的核酸序列；核酸構建體，載體，和包含此核酸序列的宿主細胞；還涉及生產此蛋白酶的方法，以及在尤其是動物飼料方面使用此蛋白酶。
第二個方面，本發明涉及A.肽酶家族S2A和/或肽酶家族S1E具有蛋白酶活性的分離的多肽，且在指定位置具有包含至少一個下述胺基酸的胺基酸序列25S，38T，42P，44S，49Q，54R，62S，89S，91S，92S，95A，99Q，100I，114V，120T，125Q，129Q，131L，135N，147F，151S，165S，166F，171Y，176N，179L，180S，184L，和/或185T；優選25S，38T，42P，44S，54R，62S，125Q，131L，165S，171Y，176N，179L，180S，184L，和/或185T；更優選同時具有至少一個24A，51V，53E，86A，87T，96I，和/或186L；和/或同時具有(H35+D61+S143)；其中每個位置對應於SEQ IDNO2的位置。
B.包含在指定位置具有至少一個下述胺基酸的A所述的多肽38T，92S，120T，125Q，131L，135N，147F，151S，165S，和/或171Y。
C.包含在指定位置具有至少一個下述胺基酸的A所述的多肽25S，42P，44S，49Q，54R，62S，89S，91S，95A，99Q，100I，114V，129Q，166F，176N，179L，180S，184L，和/或185T。
D.A、B、或C中任何一個多肽，其具有用DSC在10mM磷酸鈉、50mM氯化鈉、pH7.0測定時至少78℃的Tm；在pH9及80℃時至少0.40的相對活性；和/或在pH7.5及25℃時對血紅蛋白至少39AU/g的特異活性。
E.A、B、C或D中任何一個多肽，其與SEQ ID NO2的-167至188位胺基酸，優選1至188位胺基酸，和/或SEQ ID NO6的-160至192位胺基酸，優選1-192位胺基酸具有至少65％的同一性百分數，更優選與SEQ IDNO2的1-188位胺基酸，或-167(167)至188位胺基酸具有至少50％的同一性百分數。
F.A、B、C、D或E中任何一個多肽，其是i)細菌蛋白酶；ii)放線菌(Actinobacteria)門的蛋白酶；iii)放線菌綱的(the class Actinobacteria)；iv)放線菌(Actinomycetales)目的；v)擬諾卡氏菌科(Nocardiopsaceae)的；vi)擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)的；和/或源於vii)擬諾卡氏菌種如Nocardiopsisalba，南極擬諾卡氏菌(Nocardiopsis antarctica)，Nocardiopsis prasina，Nocardiopsis composta，Nocardiopsis exhalans，Nocardiopsis halophila，Nocardiopsis halotolerans、Nocardiopsis kunsanensis、Nocardiopsis listeri、Nocardiopsis lucentensis、Nocardiopsis metallicus、Nocardiopsissynnemataformans、Nocardiopsis trehalosi，熱帶擬諾卡氏菌(Nocardiopsistropica)、Nocardiopis umidischolae、新疆擬諾卡氏菌(Nocardiopsisxinjiangensis)、或Nocardiopsis dassonvillei；和任選地也源於Nocardiopsisalkaliphila，例如源於Nocardiopsis alba的蛋白酶，例如，Nocardiopsis albaDSM 15647、或源於Nocardiopsis dassonvillei的蛋白酶、例如Nocardiopsisdassonvillei subsp.dassonvillei DSM 43235，例如具有SEQ ID NO2的-167至188，優選1-188位胺基酸序列的多肽，和/或具有SEQ ID NO6的-160至192，優選1-192位胺基酸序列的多肽。
G.包含編碼A、B、C、D、E或F中任何一個多肽的核酸序列的分離的核酸序列。
H.包含與一個或多個控制序列可操作相連的G的核酸序列的核酸構建體，控制序列引導多肽在適當的表達宿主中生產。
I.包含H的核酸構建體的重組表達載體。
J.包含H的核酸構建體或I的載體的重組宿主細胞。
K.生產A、B、C、D、E或F中任一多肽的方法，該方法包括(a)培養J的重組宿主細胞以生產包含該多肽的上清；和(b)回收該多肽。
L.能夠表達A、B、C、D、E或F中任一多肽的轉基因植物、或植物部分。
M.能夠表達A、B、C、D、E或F中任一多肽的轉基因非人動物、或產物、或其部分(element)。
N.A、B、C、D、E或F任一個所定義的至少一種多肽(i)在動物飼料中；(ii)在製備用於動物飼料的組合物中；(iii)用於提高動物飼料的營養價值；(iv)用於增加動物食物中的可消化和/或可溶性蛋白；(v)用於提高動物食物中蛋白質的水解程度；和/或(vi)用於處理蛋白質的用途。
O.包含A、B、C、D、E或F中任一個所定義的至少一種多肽；和(a)至少一種脂溶性維生素，和/或(b)至少一種水溶性維生素，和/或(c)至少一種微量礦質元素(mineral)的動物飼料添加劑。
P.粗蛋白含量為50至800g/kg的動物飼料組合物，其包含A、B、C、D、E或F任一個所定義的至少一種多肽，或包含至少一種O的飼料添加劑。
Q.包含A、B、C、D、E或F中任一個所定義的至少一種多肽的組合物，其還同時包含至少一種選自α-澱粉酶(EC 3.2.1.1)、肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.8 or 3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(galactanase)(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC 3.4.-.-)，磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；和/或β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)中的至少一種其他酶。
R.A、B、C、D、E或F中任一個所定義的至少一種多肽在洗滌劑中的用途。
第三個方面，本發明涉及a.具有蛋白酶活性的分離的多肽，選自下組(a)具有與SEQ ID NO2的1至188位胺基酸有至少86％同一性，和/或與SEQ ID NO6的1-192位胺基酸有至少72％同一性的胺基酸序列的多肽；(b)由在中等-高嚴謹條件下與(i)SEQ ID NO1的502-1065位核苷，和/或SEQ ID NO5的568-1143位核苷中任意一個，(ii)至少100個核苷的序列(i)的子序列；和/或(iii)(i)-(ii)任意一個的互補鏈雜交的核酸序列所編碼的多肽；(c)具有SEQ ID NO2的1至188位胺基酸，或SEQ ID NO6的1-192位胺基酸的多肽的變異體，包含一個或多個胺基酸的取代，刪除，延伸，和/或插入；(d)(a)、(b)、或(c)的等位變異體；和(e)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)、或(d)的片段；b.分離的核酸序列，其為包含(a)編碼a的多肽的核酸序列；(b)編碼具有蛋白酶活性的多肽，且其在中等-高嚴謹條件下與(i)SEQ ID NO1的502-1065位核苷，和/或SEQ ID NO5的568-1143位核苷中任意一個，(ii)序列(i)的至少100個核苷；和/或(iii)(i)-(ii)任意一個的互補鏈雜交的核酸序列；和/或(c)編碼具有蛋白酶活性的多肽，且其與(i)SEQ ID NO1的502-1065位核苷具有至少86％的同一性，和/或與SEQ ID NO5的568-1143位核苷具有至少82％的同一性的核酸序列的分離的核酸序列。
c.分離的核酸序列，其為通過(a)在中等-高嚴謹條件下將DNA與(i)SEQID NO1的502-1065位核苷，和/或SEQ ID NO5的568-1143位核苷中的任意一個；(ii)序列(i)的至少100個核苷；和/或(iii)(i)-(ii)中任一個的互補鏈雜交；和(b)分離核酸序列，來生產分離的核酸序列；d.包含與一個或多個控制序列可操作相連的b或c的核酸序列的核酸構建體，控制序列引導多肽在適當的表達宿主中生產；e.包含d的核酸構建體的重組表達載體；f.包含d的核酸構建體或e的載體的重組宿主細胞；g.生產a的多肽的方法，該方法包括(a)培養f的重組宿主細胞以生產包含該多肽的上清(supernatant)；和(b)回收該多肽；h.能夠表達a的多肽的轉基因植物、或植物部分；i.能夠表達a的多肽的轉基因非人動物、或產物、或其部分；j.生產a的多肽的方法，該方法包含(a)培養下述株系中的任一個(i)Nocardiopsis dassonvillei subsp.dassonvillei DSM 43235，或Nocardiopsis albaDSM 15647；和(b)回收多肽；k.a中定義的至少一種多肽(i)在動物飼料中；(ii)在製備用於動物飼料的組合物中；(iii)用於提高動物飼料的營養價值；(iv)用於增加動物食物中的可消化和/或可溶性蛋白；(v)用於提高動物食物中蛋白質的水解程度；和/或(vi)用於處理蛋白質的用途；
l.包含a中定義的至少一種多肽；和(a)至少一種脂溶維生素，和/或(b)至少一種水溶維生素，和/或(c)至少一種微量礦質元素的動物飼料添加劑；m.粗蛋白含量為50至800g/kg的動物飼料組合物，其包含a中定義的至少一種多肽，或包含至少一種l的飼料添加劑；n.包含a中定義的至少一種多肽的組合物，其還同時包含至少一種選自α-澱粉酶(EC 3.2.1.1)、肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.8 or 3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC3.4.-.-)，磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；和/或β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)中的至少一種其他酶；以及o.a中定義的至少一種多肽在洗滌劑中的用途。
第四個方面，本發明涉及具有蛋白酶活性的分離的多肽，選自下組(a)具有與SEQ ID NO2的1至188位胺基酸有至少84％同一性的胺基酸序列的多肽；(b)具有與SEQ ID NO2的-167至188位胺基酸有至少78％同一性的胺基酸序列的多肽；(c)由在中等-高嚴謹條件下與(i)可使用引物SEQID NO.3和4由Nocardiopsis alba DSM 15647基因組DNA獲得的編碼蛋白酶的DNA；(ii)SEQ ID NO1的502-1065位核苷；(iii)SEQ ID NO1的1-1065位核苷；(iv)至少100個核苷的(i)或(ii)或(iii)的子序列；和/或(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)的互補鏈雜交的核酸序列所編碼的多肽；(d)具有SEQ ID NO2的1至188，或-167至188位胺基酸序列的多肽的變異體，其包含一個或多個胺基酸的取代、刪除、延伸、和/或插入；(e)(a)、(b)或(c)的等位變異體；和(f)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的片段。
具有蛋白酶活性的分離的多肽，其在用差示掃描量熱法(DiffrentialScanning Calorimetry，DSC)在10mM磷酸鈉、50mM氯化鈉緩衝液、pH7.0、掃描速率常數1.5℃/min的條件下測定時，具有至少78℃的解鏈溫度(Tm)，其中多肽選自下組(a)具有與SEQ ID NO2的1至188位胺基酸有至少50％同一性的胺基酸序列的多肽；(b)具有與SEQ ID NO2的-167至188位胺基酸有所述同一性的胺基酸序列的多肽；(c)由在低嚴謹條件下與(i)可使用引物SEQ ID NO.3和4由Nocardiopsis alba DSM 15647基因組DNA獲得的編碼蛋白酶的DNA；(ii)SEQ ID NO1的502-1065位核苷；(iii)SEQ IDNO1的1-1065位核苷；(iv)至少100個核苷的(i)或(ii)或(iii)的子序列；和/或(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)的互補鏈雜交的核酸序列所編碼的多肽；(d)具有SEQ ID NO2的1至188，或-167至188位胺基酸序列的多肽的變異體，其包含一個或多個胺基酸的取代、刪除、延伸、和/或插入；(e)(a)、(b)或(c)的等位變異體；和(f)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的片段。
包含(a)編碼以上定義的多肽的核酸序列；(b)編碼具有蛋白酶活性的多肽，且在中等-高嚴謹條件下與(i)可使用引物SEQ ID NO.3和4由Nocardiopsis alba DSM 15647基因組DNA獲得的編碼蛋白酶的DNA；(ii)SEQ ID NO1的502-1065位或1-1065位核苷；(iii)至少100個核苷的(i)或(ii)的子序列；和/或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補鏈雜交的核酸序列；(c)編碼具有蛋白酶活性的多肽，且與SEQ ID NO1的502-1065位核苷有至少86％同一性的核酸序列；(d)編碼具有蛋白酶活性的多肽，且與SEQ ID NO1的1-1065位核苷有至少82％同一性的核酸序列的分離的核酸序列。
包含編碼具有蛋白酶活性的多肽的核酸序列的分離的核酸序列，其在用差示掃描量熱法(DSC)在10mM磷酸鈉、50mM氯化鈉緩衝液、pH7.0、掃描速率常數1.5℃/min的條件下測定時，具有至少78℃的解鏈溫度(Tm)，其中所述核酸序列(a)編碼如上定義的Tm至少為78℃的多肽；(b)在低嚴謹條件下與(i)可使用引物SEQ ID NO.3和4由Nocardiopsis alba DSM 15647基因組DNA獲得的編碼蛋白酶的DNA；(ii)SEQ ID NO1的502-1065位或1-1065位核苷；(iii)至少100個核苷的(i)或(ii)的子序列；和/或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補鏈雜交；(c)與SEQ ID NO1的502-1065位核苷具有至少50％的同一性；和/或(d)與SEQ ID NO1的1-1065位核苷具有至少50％的同一性。
分離的核酸序列，其通過(a)在中等-高嚴謹條件下將DNA與(i)可使用引物SEQ ID NO.3和4由Nocardiopsis alba DSM 15647基因組DNA獲得的編碼蛋白酶的DNA；(ii)SEQ ID NO1的502-1065位核苷；(iii)至少100個核苷的(i)或(ii)的子序列；或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補鏈雜交；和(b)分離核酸序列而生產。
核酸構建體，其包含緊接本段的上面三段中任何一段所定義的三條核酸序列之一，其中所述核酸序列與一個或多個引導多肽在適當的表達宿主中生產的控制序列可操作相連。
包含所述核酸構建體的重組表達載體。
包含所述核酸構建體或載體的重組宿主細胞。
生產上述定義的多肽的方法，該方法包含(a)培養權利要求8的重組宿主細胞以生產包含所述多肽的上清；和(b)回收所述多肽。
能夠表達上述定義的多肽的轉基因植物，或植物部分。
能夠表達如上定義的多肽的轉基因非人動物，或產物，或其部分。
上述定義的至少一種多肽(i)在動物飼料中；(ii)在製備用於動物飼料的組合物中；(iii)用於改善動物飼料的營養價值；(iv)用於增加動物食物(diet)中的可消化和/或可溶性蛋白；(v)用於提高動物食物中蛋白質的水解程度；和/或(vi)用於處理蔬菜蛋白質的用途。
包含如上定義的至少一種多肽；和(a)至少一種脂溶維生素，和/或(b)至少一種水溶維生素，和/或(c)至少一種微量礦質元素的動物飼料添加劑。
粗蛋白含量為50至800g/kg的動物飼料組合物，其包含如上定義的至少一種多肽，或包含如上定義的至少一種飼料添加劑。
包含如上定義的至少一種多肽的組合物，其同時還包含至少一種選自α-澱粉酶(EC 3.2.1.1)、肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.8 or 3.1.3.26)；木聚糖酶(EC3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC3.4.-.-)，磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；和/或β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)中的至少一種其他酶。
如上定義的至少一種多肽在洗滌劑中的用途。
上述第二、第三、和第四個方面的實施方案相互獨立，也是本發明第一個方面的優選亞方面，同時也互為優選的亞方面。
發明詳述具有蛋白酶(protease)活性的多肽，或蛋白酶，有時候也稱肽酶、蛋白酶(proteinases)、肽水解酶、或蛋白水解酶。蛋白酶可以是從肽的任何一端開始水解肽的外切型，或者是在多肽鏈內部起作用的內切型(肽內切酶)。肽內切酶在N和C端阻斷的肽底物上顯示活性，肽底物與所述蛋白酶的特異性相關。
此處術語「蛋白酶」定義為水解肽鍵的酶。其包括屬於EC 3.4的酶組酶(包括其13個亞類中的任何一類)中的任何酶。EC編號參考NC-IUBMB，Academic Press，San Diego，California的酶命名法(EnzymeNomenclature)1992，包括分別發表於Eur.J.Biochem.1994，223，1-5；Eur.J.Biochem.1995，232，1-6；Eur.J.Biochem.1996，237，1-5；Eur.J.Biochem.1997，250，1-6；和Eur.J.Biochem.1999，264，610-650的增刊1-5。該命名法定期補充更新；參見如World Wide Web(WWW)網址http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。
以其催化機制為基礎將蛋白酶分為下述的組絲氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金屬蛋白酶(M)和未知的或未分類的蛋白酶(U)，參見Handbook of Proteolytic Enzymes，A.J.Barrett，N.D.Rawlings，J.F.Woessner(eds)，Academic Press(1998)，尤其是一般介紹部分。
在特定實施方案中，本發明的蛋白酶和根據本發明的用途選自下組(a)屬於EC 3.4.-.-酶組的蛋白酶；(b)屬於上述手冊中S組的絲氨酸蛋白酶；(c)肽酶家族S2A的絲氨酸蛋白酶；和/或(d)Biochem.J.290205-218(1993)和MEROPS蛋白酶資料庫，版本6.20，March 24，2003，(www.merops.ac.uk)中描述的肽酶家族S1E的絲氨酸蛋白酶。Rawlings，N.D.，O′Brien，E.A. Barrett，A.J.(2002)MEROPStheprotease database.Nucleic Acids Res.30，343-346描述了該資料庫。
為了測定給定的蛋白酶是否絲氨酸蛋白酶，及S2A家族蛋白酶，將上述的手冊及其指定的原則作為參考。這樣的測定可用於所有類型的蛋白酶，無論其是天然的還是野生型的蛋白酶；或者是基因工程化或合成的蛋白酶。
可以採用任何的測試方法來測量蛋白酶活性，所述測試方法中使用底物，該底物包括與所討論的蛋白酶的特異性有關的肽鍵。pH-測試和溫度-測試同樣適合於所討論的蛋白酶。pH值-測試的例子為pH2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，或12。溫度-測試的例子為30，35，37，40，45，50，55，60，65，70，80，90，或95℃。
非限制性的蛋白酶底物的例子為酪蛋白，例如Azurine-交聯酪蛋白(AZCL-Casein)，和血紅蛋白。用於測定本發明蛋白酶的特異活性目的的底物是血紅蛋白，實施方案3公開了適合的測試方法。實施方案2描述了兩個其他的蛋白酶，其中任何一個都可以用於測定大致的蛋白酶活性。所謂的pNA測試是用於除特異活性測定之外的目的的優選測試方法。
pH7.5，25℃下，本發明的蛋白酶顯示了針對血紅蛋白的至少39AU/g的特異活性。可按實施方案3所述測定此特異活性。本發明的蛋白酶可以顯示出至少40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，或至少54AU/g的特異活性。
特異性測定，包括純化蛋白酶的蛋白質含量及蛋白酶活性的測定是大家熟知的。
在特定實施方案中，通過胺基酸分析，例如通過蛋白酶的酸水解，之後分離並量化釋放的胺基酸來測定蛋白質含量，優選在Biochrom 20Plus胺基酸分析儀上測定。
以下是蛋白酶活性測定中特定的、任選的技術特徵(i)將血紅蛋白底物變性；(ii)以0.65％w/w的量使用血紅蛋白底物；(ii)測試緩衝液是KH2PO4/NaOH緩衝液，pH7.50；(ii)蛋白酶的反應時間為10分鐘；(iii)酶反應後，用三氟乙酸(TCA)沉澱未消化的血紅蛋白並將其去除，優選通過過濾去除；(iv)測定濾液中的TCA-可溶性血紅蛋白降解產物，優選用Folin Ciocalteu′s苯酚試劑測定；(v)參考ALCALASETM酶標準測量並確定活性單位(AU)；(vi)用EB-SM-0349測試，優選EB-SM-0349 02/01測量活性單位(AU)；和/或(vii)所用的測試為實施方案3所公開的「蛋白酶活性測試(AU/ml)」。ALCALASETM標準和EM-SM-0349測試可從Novozymes A/S，Krogshoejvej 36，DK-2880 Bagsvaerd，Denmark(分別提供″your ref.Patent10476″和″EB-SM-0349″，或″EB-SM-0349 02/01，″)獲得。
與SEQ ID NO2和6的蛋白酶相關的高特異活性蛋白酶的篩選可按如下方法進行第一步，用SEQ ID NO3，4，7，或8的引物，或者優選用SEQID NO1和5的成熟肽編碼部分篩選DNA文庫；在合適的株系例如芽孢桿菌(Bacillus)或大腸桿菌(E.coli.)中表達雜交克隆。下一步，純化所表達的與SEQ ID NO2和/或6相關的蛋白酶，優選在微-純化方法中純化(參見，如WO 03/037914)，在下面的步驟，用酶的強抑制劑，以熟知的活性定點滴定方法(active site titration，AST)測定每個候選蛋白酶的活性蛋白酶的量。這樣做是考慮到在接下來的最後步驟中能夠比較同樣摩爾量的每個蛋白酶，所述最後步驟是使用任何適當的測試方法測定目前已知量的蛋白酶的蛋白酶活性，例如實施方案2所用的pNA測試。該程序的大部分可以是自動化的，如果需要的話可以在機器人的協助下進行。按照此處實驗部分的描述，通過例如純化蛋白酶及確定特異活性，完成高度特異活性的鑑定。
本發明蛋白酶的來源和/或其根據本發明的用途沒有限制。如此，術語蛋白酶不僅包括由任何種類的微生物獲得的天然的或野生型的蛋白酶，還包括其顯示蛋白酶活性的任何突變體、變異體、片段等等，還包括合成的蛋白酶，例如改組蛋白酶(shuffled proteases)，共有蛋白酶(consensusproteases)。這樣的基因工程蛋白酶可以按照本領域熟知的方法製備，例如通過定點突變，通過PCR(在PCR反應中將包含所需突變的PCR片段用作其中一個引物)，或者通過隨機突變。例如EP 897985中描述了共有蛋白酶的製備。例如WO95/22625和WO96/00343中簡要描述了基因改組(geneshuffling)。可以通過如Ness，J.E.等在Nature Biotechnology，Vol.20(12)，pp.1251-1255，2002中所述的合成改組，由親本的特定序列獨立地完成蛋白酶基因的重組。按照參考文獻所述，設計在其DNA序列中簡併的合成寡核苷酸並組裝基因，在其DNA序列中簡併的合成寡核苷酸提供了在該組親本蛋白酶中發現所有胺基酸的可能性。可以對全長序列進行改組，也可以只對該序列的一部分進行改組，然後再與基因的剩餘部分組合而得到全長序列。具有包含SEQ ID NO2和6任一個的成熟部分的胺基酸序列的蛋白酶是這種可用於上述改組的親本蛋白酶的特定例子，如果需要，還可同時加上源於如擬諾卡氏菌NRRL 18262的蛋白酶以提供本發明額外的蛋白酶。此處與給定來源連用的術語「由......獲得的」(obtained from)意思應為，核酸序列所編碼的多肽由該來源生產，或者由其中存在該來源的核酸序列的細胞生產。在一個優選實施方案中，該多肽是胞外分泌的。
在特定實施方案中，此蛋白酶為低致敏性變異體，其被設計用於在接觸動物包括人時激發降低的免疫反應。術語免疫反應應理解為由接觸該蛋白酶的動物的免疫系統引起的任何反應。免疫反應的一種類型為導致被接觸(exposed)動物的IgE水平升高的過敏反應。可以使用本領域已知的技術製備低致敏性變異體。例如，可以將蛋白酶與涉及免疫反應的蛋白酶的多聚體部分(moiety)屏蔽部分或者抗原決定簇結合。與多聚體的結合可能涉及如WO 96/17929，WO 98/30682，WO 98/35026，和/或WO 99/00489中所描述的多聚體與蛋白酶的體外化學連接。結合可以額外地或可選地設計體內多聚體與蛋白酶結合。這樣的結合可以通過對編碼該蛋白酶的核苷序列實施基因工程，插入編碼蛋白酶中額外的糖基化位點的共有序列，以及在能夠使蛋白酶糖基化的宿主中表達該蛋白酶，參見，例如WO 00/26354。另外一種提供低致敏性變異體的方法是對編碼該蛋白酶的核苷序列實施基因工程，以使該蛋白酶自我寡聚化，使蛋白酶單體能夠屏蔽其他蛋白酶單體的抗原決定簇，並因此降低寡聚體的抗原性。例如WO 96/16177中描述了這樣的產物及其製備。可以通過多種方法例如WO 00/26230和WO 01/83559中描述的噬菌體展示方法，或者EP 561907中描述的隨機方法來鑑定免疫反應中涉及的抗原決定簇。一旦鑑定了抗原決定簇(epitope)，可以通過已知的基因操作技術如定點突變(參見，如WO 00/26230，WO 00/26354和/或WO 00/22103)來改變其胺基酸序列，以生產免疫特性被改變的蛋白酶，或者可以使多聚體與抗原決定簇足夠近地結合以使多聚體屏蔽該抗原決定簇。
根據本發明任一方面的多肽，可以包含與SEQ ID NO2或6中任一個的成熟肽部分，例如SEQ ID NO2的1至188位胺基酸，和/或SEQ ID NO6的1至192位胺基酸(成熟肽部分)具有例如約65％同一性的胺基酸序列，且其具有蛋白酶活性(以下稱「同源多肽」)。在特定實施方案中，與SEQ IDNO2或6中任一個的成熟肽部分的同一性至少為約66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或者99％。在可選實施方案中，同一性至少為約50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，或者64％。
本發明也涉及包含與SEQ ID NO2的-167至188位胺基酸，和/或與SEQ ID NO6的-160至192位胺基酸具有例如至少約78％同一性的胺基酸序列的分離的多肽，且其具有蛋白酶活性。在特定實施方案中，與SEQ IDNO2的-167至188位胺基酸具有至少約80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或者99％的同一性。在可選實施方案中，同一性至少為約50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，或者84％。
在特定實施方案中，本發明的多肽i)具有上述提到的任何同一性的胺基酸序列；或者ii)由具有上述提到的任何同一性的胺基酸序列組成。
為達到本發明的目的，使用Needleman-Wunsch(例如整體比對)「比對」程序測定兩個胺基酸序列之間以及兩個核酸序列之間的同一性。該程序用於多肽的比對，也同時用於核苷序列比對。用默認的計分陣列BLOSUM50進行多肽比對，默認的一致性陣列用於核苷比對。對多肽來說，空位(gap)的第一個殘基的罰分(penalty)為-12，對核苷來說為-16。空位的其他殘基的罰分，多肽為-2，核苷為-4。
「比對」是版本號為v20u6的FASTA軟體包(參見W.R.Pearson and D.J.Lipman(1988)，″Improved Tools for Biological Sequence Analysis″，PNAS 852444-2448，和W.R.Pearson(1990)″Rapid and Sensitive SequenceComparison with FASTP and FASTA，″Methods in Enzymology 18363-98)的一部分。FASTA蛋白質比對使用Smith-Waterman運算法則，對空位大小沒有限制(參見″Smith-Waterman algorithm″，T.F.Smith and M.S.Waterman(1981)J.Mol.Biol.147195-197)。
在特定實施方案中，將兩個胺基酸序列的成熟肽部分、或者預期或所希望的成熟肽部分用於比對。可選地，選擇正在測定其與SEQ ID NO2的成熟肽部分的同一性的序列，依據按照下述方法所作的多序列比對結果，其與SEQ ID NO2的成熟肽部分，如通過多序列比對所鑑定的相應胺基酸殘基最為相似。
在此上下文中，為胺基酸殘基編號(或者指定位置號，參考本發明的第二個方面)的基礎是SEQ ID NO2，起始於A1結束於T188。可選地，該基礎是源於擬諾卡氏菌NRRL 18262的蛋白酶的1-188位胺基酸(WO 01/58276中公開的SEQ ID NO1，優選WO 01/58276中公開的A87被T87取代的SEQID NO1)。
蛋白酶可包含相對於成熟肽部分延伸，即在其N端和/或C端的延伸。如果要給任一延伸的胺基酸編號的話，將依據本領域的慣例對其編號，例如，對於C端延伸189，190，191等等，對於N端延伸-1，-2，-3等。
對於與參照序列，例如SEQ ID NO2比對的每一個蛋白酶中的每一個胺基酸殘基，如上面解釋的那樣(用於測定同一性目的)，直接無疑義地指定其在參照序列如SEQ ID NO2中對應的胺基酸殘基是可能的。參照例如SEQ ID NO2，將相應的殘基指定為相同的位置或編號。
對於另一蛋白酶中的每一胺基酸殘基，可以找出參照序列如SEQ ID NO2的相應位置，如下將其他蛋白酶的胺基酸序列指定為SEQ X。按如下方法找出相應於SEQID NO2的位置N的位置如上所述，將SEQ X與SEQ ID NO2比對。使用下述的原則，可由比對結果直接無疑義地得出SEQ X中相應於SEQ IDNO2的位置N的位置。
SEQ X可以是所討論的蛋白酶的成熟部分，或者也可以包括信號肽部分，或者是具有蛋白酶活性的成熟蛋白酶的片段，例如與SEQ ID NO2長度相同的片段，和/或可以是與此處描述的SEQ ID NO2比對時從A1延伸至T188的片段。
下面插入了三個比對即表I、II和III。通過如上描述的將另一蛋白酶(分別為SEQ X1，SEQ X2和SEQ X3)與SEQ ID NO2比對得到這些比對結果。其顯示了每個蛋白酶的大約50個胺基酸殘基。
首先看表I的比對，很明顯，SEQ ID NO2的P42對應於SEQ X1的Q42，因為在此比對中這些殘基上下對齊。均為其指定編號42，即SEQ ID NO2中相應殘基的編號。由此比對，同樣很明顯，例如SEQ X1不包含25S，38T，42P，44S，或49Q的任何一個。
Table IADIIGGLAYT MGGRCSVGFA ATNASGQPGF VTAGHCGTVG TPVSIGNGQG SEQ ID NO2ADIIGGLAYT MGGRCSVGFA ATNAAGQPGF VTAGHCGRVG TQVTIGNGRG SEQ X110 20 30 40 50表II和III是在兩個序列任何一個中產生空位的比對的例子。
在表II的比對中，SEQ X2中產生了空位。為了當前的目的，將SEQ X2中突出顯示的胺基酸殘基P指定為P28，儘管這樣的位置在SEQ X中為P25。
Table IIADIIGGLAYT MGGRCSVGFA ATNASGQ P GF VTAGHCGTVG TPVSIGNGQG SEQ ID NO2ADIIGGLAYT MGGRCSVGFA ATNA---PGF VTAGHCGRVG TQVTIGNGRG SEQ X210 20 30 40 50表III的比對中，在SEQ X3中產生了空位。當在SEQ ID NO2的位置編號為nn和(nn+1)的胺基酸之間產生空位時，將空位的每個位置指定為前面位置號例如nn的小寫字母或下標a，b，c等。相應地，空位的每一個位置編號為nna，nnb等。為當前的目的，將SEQ X3中突出顯示的胺基酸殘基R指定為R33a，儘管在SEQ X3中這樣的位置為R34。
Table IIIADIIGGLAYT MGGRCSVGFA ATNASGQPGF VTA - -GHCGT VGTPVSIGNGQG SEQ ID NO2ADIIGGLAYT MGGRCSVGFA ATNAAGQPGF VTARSGHCGR VGTQVTIGNGRG SEQ X310 20 30 40 50在本發明任何方面的另外的特定實施方案中，通過差示掃描量熱法(DSC)測定，本發明的多肽具有至少75℃，76℃，77℃，78℃，79℃，80℃，81℃，82℃，83℃，84℃，85℃，86℃，87℃，88℃，89℃，90℃，91℃，92℃，93℃，94℃，或者95℃的解鏈溫度Tm。DSC測定在10mM磷酸鈉、50mM氯化鈉緩衝液、pH7.0的條件下進行。掃描速率為常數，例如1.5℃/min。掃描間隔可以從20至100℃。
Tm沒有上限，但是，目前預期Tm可能在150℃，145℃，140℃，135℃，130℃，125℃，120℃，115℃，110℃，105℃，或者100℃以下。
在可選實施方案中，選擇另一緩衝液用於掃描，例如pH5.0，5.5，6.0，或pH6.5。
在另外的可選實施方案中，可以使用更高或更低的掃描速率，例如低掃描速率1.4℃/min，1.3℃/min，1.2℃/min，1.1℃/min，1.0℃/min，或0.9℃/min。
有關掃描程序的更詳細資料可參見作為參考的實施方案2。
在特定實施方案中，與源於擬諾卡氏菌NRRL 18262的蛋白酶相比，本發明的蛋白酶顯示了改變的溫度活性譜。例如，pH9及80℃條件下，本發明的蛋白酶可以顯示出至少0.40，優選至少0.45，0.50，0.55，0.60，0.65，0.70，0.75，0.80，0.85，0.90，或者0.95的相對活性，術語「相對」指相對於測定的所述蛋白酶的最大活性。對於源於擬諾卡氏菌NRRL 18262的蛋白酶，70℃時的活性設定為1.000(100％)，參見實施方案2。如另一實施方案，pH9及90℃條件下，本發明的蛋白酶顯示了至少0.10，優選至少0.15，0.20，0.25，0.30，或者0.35的相對活性。在特定實施方案中，用實施方案2的ProtazymeAK測試測量蛋白酶活性。
本發明還涉及本發明多肽的動物飼料用途。
也可以用具有同一性表的LASERGENETMMEGALIGNTM軟體(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)，通過Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS 5151-153)測定兩個胺基酸序列之間的同一性，多序列比對參數如下空位罰分為10、空位長度罰分為10。成對比對參數為Ktuple＝1、空位罰分＝3、窗口＝5、對角線(diagnosis)＝5。可以用與上述相同的運算法則和軟體包測定兩個核苷序列之間的同一性，設定如下空位罰分為10，空位長度罰分為10。成對比對參數為Ktuple＝3、空位罰分＝3及窗口＝20。
在特定實施方案中，同源肽具有與(a)SEQ ID NO2或6中任一個的成熟肽部分，或者(b)其前體形式(不包括信號肽部分，包括成熟肽部分)不同的胺基酸序列，所述不同具有(i)不超過50，49，48，47，46，45，44，43，42，41，40，39，38，37，36，35，34，33，32，31，30，29，28，27，26，25，24，23，22，21，或者20個胺基酸；(ii)不超過20，19，18，17，16，15，14，13，12，或者11個胺基酸；(iii)不超過10，9，8，7，6，5，4，3，2，或1個胺基酸；(iv)10，9，8，7，6，5個胺基酸；或者(v)4，3，2，或者1個胺基酸的差異。
在特定實施方案中，本發明的多肽包含SEQ ID NO2或6中任一個的成熟肽部分的胺基酸序列，或其等位變異體；或其具有蛋白酶活性的片段。
在另一優選實施方案中，本發明的多肽由SEQ ID NO2或6中任一個的成熟肽部分，或其等位變異體；或其具有蛋白酶活性的片段組成。
片段是從這些胺基酸序列的氨基和/或羧基端刪除一個或多個胺基酸的多肽。在一個實施方案中，片段包含至少75個胺基酸殘基，或至少100個胺基酸殘基，或至少125個胺基酸殘基，或至少150個胺基酸殘基，或至少160個胺基酸殘基，或至少165個胺基酸殘基，或至少170個胺基酸殘基，或至少175個胺基酸殘基。
等位變異體指佔據相同染色體位點的基因的兩種或多種可選形式中的任何一個。等位變異通過突變自然發生，可能在群體中導致多態。基因突變可以是沉默的(在所編碼的多肽中沒有變化)或者可以編碼具有改變的胺基酸序列的多肽。多肽的等位變異體是由基因的等位變異體編碼的多肽。
本發明也涉及具有蛋白酶活性的分離的多肽，其由在極低的、或低的、或中等的、或者中等-高的(medium-high)、或高的、或極高的嚴謹條件下與核酸探針雜交的核酸序列編碼，該探針在相同條件下與(a)SEQ ID NO1的1-1065位，優選502-1065位核苷，和/或SEQ ID NO5的1-1143，優選568-1143位核苷；(b)a的子序列，或者(c)(a)或(b)的互補鏈(J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatis，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2ndedition，Cold Spring Harbor，New York)雜交。在一個特定的實施方案中，核酸探針選自上述(a)，(b)，或(c)的核酸序列。
上述(a)下面提到的核苷子序列可以為至少100個核苷，或者在另一實施方案中為至少200個核苷。另外，該子序列(subsequence)可以編碼具有蛋白酶活性的多肽片段。
上述(a)的核酸序列，或者其子序列，以及SEQ ID NO2或6的胺基酸序列的相應部分，或其片段，可以根據本領域熟知的方法，用來設計核酸探針以鑑定並克隆來自不同種屬株系的編碼具有蛋白酶活性的多肽的DNA。特別地，可以依照標準的Southern印跡法用這樣的探針與感興趣的種屬的基因組DNA或cDNA雜交，以鑑定並分離其中的相應基因。這樣的探針可以比全序列短得多，但至少應當為15個，優選至少25個，更優選至少35個核苷長度。也可以使用更長的探針。DNA和RNA探針均可使用。典型地，探針被標記用於探測相應的基因(例如，用32P，3H，35S，生物素或抗生物素蛋白)。本發明也包含這樣的探針。
如此，可以篩選從這樣的其他生物製備的基因組DNA或cDNA文庫以得到與上述探針雜交的DNA，其編碼具有蛋白酶活性的多肽。可以用瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠電泳或其他的分離技術分離來自這樣的其他生物的基因組DNA或者其他的DNA。可以將來自所述文庫的DNA或者分離的DNA轉移並固定在硝化纖維或其他適當的載體材料上。為了鑑定與SEQ ID NO1或5中任一個，或其子序列同源的克隆或DNA，在Southern印跡中使用所述載體材料。為了本發明的目的，雜交指在極低的至極高的嚴謹條件下，將核酸序列與相應於SEQ ID NO1或5中任一個的核酸序列，其互補鏈，或其子序列的標記的核酸探針雜交。用X-射線膠片探測在這些條件下核酸探針所雜交的分子。
對於至少100個核苷長度的長探針，極低的至極高的嚴謹條件定義為42℃下，在5X SSPE，0.3％SDS，200μg/ml經剪切的變性鮭精DNA，以及對於極低的和低的嚴格度為25％的甲醯胺，對於中等的和中等高的嚴格度為35％的甲醯胺，或者對於極高的嚴格度為50％的甲醯胺中，按照標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交。
對於至少100個核苷長度的長探針，最後用0.2×SSC，0.2％SDS，20％甲醯胺衝洗載體材料三次，每次15分鐘，優選在至少45℃下衝洗(極低嚴格度)，更優選在至少50℃下衝洗(低嚴格度)，更優選在至少55℃下衝洗(中等嚴格度)，更優選在至少60℃下衝洗(中等-高嚴格度)，再優選在至少65℃下衝洗(高嚴格度)，最優選在至少70℃下衝洗(極高嚴格度)。
對於約15個至約70個核苷長度的短探針，嚴謹條件定義為，在低於依照Bolton和McCarthy的計算方法(1962，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA481390)所計算的Tm值5℃至10℃條件下，在0.9M NaCI，0.09M Tris-HCl pH7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1X Denhardt′s溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM單鹼磷酸鈉，0.1mM ATP，以及每毫升0.2mg酵母RNA中，按照標準的Southern印跡法進行預雜交，雜交和雜交後衝洗。
對於約15個至約70個核苷長度的短探針，低於所計算的Tm值5℃至10℃條件下，在6X SSC加0.1％SDS中衝洗載體材料一次，15分鐘，用6X SSC衝洗兩次，每次15分鐘。
本發明還涉及具有SEQ ID NO2和6中任一個的成熟部分胺基酸序列的多肽的變異體，其包含一個或多個胺基酸的取代、刪除、和/或插入。
變異多肽的胺基酸序列可以由於一個或多個胺基酸殘基的插入或刪除和/或用不同的胺基酸殘基取代一個或多個胺基酸殘基，而與SEQ ID NO2和6中任一個的成熟部分的胺基酸序列不同。在特定實施方案中，胺基酸變化是具有較小的屬性變化，也就是沒有明顯影響到蛋白質的摺疊和/或活性的保守性胺基酸取代；是小的刪除，典型地為一個至約30個胺基酸；是小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端的蛋氨酸，直至約20-25個殘基的小肽；或者是小的延伸，此小的延伸通過改變淨電荷或其他屬性以方便純化，如多組氨酸片段，抗原表位或者結合域。
保守性取代的例子發生在鹼性胺基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)，酸性胺基酸(穀氨酸和天冬氨酸)，極性胺基酸(穀氨醯胺和天冬醯胺)，疏水胺基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)，芳香族胺基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，和小氨酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)組內。相應地，例如，本發明涉及具有或包含SEQ ID NO2或6中任一個所列出的序列，優選其成熟部分的多肽，或其活性片段，其中保守性胺基酸取代包含在鹼性胺基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)中、酸性胺基酸(穀氨酸和天冬氨酸)中、極性胺基酸(穀氨醯胺和天冬醯胺)中、疏水胺基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)中、芳香族胺基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)中、和小氨酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)中的置換，一個取代另一個，或其任意組合。
通常不改變特異活性的胺基酸取代在本領域是已知的，例如H.Neurathand R.L.Hill，1979，在The Proteins，Academic Press，New York中所描述的。最常發生的改變為Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/lle，Leu/Val，Ala/Glu，和Asp/Gly以及相反的改變。
在特定實施方案中，本發明的以及用於本發明所述用途的多肽是酸穩定的。為此目的，術語酸穩定的指在pH2.0、pH2.5或pH3.0及37℃下保溫2小時後，與pH9.0及5℃下保溫2小時後的相應樣品相比，其殘餘活性至少為50％。在特定實施方案中，殘餘活性至少為60％，70％，80％或90％。測定酸穩定性的合適的測試方法為實施方案2的pH穩定性測試方法。
在特定實施方案中，本發明的以及用於本發明所述用途的多肽在pH7.0條件下，具有至少0.10，0.15，0.20，0.25，0.30或0.35的相對活性。實施方案2的pH譜測試方法用於本測定。
在另外的特定實施方案中，本發明的以及用於本發明所述用途的多肽具有i)在60℃及pH9的條件下，至少0.05，0.10，0.15或0.20的相對活性；和/或ii)70℃時至少0.40，0.50或0.56的相對活性。實施方案2的溫度譜測試用於這些測定。
在另外的特定實施方案中，本發明的以及用於本發明所述用途的多肽在用DSC測定時，具有至少78℃、或者至少79、80、81、82或83℃的Tm。在pH7.0條件下按實施方案2所述測定Tm。
本發明的以及用於本發明所述用途的多肽可以是細菌或真菌多肽。真菌多肽可以源於絲狀真菌或酵母。
在特定實施方案中，本發明的多肽是i)細菌蛋白酶；ii)放線菌門的蛋白酶；iii)放線菌綱的；iv)放線菌目的；v)擬諾卡氏菌科的；vi)擬諾卡氏菌屬的；和/或源於vii)擬諾卡氏菌如Nocardiopsis dassonvillei、Nocardiopsisalkaliphila、南極擬諾卡氏菌、Nocardiopsis prasina、Nocardiopsis composta、Nocardiopsis exhalans、Nocardiopsis halophila、Nocardiopsis halotolerans、Nocardiopsis kunsanensis、Nocardiopsis listeri、Nocardiopsis lucentensis、Nocardiopsis metallicus、Nocardiopsis synnemataformans、Nocardiopsistrehalosi，熱帶擬諾卡氏菌、Nocardiopsis umidischolae、新疆擬諾卡氏菌、或Nocardiopsis alba的蛋白酶，例如源於Nocardiopsis alba DSM 15647的蛋白酶，例如具有SEQ ID NO2的1至188或-167至188位胺基酸序列的多肽，或者源於Nocardiopsis dassonvillei亞種dassonvillei DSM 4235的多肽，如具有SEQ ID NO6的1-192或-160至192位胺基酸序列的多肽。在特定實施方案中，蛋白酶源於Nocardiopsis alba。
上述分類法依據G.M.GarrityJ.G.Holt的Bergey′s Manual ofSystematic Bacteriology，2001，second edition，volume 1，David R.Bone，Richard W.Castenholz中The road map to the Manual一章。
對於前述物種，應當理解本發明同時包含理想和不理想狀況的、以及其他的分類等同物，例如，變形，而不考慮其已知的種名。本領域技術人員可以很容易識別近似等同物的同一性。
公眾可以很容易在幾個培養物保藏中心得到這些物種的株系，例如美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德國微生物與細胞培養物保藏中心(Deutsche Sammiung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，DSM)、黴菌培養物中心局(Centraalbureau VoorSchimmelcultures，CBS)和Agricultural Research Service Patent CultureCollection，Northern Regional Research Center，NRRL)。例如公眾能夠由DSMZ(德國微生物與細胞培養物保藏中心，Braunschweig，德國)獲得Nocardiopsis dassonvillei亞種dassonvillei DSM 43235。該株系也保藏在其他的保藏機構如ATCC 23219、IMRU 1250、NCTC 10489。
此外，也可以用上述的探針從其他來源包括從自然界(例如，土壤、堆肥(composts)、水等)分離的微生物鑑定並獲得這樣的多肽。從自然的生活環境分離微生物的技術是本領域熟知的。然後可以類似地通過篩選另一微生物的基因組或cDNA文庫來得到核酸序列。一旦用探針探測到編碼多肽的核酸序列，就可以利用本領域普通技術人員已知的技術(參見，例如，Sambrook等，1989，如上)分離或克隆該序列。
此處定義的「分離的」或「純化的」多肽是基本上獨立於其他多肽的多肽，例如通過SDS-PASE測定為至少約20％純化的，優選至少約40％純化的，更優選約60％純化的，再優選約80％純化的，最優選約90％純化的，甚至最優選約95％純化的多肽。
本發明的核酸序列編碼的多肽也包括融合的多肽或可裂解的融合多肽，其中將另一多肽融合於所述多肽或其片段的N端或C端。通過將編碼另一多肽的核酸序列(或其部分)與本發明的核酸序列(或其部分)融合來生產融合多肽。生產融合多肽的技術是本領域已知的，例如，PCR，或者將編碼多肽的編碼序列置於框中，並且將融合多肽的表達置於相同啟動子和終止子的控制之下。
在其他的特定實施方案中，本發明不包括來自(i)WO 88/03947中公開的Nocardiopsis dassonvillei NRRL 18133；(ii)JP 2-255081-A中公開的擬諾卡氏菌株系OPC-210(FERM P-10508)；(iii)DD 20043218中公開的Nocardiopsisdassonvillei的株系ZIMET 43647；(iv)JP 2003284571中公開的擬諾卡氏菌TOA-1(FERM-P-18676)；和/或(v)相應DNA的一種或多種蛋白酶。
核酸序列本發明還涉及編碼本發明多肽的分離的核酸序列。本發明特定的核酸序列為SEQ ID NO1的502-1065或1-1065位核苷，以及SEQ ID NO5的1-1143，優選568-1143核苷，其中SEQ ID NO1的502-1065位核苷相應於成熟肽編碼區。本發明還包含編碼具有SEQ ID NO2的-167至188，優選1-188位，或者SEQ ID NO6的-160至192，優選1-192位胺基酸序列的核酸序列，其由於遺傳密碼的簡併性而與SEQ ID NO1的相應部分不同。本發明還涉及SEQ ID NO1或5的子序列，其分別編碼具有蛋白酶活性的SEQID NO2和6的片段。
SEQ ID NO1或5的子序列包含於SEQ ID NO1或5中任一個，只是5`和/或3`端的一個或多個核苷被刪除。優選地，子序列包含至少225個核苷，更優選至少300個核苷，更加優選至少375、450、500、531、600、700、800、900或1000個核苷。
本發明還涉及與(i)SEQ ID NO1的502-1065位核苷，和/或SEQ ID NO5的568-1143位核苷，或者與(ii)SEQ ID NO1的1-1065位核苷，和/或SEQID NO5的88-1143位核苷具有至少74％同一性的核苷序列。在特定實施方案中，與(i)或(ii)任一個的核苷的同一性為至少74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％。在其他的特定實施方案中，與(i)或(ii)任一個的核苷的同一性為至少60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，或73％。
本發明還涉及在SEQ ID NO1或5中，優選在其成熟肽編碼部分中包含至少一個突變的突變核酸序列，其中突變核酸序列編碼的多肽(i)由SEQID NO2的-167至188，優選1-188位，或者SEQ ID NO6的-160至192，優選1-192位胺基酸組成；或者(ii)是(i)中任一序列的變異體，其中變異體包含一個或多個胺基酸的取代、刪除、和/或插入；或者(iii)是(i)中任一序列的等位變異體，或者(iv)是(i)中任一序列的片段。
用於分離或克隆編碼多肽的核酸序列的技術是本領域已知的，其包括從基因組DNA分離，從cDNA製備，或其組合。可以使用例如已知的多聚酶鏈式反應法(PCR)或表達文庫抗體篩選法，從這樣的基因組DNA中克隆本發明的核酸序列，以探測具有共有結構特徵的克隆的DNA片段。參見，例如Innis等，1990，PCRA Guide to Methods and Application，Academic Press，New York。可以使用其他的核酸擴增方法例如連接酶鏈式反應法(ligasechain reaction，LCR)、ligated activated transcription(LAT)和核酸基礎序列擴增法(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)。可以從擬諾卡氏菌株系或另外的或相關的生物克隆該核酸序列，這可能是，例如，核酸序列的多肽編碼區的等位或物種變異體。
此處術語「分離的核酸序列」指基本上獨立於其他核酸序列的核酸序列，例如通過瓊脂糖凝膠電泳測定為至少約20％純化的，優選至少約40％純化的，更優選約60％純化的，再優選約80％純化的，最優選約90％純化的核酸序列。例如，可以使用基因工程中標準的克隆方法獲得，所述基因工程用於將核酸序列從其天然位置重新定位於其將要被複製的不同的位置。所述克隆方法可能涉及將包含編碼多肽的核酸序列的所需核酸片段切除並分離，將此片段插入載體分子，將重組載體整合至宿主細胞中，核酸序列的多拷貝或克隆將在該宿主細胞中複製。該核酸序列可以是基因組，cDNA，RNA，半合成的，合成來源的，或其任意組合。
本發明編碼多肽的核酸序列的修飾對於與所述多肽基本類似的多肽的合成可能是必要的。術語與所述多肽「基本類似的」是指非天然發生形式的多肽。這些多肽在某些工程方面可能與從其天然來源分離的多肽不同，例如，在特異活性、熱穩定性、最佳pH、致敏性或類似方面有所差異的變異體。所述變異序列可以以作為SEQ ID NO1和/或5的多肽編碼部分形式存在的核酸序列，例如其子序列為基礎來構建，和/或通過引入不產生具有其他胺基酸序列的多肽，但與宿主生物傾向於生產蛋白酶的密碼利用相符的核苷取代來構建，或者通過引入可能產生不同胺基酸序列的核苷取代來構建。如需要有關核苷取代的一般說明，可參見，例如，Ford等，1991，ProteinExpression and Purification 295-107。例如，可以如上所述製備低致敏性多肽。
這樣的取代可在對分子功能至關重要的區域之外進行，這樣仍然產生具有活性的多肽，這對本領域熟練技術人員來說是很顯然的。可以依照本領域已知的方法，例如定點突變或丙氨酸掃描突變(參見，例如Cunninghamand Wells，1989，Science 2441081-1085)來鑑定涉及多肽活性的基本胺基酸殘基，並因此優選不取代涉及多肽活性的基本胺基酸殘基，所述多肽由本發明的分離的核酸序列所編碼。在後來的技術中，將突變引入分子中的每一個帶正電的殘基，測試所得突變分子的蛋白酶活性，以鑑定對於分子活性至關重要的胺基酸殘基。也可以通過使用核磁共振分析、結晶學或光親合標記方法(參見，例如，de Vos等，1992，Science 255306-312；Smith等，1992，Journal of Molecular Biology 224899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Letters30959-64)測定三維結構來測定底物-蛋白酶反應的位置。
本發明還涉及編碼本發明多肽的分離的核酸序列，其在極低嚴謹條件下，優選在低嚴謹條件下，更優選在中等嚴謹條件下，更優選在中等-高嚴謹條件下，再優選在高嚴謹條件下，最優選在極高嚴謹條件下與核酸探針雜交，所述核酸探針在相同條件下與SEQ ID NO1和/或5核酸序列，或其互補鏈雜交；或此處定義的其等位變異體和子序列(Sambrook等，1989，如上)。
本發明還涉及通過(a)在極低、低、中等、中等高、高、或極高嚴謹條件下將DNA與(i)SEQ ID NO1的1-1065，優選502-1065位核苷，或者SEQID NO5的1-1143，或88-1143，優選568-1143位核苷，(ii)(i)的子序列，或者(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；和(b)分離核酸序列，而生產的分離核酸序列。所述子序列優選為具有至少100個核苷的序列，以使這樣的序列所編碼的多肽片段具有蛋白酶活性。
生產突變核酸序列方法本發明進一步涉及生產突變核酸序列的方法，包括將至少一個突變引入SEQ ID NO1和/或5的成熟多肽編碼序列，或其子序列，其中突變的核酸序列編碼由SEQ ID NO2的-167至188，優選1-188位胺基酸，或者SEQID NO6的-160至192，優選1-192位胺基酸；或其具有蛋白酶活性的片段所組成的多肽。
可以使用本領域已知的任何方法，通過定點突變向核酸序列引入突變，用一個核苷交換另一個核苷。利用插入有感興趣序列的超螺旋、雙鏈DNA載體和包含所需突變的兩個合成引物的方法是尤其有用的。與載體的相對鏈分別互補寡核苷酸引物，在溫度循環期間通過Pfu DNA多聚酶方式進行延伸。引物的組合使用產生了包含交叉缺口的質粒。溫度循環之後，用Dpnl處理產物，Dpnl特異於甲基化和半甲基化的DNA，用於消化親本DNA模板並選擇包含突變的合成DNA。也可使用其他本領域已知的方法。
核酸構建體本發明還涉及包含與一個或多個控制序列可操作相連的本發明的核酸序列的核酸構建體，所述控制序列在與控制序列相容的條件下引導編碼序列在適當的宿主細胞中表達。表達應被理解為包括涉及多肽生產的任何步驟，其包括但不限於轉錄、轉錄後修飾、翻譯、翻譯後修飾和分泌。
此處「核酸構建體」定義為單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離於天然產生的基因，或者是經過修飾而包含了以自然界不存在的方式組合和鄰接(juxtaposed)的核酸片段。當核酸構建體包含了所有本發明的編碼序列表達所需的控制序列時，術語核酸構建體與術語表達盒是同義的。此處術語「編碼序列」定義為直接特異於其蛋白質產物的胺基酸序列的核酸序列。通過位於mRNA 5`端開放讀碼框正上遊的核糖體結合位置(原核生物)或ATG起始密碼子(真核生物)，以及位於mRNA 3`端開放讀碼框正下遊的轉錄終止子序列來確定編碼序列的界限。編碼序列可以包括但不限於DNA、cDNA、以及重組核酸序列。
可以以多種方法操作編碼本發明多肽的分離的核酸序列，以供多肽表達之用。依據表達載體的情況，在核酸序列插入載體之前對其進行操作是需要或必要的。利用重組DNA方法修飾核酸序列的技術是本領域熟知的。
此處定義的術語「控制序列」包括表達本發明多肽所必須或有利的所有組件。每個控制序列對於編碼多肽的核酸序列來說可以是天然的或者是外源的。這樣的控制序列包括但不限於前導序列(leader)、聚腺苷酸化(polyadenylation)序列、前導肽(propeptide)序列、啟動子、信號肽序列、和轉錄終止子。控制序列最少包括啟動子、以及轉錄和翻譯終止信號。可以為控制序列提供接頭(linker)，目的是為了引入特定限制性位點以便於控制序列與編碼多肽的核酸序列的編碼區連接。此處術語「可操作相連」定義為一種結構，在這種結構中，將控制序列適當地置於與DNA序列的編碼序列相關的位置，以使控制序列引導多肽的表達。
控制序列可以是合適的啟動子序列，由宿主細胞所識別而使核酸序列表達的核酸序列。啟動子序列包含介導多肽表達的轉錄控制序列。啟動子可以是在所選擇的宿主細胞中顯示轉錄活性的任何核酸序列，包括突變的、截斷的和雜交的啟動子，其可由編碼胞外或胞內多肽的，與宿主細胞同源或異源的基因獲得。
引導本發明的核酸構建體在尤其是細菌宿主細胞中轉錄的合適的啟動子的例子為由大腸桿菌的lac操縱元、天藍色鏈黴菌(Streptomyces coelicolor)的瓊膠酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的果聚糖合酶(levansucrase)基因(sacB)，地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的α-澱粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)的麥芽糖澱粉酶基因(amyM)、解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的α-澱粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌的青黴素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌的xylA和xylB基因以及原核生物的β-內醯胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 753727-3731)所獲得的啟動子，還有tac啟動子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 8021-25)。Scientific American，1980，24274-94，″Useful proteins fromrecombinant bacteria″中和Sambrook等，1989，如上描述了更多的啟動子。
引導本發明的核酸構建體在絲狀真菌宿主細胞中轉錄的合適的啟動子的例子為由米麴黴(Aspergillus oryzae)TAKA澱粉酶、米赫根毛黴(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑麴黴(Aspergillus niger)中性α-澱粉酶、黑麴黴酸穩定性α-澱粉酶、黑麴黴或泡盛麴黴(Aspergillus awamori)葡萄糖澱粉酶(glaA)、米赫根毛黴脂肪酶、米麴黴鹼性蛋白酶、米麴黴丙糖磷酸異構酶(triose phosphate isomerase)、構巢麴黴(Aspergillus nidulans)乙醯胺酶、和尖孢鐮刀黴(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶樣蛋白酶基因獲得的啟動子(WO 96/00787)、還有NA2-tpi啟動子(黑麴黴中性α-澱粉酶與米麴黴丙糖磷酸異構酶基因的啟動子的雜合體)、及其突變、截短以及雜交的啟動子。
在酵母宿主中，有用的啟動子由啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇酶(ENO-1)、啤酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、啤酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)以及啤酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因獲得。其他有用的醇母宿主細胞啟動子描述於Romanos等，1992，Yeast 8423-488。
控制序列也可以是適當的轉錄終止子序列，由宿主細胞所識別而終止轉錄。終止子序列與編碼多肽的核酸序列3`端可操作相連。任何在所選擇的宿主細胞中發揮功能的終止子均可用於本發明。
用於絲狀真菌宿主細胞的優選終止子由米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴葡萄糖澱粉酶、構巢麴黴鄰氨基苯甲酸合成酶、黑麴黴α-葡萄糖苷酶、尖孢鐮刀菌胰蛋白酶(trypsin)樣蛋白酶的基因獲得。
用於酵母宿主細胞的優選終止子由啤酒酵母烯醇酶、啤酒酵母細胞色素C(CYC1)和啤酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因獲得。Romanos等，1992，如上描述了其他用於酵母宿主細胞的有用終止子。
用於細菌宿主細胞例如芽孢桿菌的優選終止子為來自地衣芽孢桿菌的α-澱粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽胞桿菌的麥芽糖澱粉酶基因(amyM)、或者解澱粉芽孢桿菌的α-澱粉酶基因(amyQ)的終止子。
控制序列也可以是前導序列，其是mRNA的非翻譯區，但對宿主細胞的翻譯是重要的。前導序列與編碼多肽的核酸序列5`端可操作相連。任何在所選擇的宿主細胞中發揮功能的前導序列均可用於本發明。
用於絲狀真菌宿主細胞的優選前導序列由米麴黴TAKA澱粉酶、構巢麴黴丙糖磷酸異構酶基因獲得。
用於酵母宿主細胞的合適的前導序列由啤酒酵母烯醇酶(ENO-1)、啤酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、啤酒酵母α-因子、和啤酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)的基因獲得。
控制序列也可以是聚腺苷酸化序列，其與核酸序列的3`端可操作相連，當轉錄時，其作為添加多聚腺苷殘基的信號由宿主細胞所識別，以轉錄mRNA。任何在所選擇的宿主細胞中發揮功能的聚腺苷酸化序列均可用於本發明。
用於絲狀真菌宿主細胞的優選聚腺苷酸化序列由米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴葡萄糖澱粉酶、構巢麴黴鄰氨基苯甲酸合成酶、和尖孢鐮刀黴胰蛋白酶樣蛋白酶、黑麴黴α-葡萄糖苷酶的基因獲得。
Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 155983-5990描述了對酵母宿主細胞有用的聚腺苷酸化序列。
控制序列也可以是信號肽編碼區，其編碼連接於多肽氨基端的胺基酸序列，引導所編碼的多肽進入細胞分泌途徑。核酸序列的編碼序列5`端可以固有地包含信號肽編碼區，該信號肽編碼區在翻譯閱讀框中天然地與編碼分泌多肽的編碼區片段相連。可選地，編碼區的5`端可以包含對編碼序列來說為外源的信號肽編碼區。編碼序列本身不包括信號肽編碼區時，就需要外源的信號肽編碼區。可選地，外源信號肽編碼區可以簡單地替換本身的信號肽編碼區以增強多肽的分泌。然而，引導表達的多肽進入宿主細胞分泌途徑的任何信號肽編碼區均可用於本發明。
用於細菌宿主細胞的有效的信號肽編碼區由芽孢桿菌NCIB 11837麥芽糖澱粉酶、嗜熱脂肪芽胞桿菌α-澱粉酶、地衣芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌的α-澱粉酶、嗜熱脂肪芽胞桿菌的中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)、和枯草芽孢桿菌的prsA的基因獲得。Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57109-137中描述了更多的信號肽。
用於絲狀真菌宿主細胞的有效的信號肽編碼區為由米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴中性澱粉酶、黑麴黴葡萄糖澱粉酶、米赫根毛黴的天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens的纖維素酶和Humicola lanuginosa的脂肪酶基因獲得的信號肽編碼區。
對酵母宿主細胞有用的信號肽由啤酒酵母α-因子和啤酒酵母轉化酶基因獲得。Romanos等，1992，如上描述了其他的有用信號肽編碼區。
控制序列也可以是編碼位於多肽氨基端的胺基酸序列的前導肽編碼區。已知所得的多肽稱為前體酶(proenzyme)或前體多肽(propolypeptide)(有些時候也叫酶原(zymogen))。前體多肽通常是沒有活性的，可以由前體多肽通過前導肽催化或自體催化裂解轉變為成熟的活性多肽。可以從枯草芽孢桿菌鹼性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(aprT)、啤酒酵母α-因子、米赫根毛黴天冬氨酸蛋白酶、嗜熱黃黴(Myceliophthora thermophila)的漆酶(WO 95/33836)基因獲得前導肽編碼區。
在優選實施方案中，前導肽編碼區為SEQ ID NO1的1-501位核苷，或者SEQ ID NO6的30-189位核苷。
當多肽的氨基端同時存在信號肽和前導肽編碼區時，前導肽區位於多肽的氨基端，信號肽區位於前導肽區的氨基端。
也可能需要添加允許調控宿主細胞生長相關多肽表達的調控序列。調控系統的例子為，因應化學或物理刺激，包括調控化合物的存在，而使基因表達開放或關閉的調控系統。原核系統中的調控系統包括lac，tac和trp操縱子系統。在酵母中，可以使用ADH2系統或GAL1系統。在絲狀真菌中，TAKA α-澱粉酶啟動子、黑麴黴葡萄糖澱粉酶啟動子和米麴黴葡萄糖澱粉酶啟動子可以作為調控序列。調控序列的其他例子為允許基因擴增的調控序列。在真核系統中，其包括存在氨甲蝶呤時擴增的二氫葉酸還原酶基因，以及存在重金屬時擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核酸序列將與調控序列可操作相連。
表達載體本發明還涉及包含本發明的核酸序列、啟動子、以及轉錄及翻譯終止信號的重組表達載體。上述的各種核酸和控制序列可連接在一起而得到重組表達載體，其可以包括一個或多個方便的限制性位點，以允許在這些位點插入或取代編碼多肽的核酸序列。可選地，可以通過將核酸序列或包括該序列的核酸構建體插入用於表達的適當的表達載體來表達本發明的核酸序列。在構建表達載體時，將編碼序列置於載體中，以將編碼序列與適當的表達控制序列可操作相連。
重組表達載體可以是能夠方便地用於重組DNA方法，並可引發核酸序列表達的任何載體(例如，質粒或病毒)。典型地，載體的選擇依賴於載體與其將要被導入的宿主細胞的兼容性。該載體可以是線性的質粒或封閉的環狀質粒。
該載體可以自主複製載體，例如，以染色體外實體存在的載體，其複製不依賴於染色體的複製，例如，質粒、染色體外成分、微小染色體、或者人工染色體。載體可以包含任何確保自我複製的方式。可選地，載體可以是這樣的一個載體，當其被導入宿主細胞中時，其整合到基因組中，並與其所整合的染色體一起複製。另外，也可以使用同時包含將要導入宿主細胞基因組的全部DNA的單一載體或質粒，或者兩個或多個載體或質粒，或者可以使用轉座子。
本發明的載體優選包含一個或多個可選擇的標記，其允許很容易地選擇轉化的細胞。可選擇標記為基因，其提供生物殺蟲或病毒抗性、抗重金屬、對營養缺陷型的原養型及類似的產物。細菌的可選擇標記的例子為來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因。用於酵母宿主細胞的合適標記為ADE2，HIS3，LEU2，LYS2，MET3，TRP1，和URA3。用於絲狀真菌宿主細胞的可選擇標記包括但不限於amdS(乙醯胺酶)、argB(鳥氨酸氨基甲醯轉移酶)、bar(草丁膦乙醯轉移酶)、hygB(潮黴素磷酸轉移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5』-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷醯基轉移酶)、trpC(鄰氨基苯甲酸合成酶)，及其等同物。優選用於麴黴菌細胞的為構巢麴黴或者米麴黴的amdS和pyrG基因以及吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本發明的載體優選包含允許載體穩定地整合於宿主細胞基因組或者允許載體在細胞中不依賴於基因組而自主複製的成分。
為了整合於宿主細胞基因組，載體可能依賴於編碼多肽的核酸序列，或者其他任何用於通過同源和不同源重組將載體穩定地整合於基因組的載體成分。可選地，載體可以包含通過同源重組引導向宿主細胞基因組整合的額外的核酸序列。額外的核酸序列使載體能夠整合於宿主細胞基因組中精確的染色體位置。為了增加在精確位點整合的可能性，整合元件應優選包含足夠數量的核苷酸，例如100至1,500個鹼基對，優選400至1,500個鹼基對，最優選800至1,500個鹼基對，這些鹼基對與相應的目標序列高度同源，以增加同源重組的概率。整合成分可以是與宿主細胞基因組中的目標序列同源的任何序列。另外，整合成分可以是非編碼或編碼核酸序列。另一方面，載體可以通過非同源重組整合至宿主細胞基因組。
為了自主複製，載體可以進一步包含使載體能夠在所述的宿主細胞中自主複製的複製起源。細菌的複製起源的例子為允許在大腸桿菌中複製的質粒pBR322，pUC19，pACYC177，和pACYC184，和允許在芽孢桿菌中複製的質粒pUB110，pE194，pTA1060，和pAMβ1的複製起源。用於酵母宿主細胞的複製起源的例子為2micron複製起源，ARS1，ARS4，ARS1與CEN3的組合，和ARS4與CEN6的組合。複製起源可以是具有突變的複製起源，該突變使其在宿主細胞中發揮溫度敏感性功能(參見，例如，Ehrlich，1978，Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 751433)。
可以將超過一個拷貝編碼本發明的核酸序列插入宿主細胞以增強基因產物的生產。可以通過將至少一個額外的序列拷貝整合於宿主細胞基因組中以增加核酸序列的拷貝數，或者通過在包含擴增的可選擇標記基因拷貝的細胞中，使核酸序列包含可擴增的可選擇標記基因，並因此可以在存在適當的可選擇試劑的情況下，通過培養細胞來選擇額外拷貝的核酸序列，以用於增加核酸序列的拷貝數。
用於連接上述組分以構建本發明的重組表達載體的方法是本領域技術人員所熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，如上)。
也可以將蛋白酶與至少一種其他的感興趣的酶共表達以用於動物飼料，例如澱粉酶，如α-澱粉酶(EC 3.2.1.1)，肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC 3.4.-.-)，磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；和/或β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)。
可以從不同的載體，從一個載體，或者兩種技術的組合來共表達酶。當使用不同的載體時，載體可以具有不同的可選擇標記，以及不同的複製起源。當只使用一個載體時，可以從一個或多個啟動子表達基因。如果在一個啟動子(二或多順反子)的調控下克隆，所克隆的基因的順序可能影響蛋白質的表達水平。蛋白酶也可以作為融合蛋白表達，例如，在讀碼框中，編碼蛋白酶的基因被融合至編碼另一蛋白的基因。該蛋白可能是另一種酶或另一種酶的功能區。
宿主細胞本發明還涉及包含本發明核酸序列的重組宿主細胞，其可方便地用於多肽的重組生產。將包含本發明核酸序列的載體導入宿主細胞，以使載體作為染色體成分或作為前述的自我複製的染色體外載體存在。術語「宿主細胞」包含與複製過程中發生突變的親本細胞不同的親本細胞的任何後裔。宿主細胞的選擇在很大程度上將依賴於編碼多肽的基因及其來源。
宿主細胞可以是單細胞微生物，例如，原核生物，或者是非單核微生物，例如，真核生物。
有用的單細胞為細菌細胞如革蘭氏陽性細菌包括但不限於芽孢桿菌屬細胞，或鏈黴菌屬細胞，或乳酸菌細胞；或者為革蘭氏陰性細菌例如大腸桿菌和假單胞菌(Pseudomonas)類的乳酸細菌，包括但不限於乳球菌屬(Lactococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、鏈球菌屬(Streptococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)的物種。
可以通過例如原生質體轉化(參見，例如，Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168111-115)、使用感受態細胞(參見，例如，Young和Spizizin，1961，Journal of Bacteriology 81823-829，或者Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56209-221)、電穿孔法(參見，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6742-751)、接合法(參見，例如，Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 1695771-5278)將載體導入細菌宿主細胞。
宿主細胞可以是真核細胞，例如非人動物細胞，昆蟲細胞、植物細胞或者真菌細胞。
在特定實施方案中，宿主細胞是真菌細胞。此處所用「真菌(fungi)」包括子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、和接合菌門(Zygomycota)(如Hawksworth等，在Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi，8th edition，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK中所定義的)、以及Oomycota(如Hawksworth等，1995，如上，page 171所引用的)和所有的有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等，1995，如上)。
在另一特定實施方案中，真菌宿主細胞是酵母細胞。此處所用的「酵母」包括產子囊酵母(ascosporogenous)(內孢黴目(Endomycetales))，產擔子孢子囊酵母(basidiosporogenous)，和屬於半知菌(Fungi Imperfecti)(芽孢綱(Blastomycetes))的酵母。由於酵母的分類將來可能會有所變化，為了本發明的目的，應該按照Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，and Davenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述定義酵母。
酵母宿主細胞可以是假絲酵母(Candida)、漢遜酵母(Hansenula)、克魯維酵母(Kluyveromyces)、畢赤酵母(Pichia)、酵母(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、或者亞羅威阿酵母(Yarrowia)細胞。
真菌宿主細胞可以是絲狀真菌細胞。「絲狀真菌」包括真菌門(Eumycota)和卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，以上所定義的)所有絲狀形式的亞類。絲狀真菌以由殼多糖、纖維素、葡聚糖、脫乙醯殼多糖、甘露聚糖、以及其他複合多糖組成的菌絲體壁為特徵。營養生長依靠菌絲的延長，碳分解是需氧的。相反，酵母例如啤酒酵母的營養生長通過單細胞十狀體的萌發進行，碳分解可以是發酵。
絲狀真菌宿主細胞的例子是但不限於支頂孢黴(Acremonium)，麴黴，鐮刀黴(Fusarium)，腐質黴(Humicola)，毛黴(Mucor)，黃黴(Myceliophthora)，脈孢菌(Neurospora)，青黴(Penicillium)，梭孢殼菌(Thielavia)，Tolypocladium，或木黴(Trichoderma)上述屬物種的細胞。
可以通過涉及原本已知的原生質體形成、原生質體轉化、以及細胞壁再生等方式的方法轉化真菌細胞。EP 238 023和Yelton等，1984，Proceedingsof the National Academy of Sciences USA 811470-1474中描述了轉化麴黴宿主細胞的適當的方法。Malardier等，1989，Gene 78147-156和WO 96/00787中描述了轉化鐮刀黴物種的適當方法。可以用Becker and Guarente，InAbelson，J.N.and Simon，M.I.，editors，Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology，Methods in Enzymology，Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito等，1983，Journal of Bacteriology 153163；和Hinnen等，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 751920中描述的方法轉化酵母。
生產方法本發明還涉及生產本發明的多肽的方法，包含(a)培養菌株，該菌株的野生型能夠生產所述多肽；和(b)回收多肽。優選該菌株屬於擬諾卡氏菌屬，更優選為Nocardiopsis prasina，南極擬諾卡氏菌，Nocardiopsis dassonvillei或Nocardiopsis alba，最優選為Nocardiopsis alba DSM 15647，或者Nocardiopsisdassonvillei亞種dassonvillei DSM 43235。
本發明還涉及生產本發明的多肽的方法，包含(a)在有利於多肽生產的條件下培養宿主細胞；和(b)回收多肽。
本發明還涉及生產本發明的多肽的方法，包含(a)在有利於多肽生產的條件下培養宿主細胞，其中宿主細胞包含突變的核酸序列，該突變的核酸序列在SEQ ID NO1的502-1065或1-1065位核苷，或者在SEQ ID NO5的1-1143、88-1143，優選568-1143位核苷包含至少一個突變，其中的突變核酸序列編碼多肽，該多肽(i)由SEQ ID NO2的1至188，或者-167至188，或者SEQ ID NO6的-160至192，優選1-192胺基酸組成，或者(ii)是(i)中任一序列的變異體，其中該變異體包含一個或多個胺基酸的取代、刪除、和/或插入，或者(iii)是(i)中任一序列的等位變異體，或者(iv)是(i)中任一序列的片段。
在本發明的生產方法中，細胞培養於適合用本領域已知方法生產多肽的營養培養基中。例如，可以在實驗室或者工業發酵罐中，在適當的培養基中以及允許多肽表達和/或分離的條件下，通過搖瓶培養、小規模或大規模發酵(包括連續的、分批的、補料-分批的、或者固態發酵)來培養細胞。在包含碳源和氮源以及無機鹽的適當營養培養基中以本領域已知的方法進行培養。合適的培養基可以從供應商處獲得，或者可以用公布的組合物(例如，美國典型培養物保藏中心目錄中的)製備。如果多肽分泌到營養培養基中，則可以直接從培養基回收多肽。如果多肽沒有分泌，則可以通過細胞裂解來回收。
可以用本領域已知的專門用於所述多肽的方法探測多肽。這些探測方法可能包括使用特異性抗體、形成產物、或者底物的消失。例如，可以用蛋白酶測試來測定此處所述多肽的活性。
可以用本領域已知的方法回收所得多肽。例如，可以通過傳統的方法包括但不限於離心、過濾、提取、噴霧乾燥、蒸發、或沉澱從營養培養基中回收多肽。
可以用本領域已知的方法包括但不限於層析(例如，離子交換層析、親合層析、疏水層析、色譜聚焦層析、大小排阻層析)、電泳(例加，製備性等電聚焦電泳)、差別溶解度(differential solubility)(例如，硫酸銨沉澱)、SDS-PAGE、或者提取(參見，例如，Protein Purification，J.-C.Janson and LarsRyden，editors，VCH Publishers，New York，1989)來純化本發明的多肽。
植物本發明還涉及用編碼本發明具有蛋白酶活性的多肽的核酸序列轉化的轉基因植物、植物部分或者植物細胞，其用於表達生產可回收量的多肽。可以從植物或植物部分回收所述多肽。可選地，包含重組多肽的植物或植物部分可用於如改善食物或飼料的質量，例如，提高營養價值、改善口味和改善流變性狀，或者用於破壞抗營養因子。
在特定實施方案中，所述多肽定位於種子的胚乳存儲液泡中。可以通過用適當的信號肽以前體形式合成多肽來達到這種目的，參見Horvath等，PNAS，Feb.15，2000，vol.97，no.4，p.1914-1919。
轉基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或者單子葉的(單子葉植物)或其工程變異體。單子葉植物的例子為草，例如早熟禾(meadow grass，bluegrass，Poa)，飼草如羊茅(Festuca)、黑麥草(Lolium)，temperate grass如剪股穎屬(Agrostis)，和穀類例如小麥、燕麥、黑麥、大麥、水稻、高粱、黑小麥(triticale)(小麥(Triticum)和黑麥(Secale)的穩定化雜種)、和玉米(corn)。雙子葉植物的例子是菸草，豆科植物例如羽扇豆(legume)、馬鈴薯、糖用甜菜、豌豆(pea)、菜豆(bean)和大豆(soybean)，和十字花科植物(family Brassicaceae)例如向日葵(Helianthus)、棉花(Gossypium)、花椰菜、油菜籽、和非常相關的模式生物擬南芥(Arabidopsis thaliana)。例如US專利no.5,689,054和US專利no.6,111,168中描述的肌醇六磷酸低含量植物為工程植物的例子。
植物部分的例子是莖、愈傷組織、葉、根、果實、種子和塊莖，還有包含這些部分的單獨的組織，例如表皮、葉肉、薄壁組織、維管組織、分生組織。特定的細胞區室例如葉綠體、質外體、線粒體、液泡、過氧化物酶體、和細胞質被認為是植物部分。另外，任何植物細胞，無論什麼組織來源，都被認為是植物部分。同樣，植物部分例如為方便本發明利用而分離的特定組織和細胞也被認為是植物部分，例如，胚、胚乳、糊粉(aleurone)、種皮。
這些植物、植物部分和植物細胞的後代也包括在本發明的範圍之內。
可以按照本領域已知的方法構建表達本發明的多肽的轉基因植物或植物細胞。簡單地說，將一個或多個編碼本發明多肽的表達構建體整合至植物宿主基因組，並將所得的經改造的植物或植物細胞繁殖為轉基因植物或植物細胞，以此來構建植物或植物細胞。
方便地，所述表達構建體為核酸構建體，其包含與適當的調控序列可操作相連的編碼本發明多肽的核酸序列，所述調控序列是在所選植物或植物細胞中表達核酸序列所需要的。另外，表達構建體可以包含可選擇標記，該標記可用於鑑定整合了表達構建體的宿主細胞，其序列對於引導所述構建體進入所述植物是必須的(後者依賴於所使用的DNA導入方法)。
調控序列，例如啟動子和終止子序列和可選的信號或轉運序列的選擇以例如需要何時、何地及如何表達所述多肽為基礎來確定。例如，編碼本發明多肽的基因的表達可以是組成性的或可誘導的，或者可以是發育、場所或組織特異的，基因產物可以定向至特定的組織或植物部分例如種子或葉子。例如，Tague等，1988，Plant Physiology 86506描述了調控序列。
對於組成性表達，可以使用以下的啟動子35S-CaMV啟動子(Franck等，1980，Cell 21285-294)，玉米ubiquitin 1(Christensen AH，Sharrock RA andQuail 1992.Maize polyubiquitin genesstructure，thermal perturbation ofexpression and transcript splicing，and promoter activity following transfer toprotoplasts by electroporation)，或者水稻actin 1啟動子(Plant Mo.Biol.18，675-689.；Zhang W，McElroy D.and Wu R 1991，Analysis of rice Actl 5’regionactivity in transgenic rice plants.Plant Cell 3，1155-1165)。器官特異性啟動子可以是，例如，來自貯藏組織如種子、馬鈴薯塊莖、和果實的啟動子(Edwards Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24275-303)，或者來自代謝組織如分生組織的啟動子(Ito等，1994，Plant Mol.Biol.24863-878)，可以是種子特異的啟動子如來自水稻的glutelin，prolamin，globulin，和albumin的啟動子(Wu等，1998，Plant and Cell Physiology 39885-889)，來自legumin B4和蠶豆的未知種子蛋白基因的蠶豆啟動子(Conrad等，1998，Journal of Plant Physiology 152708-711)，來自種子油體蛋白的啟動子(Chen等，1998，Plant and CellPhysiology 39935-941)，來自甘藍型油菜(Brassica napus)貯藏蛋白napA啟動子，或者本領域已知的任何其他種子特異性啟動子，例如WO 91/14772所描述的。另外，啟動子可以是葉特異性啟動子，例如來自水稻或番茄的rbcs啟動子(Kyozuka等，1993，Plant Physiology 102991-1000)，小球藻病毒腺嘌呤甲基轉移酶基因啟動子(Mitra and Higgins，1994，Plant Molecular Biology2685-93)，或者水稻的aldP基因啟動子(Kagaya等，1995，Molecular andGeneral Genetics 248668-674)，或者創傷誘導啟動子例如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，1993，Plant Molecular Biology 22573-588)。同樣，啟動子可以是能夠由非生物處理如溫度、乾旱、鹽度改變所誘導的，或者是能夠由激活啟動子的外來物質如乙醇、雌激素、植物激素像乙烯、脫落酸、赤黴酸、和/或重金屬所誘導的。
也可以使用啟動子增強子組件在植物中獲得更高的蛋白酶表達。例如，啟動子增強子組件可以是位於啟動子和編碼本發明多肽的核苷序列之間的內含子。例如，Xu等，1993，以上公開了水稻actin 1基因的第一個內含子用於增強表達的用途。
更進一步，可以優化密碼子利用率以提升所述的植物物種的表達(參見，以上Horvath等所述)。
可以選擇本領域可獲得的可選擇標記基因和表達構建體的任何其他部分。
根據本領域已知的傳統技術將核酸構建體整合至植物基因組，包括農桿菌(Agrobacterium)介導的轉化、病毒介導的轉化、微注射、粒子轟擊、基因槍法轉化、和電穿孔法(Gasser等，1990，Science 2441293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8535；Shimamoto等，1989，Nature 338274)。
目前，土壤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導的基因轉移法是用於生產轉基因雙子葉植物的選擇(for a review，see Hooykas and Schilperoort，1992，Plant Molecular Biology 1915-38)，其也可以用於轉化單子葉植物，儘管其他的轉化方法對於這些植物來說一般是優選的。目前，選擇用於生產轉基因單子葉植物的方法是對胚胎愈傷組織或發育中的胚胎(Christou，1992，Plant Journal 2275-281；Shimamoto，1994，Current OpinionBiotechnology 5158-162；Vasil等，1992，Bio/Technology 10667-674)進行粒子轟擊(轉化DNA包被的顯微金或鎢粒子)，加農桿菌方法。用於單子葉植物轉化的可選方法基於Omirulleh等，1993，Plant Molecular Biology 21415-428所述的原生質體轉化。
轉化之後，根據本領域熟知的方法選擇其中整合了表達構建體的轉化體並使其再生為完整的植物。
本發明還涉及生產本發明的多肽的方法，包含(a)在有利於生產所述多肽的條件下，培養包含編碼本發明多肽的核酸序列的轉基因植物或植物細胞，所述多肽具有蛋白酶活性；和(b)回收所述多肽。
動物本發明還涉及轉基因非人動物及產品，或其部分，其例子為例如奶和血液、器官、肉、以及動物細胞。在例如哺乳動物細胞中表達蛋白質的技術是本領域已知的，參見，例如the handbook Protein ExpressionA PracticalApproach，Higgins and Hames(eds)，Oxford University Press(1999)，以及涉及基因轉錄、RNA處理、翻譯後處理的該系列的三本其他手冊。一般來講，為製備轉基因動物，用編碼本發明具有蛋白酶活性的多肽的核酸序列轉化所選動物的選定細胞來表達生產該多肽。可以從動物例如雌性動物的奶中回收多肽，或者多肽的表達可能對動物自身是有利的，例如幫助動物消化。在下面標題為動物飼料的部分提到了動物的例子。
為了生產轉基因動物以從動物的奶中回收蛋白酶，可以將編碼蛋白酶的基因插入所述動物的受精卵，例如通過使用含有適當的奶蛋白啟動子和編碼蛋白酶的基因的轉基因表達載體來實現。將轉基因表達載體微注射到受精卵，優選永久整合至染色體。一旦卵開始生長分裂，就將潛在的胚胎植入代孕母親，並鑑定攜帶有轉化基因的動物。可以通過傳統的飼養方法繁殖所得的動物。可以從動物的奶中純化多肽，參見，例如Meade，H.M.等(1999)Expression of recombinant proteins in the milk of transgenic animals，Gene expression systemsUsing nature for the art of expression.J.M.Fernandezand J.P.Hoeffler(eds.)，Academic Press。
在可選方案中，為了生產在其體細胞和/或生殖細胞基因組中攜帶包括異源轉基因構建體的核酸序列的轉基因非人動物，所述轉基因構建體包括編碼蛋白酶的轉基因，可以如WO 2000064247所公開的，將該轉基因與用於蛋白酶唾腺特異性表達的第一個調控序列可操作相連。
組合物在另一方面，本發明涉及包含本發明多肽的組合物。
可以依照本領域已知的方法製備多肽組合物，該多肽組合物可以是液體形式的或乾燥形式的組合物。例如，多肽組合物可以是顆粒或微小顆粒形式。可以依據本領域已知的方法把要包括在該組合物中的多肽穩定化。
下面給出了本發明的多肽或多肽組合物的優選用途的例子。
動物飼料本發明還涉及在動物飼料中使用本發明多肽的方法，也涉及包含本發明多肽的飼料組合物和飼料添加劑。
術語動物包括所有的動物，包括人。動物的例子為非反芻動物和反芻動物。反芻動物包括例如綿羊、山羊、馬、和牛例如肉牛、母牛、小牛犢。在特定實施方案中，動物是非反芻動物。非反芻動物包括單胃動物例如豬(pigs或swine)(包括但不限於豬仔、生長豬、和大母豬)；家禽例如火雞、鴨、雞(包括但不限於肉雞、蛋雞)；young calves；和魚(包括但不限於鮭魚、鱒魚、羅非魚、鯰魚、鯉魚)；和甲殼類(包括但不限於蝦(shrimp)、對蝦)。
術語飼料或者飼料組合物指任何適合或者希望動物攝入的化合物、製劑、混合物或者組合物。
在本發明的用途中，可以在食物之前、之後飼餵動物，或者與食物同時飼餵動物。後者是優選的。
在特定的實施方案中，蛋白酶添加到飼料中或者包括於飼料添加劑中的形式是明確的。「明確的」(well-defined)是指通過大小排阻層析測定，蛋白酶製劑的純度至少為50％。在其他的特定實施方案中，以此方法測定的蛋白酶製劑純度至少為60，70，80，85，88，90，92，94，或95％。
明確的蛋白酶製劑是有利的。例如，向飼料中添加正確劑量的蛋白酶而基本不受其他蛋白酶的幹擾或汙染是非常容易地。術語添加正確劑量尤其是指獲得一致或恆定結果的目的，和基於所需效果而優化劑量的能力。
然而，用於動物飼料用途時，蛋白酶沒有必要是那樣的純度；例如它可以包括其他的酶，這種情況下其可以稱為蛋白酶製劑。
蛋白酶製劑可以(a)直接添加到飼料中(直接用於蛋白質的處理過程)，或者(b)可以用於一種或多種中間組合物如飼料添加劑或者預混料的生產，隨後添加到飼料中(或者用於處理過程中)。上述的純度指最初的蛋白酶製劑的純度，無論其是用於上述的(a)或是(b)中。
特別是具有這種純度數量級的蛋白酶製劑是可以使用重組生產的方法獲得的，而使用傳統的發酵方法生產時，是不能夠如此容易獲得的，並且有非常高的批量(batch-to-batch)變異。
當然，這樣的蛋白酶製劑可以與其他的酶混合。
在特定實施方案中，用於本發明的用途的蛋白酶能夠溶解蛋白質。實施方案5中公開了測定溶解蛋白質的合適的測試方法。
蛋白質可以是動物蛋白質，例如肉和骨粉，和/或魚粉；或者可以是植物蛋白質。此處所用術語植物蛋白質指包括得自或源於植物的至少一種蛋白質的任何化合物、組合物、製劑或混合物，包括改造的蛋白質和蛋白質衍生物。在特定實施方案中，植物蛋白質的蛋白質含量至少為10，20，30，40，50，或60％(w/w)。
植物蛋白質可以得自植物蛋白質來源，例如豆類和穀類，例如豆科(Fabaceae，Leguminosae)、十字花科(Cruciferaceae)、藜科(Chenopodiaceae)和Poaceae植物家族的原料，例如大豆粉、羽扇豆(lupin)粉和油菜籽粉。
在特定實施方案中，植物蛋白質來源是一種或多種豆科植物例如大豆、羽扇豆、豌豆、或豆(bean)的原料。
在另外的特定實施方案中，植物蛋白質來源是一種或多種藜科植物例如甜菜、糖用甜菜、菠菜或奎奴亞藜(quinoa)的原料。
其他植物蛋白質來源的例子是油菜籽、向日葵籽、棉花籽和甘藍(cabbage)。
大豆是優選的植物蛋白質來源。
其他的植物蛋白質來源的例子是穀類例如大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉米(corn)、水稻、黑小麥和高粱。
根據本發明用至少一種本發明的蛋白酶對蛋白質的處理使蛋白質的溶解增強。
下面是在單胃動物體外模型中，能夠用本發明的蛋白酶得到的溶解蛋白質％的例子相對於空白為至少101％、或者至少102％，103％，104％，105％，106％，107％。用實施方案5的單胃動物體外模型測定溶解蛋白質的百分數。術語蛋白質的溶解意思基本上指使蛋白質成為溶液。這樣的溶解可以歸因於蛋白質從常見複合天然組合物如飼料的其他成分中的釋放，這種釋放由蛋白酶介導。
在另外的特定實施方案中，用於根據本發明的用途中的蛋白酶能夠增加可消化蛋白質的量。下面是在單胃動物體外模型中，能夠用本發明的蛋白酶得到的已消化的或可消化的蛋白質％的例子相對於空白來說，至少為101％，或者至少為102％。用實施方案5的體外模型測定已消化的或可消化的蛋白質的百分數。
在其他的特定實施方案中，用於本發明的用途中的蛋白酶能夠提高蛋白質的水解程度(DH)。在特定實施方案中，水解程度相對於空白至少為101％，102％，103％，104％，或者105％。水解程度由實施方案5的體外模型測定。
在本發明(預)處理方法的特定實施方案中，所述的蛋白酶影響(或作用於、或發揮其溶解作用)蛋白質或蛋白質來源。為達到此目的，典型地，將蛋白質或蛋白質來源懸浮於溶劑，例如水溶劑如水，並且根據所述酶的特徵調整pH和溫度。例如處理可以在當前蛋白酶能夠發揮其至少40％，50％，60％，70％，80％或90％活性的pH值下進行。同樣，例如處理可以在當前蛋白酶能夠發揮其至少40％，50％，60％，70％，80％或90％活性的溫度下進行。上述的活性百分數是相對於最大活性而言的。使酶反應持續至得到所需結果為止，此後可以通過將酶滅活，如通過熱處理步驟來終止酶反應，也可不終止。
在本發明處理方法的特定實施方案中，蛋白酶作用是緩釋的，意思是，例如，蛋白酶加進了蛋白質或蛋白質來源，但其溶解作用可以說直至以後需要時才打開，此時建立了適當的溶解條件，或者滅活了任何的酶抑制劑，或者取消了已用於延遲酶作用的任何其他方式。
在一個實施方案中，所述處理是對動物飼料的或用於動物飼料的蛋白質的預處理。
術語改善動物飼料的營養價值意思是改善蛋白質的可用性和/或可消化性，由此使來自食物成分的蛋白質提取物增加，得到更高的蛋白質產量，蛋白質降解增強和/或蛋白質利用率提高。因此提高了飼料的營養價值，動物的性狀如生長率和/或增重量(weight gain)和/或飼料轉化率(例如，攝取的飼料與增重量的對比)得到提高。
在特定實施方案中，飼料轉化率提高至少1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％或10％。在另外的特定實施方案中，增重量提高至少2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％或11％。這些數字相對於沒有添加蛋白酶的對照實驗。
可以如EEC(1986)Directive de la Commission du 9 avril 1986 fixant laméthode de calcul de la valeur énérgetique des aliments composés destinés àlavolaille.Journal Officiel des Communautés Européennes，L130，53-54中所述計算飼料轉化率(FCR)和增重量。
可以將蛋白酶以任何形式加入飼料，可以是相對純的蛋白酶，或者是與其他要添加到動物飼料的成分一起的混合物，例如，以飼料添加劑的形式，例如所謂的動物飼料預混料。
另一方面，本發明涉及用於動物飼料的組合物，例如動物飼料，和動物飼料添加劑，例如預混料。
除了本發明的蛋白酶，本發明的動物飼料添加劑還包含至少一種脂溶性維生素，和/或至少一種水溶性維生素，和/或至少一種微量礦質元素。飼料添加劑也可以包含至少一種大量礦質元素。
另外，可選地，飼料添加劑成分為色素製劑，例如，類胡蘿蔔素如β-胡蘿蔔素、蝦青素(astaxanthin)、葉黃素(lutein)；芳香化合物；穩定劑；抗菌肽；多聚不飽和脂肪酸；活性氧生成物質(species)；和/或選自澱粉酶，例如α-澱粉酶(EC 3.2.1.1)，肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC 3.4.-.-)，磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4或EC 3.2.1.6)的至少一種其他酶。
在特定實施方案中，這些其他酶是明確的(如上述針對蛋白酶製劑所定義的)。
抗菌肽的例子(AMP’s)為CAP18、Leucocin A、Tritrpticin、Protegrin-1、死亡肽(Thanstin)、防衛肽(Defensin)、乳鐵蛋白(Lactoferrin)、乳鐵蛋白肽(Lactoferricin)、和Ovispirin例如Novispirin(Robert Lehrer，2000)、Plectasins、和Statins，包括WO 03/044049和WO 03/048148中公開的化合物和多肽，以及保留抗菌活性的上述肽的變異體或片段。
抗真菌多肽(AFP’s)的例子為WO 94/01459和WO 02/090384中所公開的Aspergillus giganteus和黑麴黴肽，以及其保留抗真菌活性的變異體和片段。
多聚不飽和脂肪酸的例子為C18，C20和C22多聚不飽和脂肪酸，例如花生四烯酸、二十二碳六烯酸(docosohexaenoic acid)、二十碳五烯酸和γ-亞麻酸。
活性氧生成物質的例子是化學藥品例如過硼酸鹽(perborate)、過硫酸鹽(persulphate)、或者過碳酸鹽(percarbonate)；和酶例如氧化酶、加氧酶或者合酶(syntethase)。
常見脂溶性和水溶性維生素，以及微量礦質元素構成欲往飼料中添加的所謂預混料的一部分，而大量礦質元素通常單獨添加到飼料中。富含本發明的蛋白酶的預混料是本發明的動物飼料添加劑的例子。
在特定的實施方案中，要添加到動物食物或飼料中的本發明的動物飼料添加劑在0.01至10.0％水平，更特別地在0.05至5.0％；或0.2至1.0％(％指g添加劑每100g飼料)。在預混料中尤其如此。
下面是這些成分實例的非排除性清單脂溶性維生素的例子為維生素A、維生素D3、維生素E、和維生素K、例如維生素K3。
水溶性維生素的例子為維生素B12、生物素和膽鹼、維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸、葉酸和泛酸鹽(panthothenate)例如Ca-D-泛酸。
微量礦質元素的例子為錳、鋅、鐵、銅、碘、硒和鈷。
大量礦質元素的例子為鈣、磷和鈉。
WO 01/58275的表A列出了對這些成分的營養需求(以家禽和仔豬/豬為例)。營養需求意思是應當在食物中提供指定濃度的這些成分。
可選地，本發明的動物飼料添加劑包含WO 01/58275的表A中列出的單一成分中的至少一種。至少一種指兩者之一、一種或多種、一種、或兩種、或三種、或四種等等，直至所有13種，或者直至所有15種單一成分。更特別地，這種至少一種單一成分在本發明添加劑中的量提供表A第四欄、或第五欄、或第六欄所示範圍之內的飼料中濃度。
本發明還涉及動物飼料組合物。動物飼料組合物或食物具有相關高的蛋白質含量。家禽和豬食物可以WO 01/58275的表B第2-3欄所示為特徵。魚食物可以表B第4欄所示為特徵。另外，這樣的魚食物通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。WO 01/58275相應於US 09/77334，此處一併作為參考。
根據本發明的動物飼料組合物含有50-800g/kg的粗蛋白，另外還包括至少一種此處所要求的蛋白酶。
此外，或者可選地(對於上述指定的粗蛋白含量)，本發明的動物飼料組合物含有10-30MJ/kg的可代謝能量；和/或0.1-200g/kg的鈣；和/或0.1-200g/kg的可用磷；和/或0.1-100g/kg甲硫氨酸；和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸；和/或0.5-50g/kg的賴氨酸。
在特定實施方案中，可代謝能量、粗蛋白、鈣、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸、和/或賴氨酸的含量在WO 01/58275(R.2-5)的表B中2，3，4或5中任意一個範圍內。
以氮(N)乘以因數6.25來計算粗蛋白，例如，粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)x6.25。以Kjeldahl法(A.O.A.C.，1984，Official Methods of Analysis 14th ed.，Association of Official Analytical Chemists，Washington DC)測定氮含量。
可以以NRC publication Nutrient requirements in swine，ninth revisededition 1988，subcommittee on swine nutrition，committee on animal nutrition，board of agriculture，national research council.National Academy Press，Washington，D.C.，pp.2-6，and the European Table of Energy Values for PoultryFeed-stuffs，Spelderholt centre for poultry research and extension，7361 DABeekbergen，The Netherlands.Grafisch bedrijf Ponsen looijen bv，Wageningen.ISBN 90-71463-12-5為基礎計算可代謝能量。
以飼料表例如Veevoedertabel 1997，gegevens over chemischesamenstelling，verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen，CentralVeevoederbureau，Runderweg 6，8219 pk Lelystad.ISBN 90-72839-13-7為基礎計算完全動物食物中鈣、可用磷和胺基酸的含量。
在特定實施方案中，本發明的動物飼料組合物至少包含一種上述定義的蛋白質或蛋白質來源。也可以包含動物蛋白，例如肉和骨粉，和/或魚粉，典型地，用量為0-25％。
在另外的特定實施方案中，本發明的動物飼料組合物包含0-80％的玉米；和/或0-80％的高粱；和/或0-70％的小麥；和/或0-70％的大麥；和/或0-30％的燕麥；和/或0-40％的大豆粉；和/或0-25％的魚粉；和/或0-25％的肉和骨粉；和/或0-20％的乳清。
動物食物可以製成例如糊狀飼料(非顆粒狀)或粒狀(pelleted)飼料。典型地，混合磨碎的飼料-原料，按照對所述物種的說明加入足夠量的基本維生素和礦質元素。酶可以以固體或液體酶製劑的方式加入。例如，固體酶製劑典型地在混合步驟之前或混合步驟中加入；液體酶製劑典型地以制粒步驟之後加入。也可以將酶加至飼料添加劑或者預混料中。
食物中的最終酶濃度在0.01-200mg酶蛋白每kg食物的範圍內，例如在0.5-25mg酶蛋白每kg動物食物的範圍內。當然，要以有效量使用蛋白酶，例如，足夠增強飼料的溶解性和/或提高其營養價值的用量。目前考慮以一個或多個下述的用量(劑量範圍)加入酶0.01-200；0.01-100；0.5-100；1-50；5-100；10-100；0.05-50；或者0.10-10-所有這些範圍均為mg蛋白酶蛋白每kg飼料(ppm)。
為了測定mg酶蛋白每kg飼料，從飼料組合物中純化蛋白酶，用相關性測試(參見下面的蛋白酶活性，底物，和測試)測定純化蛋白酶的特異活性。這樣的飼料組合物的蛋白酶活性也用同樣的測試方法測定，以這兩個測定為基礎，來計算以mg酶蛋白每kg飼料計的劑量。
使用同樣的方法來測定飼料添加劑中的mg酶蛋白。當然，如果可以獲得用於製備飼料添加劑或者飼料的蛋白酶，就由該樣品測定特異活性(無需從飼料組合物或添加劑中純化蛋白酶)。
下面的實施方案進一步描述本發明，不應將其解釋為對本發明的範圍的限定。
洗滌劑組合物本發明的蛋白酶可以添加到洗滌劑組合物中，這樣就成為洗滌劑組合物的成分。
本發明的洗滌劑組合物可以製成例如手洗或機洗洗滌劑組合物，其包括適合於玷汙織物預處理的洗滌添加劑組合物和漂洗加入的織物軟化劑組合物，或者可以製成用於常規家用物品硬表面清洗操作的洗滌劑組合物，或者可以製成用於手或機器洗碗盤操作的洗滌劑組合物。
在特定方面，本發明提供了包含本發明的蛋白酶的洗滌劑添加劑。洗滌劑添加劑以及洗滌劑組合物可以包含一種或多種其他的酶，例如另一種蛋白酶，如源於芽孢桿菌的鹼性蛋白酶、脂肪酶、角質酶、澱粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、和/或過氧化物酶。
一般來講，所選擇的酶的特性應與選擇的洗滌劑相容，(例如，最適pH，與其他酶學和非酶學組分的相容性等)，並且酶應以有效量存在。
合適的脂肪酶包括細菌或真菌來源的脂肪酶。包括化學修飾的或蛋白質工程化變異體。有用的脂肪酶的例子包括來自腐質黴(同義詞Thermomyces)的脂肪酶，例如EP 258068和EP 305216所述的來自胎毛腐質黴(H.lanuginosa)(T.lanuginosus)或者WO 96/13580所述的來自H.insolens的脂肪酶，假單胞菌脂肪酶，例如來自產鹼假單胞菌(P.alcaligenes)或者類產鹼假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218272)、P.cepacia(EP 331376)、施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)(GB 1,372,034)、螢光假單胞菌(P.fluorescens)、假單胞菌株系SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)的脂肪酶，芽孢桿菌脂肪酶，例如來自枯草芽孢桿菌(Dartois等，(1993)，Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP 64/744992)或者短小芽孢桿菌(B.pumilus)(WO91/16422)的脂肪酶。其他的例子為例如WO 92/05249，WO 94/01541，EP407225，EP 260105，WO 95/35381，WO 96/00292，WO 95/30744，WO94/25578，WO 95/14783，WO 95/22615，WO 97/04079和WO 97/07202中描述的脂肪酶變異體。商業上可獲得的優選脂肪酶為LipolaseTM和LipolaseUltraTM(Novozymes A/S)。
合適的澱粉酶(α-和/或β-)包括細菌或真菌來源的澱粉酶。包括化學修飾的或者蛋白質工程化變異體。澱粉酶包括，例如，由芽孢桿菌例如地衣芽孢桿菌的特定株系獲得的α-澱粉酶，GB 1,296,839中有更為詳細的描述。有用的澱粉酶的例子為WO 94/02597，WO 94/18314，WO 95/26397，WO96/23873，WO 97/43424，WO 00/60060，和WO 01/66712中描述的變異體，尤其是在下述位置具有一個或多個取代的變異體15，23，105，106，124，128，133，154，156，181，188，190，197，202，208，209，243，264，304，305，391，408，和444。商業上可獲得的澱粉酶為NatalaseTM，SupramylTM，StainzymeTM，DuramylTM，TermamylTM，FungamylTM和BANTM(Novozymes A/S)，RapidaseTM和PurastarTM(來自Genencor International Inc.)。
合適的纖維素酶包括細菌或真菌來源的纖維素酶。包括化學修飾的或者蛋白質工程化變異體。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質黴屬、鐮刀黴屬、梭孢殼屬(Thielavia)、頂孢黴屬的纖維素酶，例如US 4,435,307，US 5,648,263，US 5,691,178，US 5,776,757和WO 89/09259中公開的從Humicola insolens、嗜熱黃黴(Myceliophthora thermophila)和尖孢鐮刀黴(Fusarium oxysporum)生產的真菌纖維素酶。尤其適合的纖維素酶是具有顏色養護(care)作用的鹼性或中性纖維素酶。EP 0 495257，EP 531372，WO96/11262，WO 96/29397，WO 98/08940中公開了這樣的纖維素酶的例子。其他的例子為纖維素酶變異體，例如WO 94/07998，EP 0 531 315，US 5,457,046，US 5,686,593，US 5,763,254，WO 95/24471，WO 98/12307和WO 99/01544中所描述的。商業上可獲得的纖維素酶包括CelluzymeTM，和CarezymeTM(Novozymes A/S)，ClazinaseTM，和Puradax HATM(Genencor Intenational Inc.)，以及KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
合適的過氧化物酶/氧化酶包括植物、細菌或真菌來源的過氧化物酶/氧化酶。包括化學修飾的或者蛋白質工程化變異體。有用的過氧化物酶的例子包括WO 93/24618，WO 95/10602，和WO 98/15257中所描述的來自鬼傘(Coprinus)，例如灰蓋鬼傘(C.cinereus)的過氧化物酶及其變異體。商業上可獲得的過氧化物酶包括GuardzymeTM(Novozymes)。
可以通過添加包含一種或多種酶的單獨的添加劑，或者通過添加包含所有這些酶的組合添加劑將洗滌劑酶加入洗滌劑組合物中。本發明的洗滌劑添加劑，例如單獨的或組合的添加劑，可以製成例如顆粒、液體、漿等。優選的洗滌劑添加劑製劑(formulations)為顆粒尤其是無粉塵顆粒、液體尤其是穩定化液體、或者漿。
可以如US 4,106,991和4,661,452中所述生產無粉塵顆粒，可選地，用本領域已知的方法包被。蠟樣的包被材料的例子為具有1000至20000平均摩爾重量的聚氧化乙烯產品(聚乙二醇，PEG)；具有16至50個環氧乙烷單位的乙氧基化壬基苯酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇包含12至20個碳原子，且其具有15至80個環氧乙烷單位；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的單甘油酯、甘油二酯以及甘油三酸酯。GB 1483591給出了適合於流化床技術使用的膜形成包被材料。可以根據已建立的方法通過例如加入多羥基化合物如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或者硼酸將液態酶製品穩定化。可以根據EP 238216中公開的方法製備被保護的酶。
本發明的洗滌劑組合物可以為任何方便的形式，例如，條、藥片、粉末、顆粒、糊或液體。液體洗滌劑可以是水化的，典型地包含直至70％的水以及0-30％的有機溶劑，或者是非水化的。
洗滌劑組合物包含一種或多種的表面活性劑，其可以是不帶離子的包括半極性的和/或陰離子的和/或陽離子的和/或兩性離子的。表面活性劑典型地以0.1％至60％的重量水平存在。
當其中包含陰離子表面活性劑時，通常洗滌劑將包含約1％至約40％的陰離子表面活性劑，例如烷基苯磺酸鹽、α-烯烴磺酸鹽(olefinsulfonate)、烷基磺酸鹽(脂肪酸磺酸鹽)、醇乙氧基硫酸酯、二級烷基磺酸(secondaryalkanesulfonate)、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基或鏈烯基琥珀酸或者肥皂。
當其中包含不帶離子的表面活性劑時，通常洗滌劑將包含約0.2％至約40％的不帶離子的表面活性劑，例如醇乙氧基酯類化合物、壬基苯酚乙氧基酯類化合物(nonylphenol ethoxylate)、烷基糖苷(alkylpolyglycoside)、烷基二甲基氨基氧化物(alkyldimethylamineoxide)、乙氧基脂肪酸單乙醇胺、脂肪酸單乙醇胺、多羥基烷基脂肪酸胺、或者葡糖胺的N-醯基N-烷基衍生物(「glucamides」)。
洗滌劑可以包含0-65％的洗滌劑助洗劑或者複合試劑如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、二乙烯三胺五乙酸、烷基或鏈烯基琥珀酸、可溶性矽酸鹽或層狀矽酸鹽(例如，Hoechst的SKS-6)。
洗滌劑可以包含一種或多種多聚體。例子為羰甲基纖維素、多聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯基吡啶N氧化物(poly(vinylpyridine-N-oxide))、聚乙烯基咪唑、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、馬來酸/丙烯酸共聚物和月桂酸甲基丙烯酸酯/丙烯酸共聚物。
洗滌劑可以包含漂白系統，漂白系統可以包含H2O2源例如過硼酸鹽或者過碳酸鹽，其可以與過酸形成漂白激活劑例如四乙醯乙二胺或壬醯氧苯磺酸鹽(nonanoyloxybenzenesulfonate)組合。可選地，漂白系統可以包含例如氨、亞胺、碸類型的過氧酸。
可以用傳統的穩定化試劑來使本發明的洗滌劑組合物的酶穩定化，穩定化試劑為例如，多羥基化合物如丙二醇或丙三醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸，或者為硼酸衍生物，例如芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物如4-甲醯基苯基硼酸，可以按照例如WO 92/19709和WO 92/19708所述方法製備組合物。
洗滌劑也可以包含其他的傳統洗滌劑成分，例如織物護理劑，包括粘土(clays)、增泡劑、抑泡劑、防腐劑、汙垢懸浮劑、防汙垢再沉積劑、染料、殺菌劑、螢光增白劑、助水溶劑(hydrotropes)、防失澤劑、或香料。
目前，預期可以以相當於0.01-100mg酶蛋白每升洗滌水，優選0.05-5mg酶蛋白每升洗滌水，尤其是0.1-1mg酶蛋白每升洗滌水的量向洗滌劑組合物中加入任何的酶，尤其是本發明的酶。
另外，本發明的酶可以加至WO 97/07202所公開的洗滌劑配方中。
生物材料的保藏下述由2001年在丹麥收集的土壤樣品中分離的生物材料，已經按照布達佩斯條約的條款保藏於德國微生物與細胞培養物保藏中心，MascheroderWeg 1b，D-38124 Braunschweig，並給出下面的保藏號保藏物 保藏號 保藏日期Nocardiopsis albaDSM 15647May 30，2003該株系的保藏保證了在本專利申請未決期間，由專利與商標專員依據37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122所授權的人能夠得到該株系。該保藏物為所保藏株系的基本上純化的培養物。此保藏物可以在提交了這些申請的副本或其後續文本的國家依據該外國專利法的要求獲得。然而，應當理解，保藏物的獲得並不構成對實施本發明的許可，實施本發明將侵犯由政府行為所授予的專利權。
由於本發明的實施方案是要作為本發明幾個方面的示例，因而本發明此處的描述和權利要求並不是要以此處公開的特定實施方案來限定其範圍。任何等同的實施方案將被認為在本發明的範圍之內。事實上，對本發明除此處所列出和描述的之外，通過前面的描述，很多的修改對於本領域技術人員來講都將是很明顯的。這種修改也將落在所附的權利要求的範圍之內。對於有衝突的情況，將由本發明的說明書包括定義來解釋。
此處引用的多個參考文獻，其公開的內容整體一併作為參考。
實施例實施例1源於白色擬諾卡菌DSM 15647的蛋白酶的克隆與表達試劑與培養基LB瓊脂 Ausubel，F.M.等(eds.)「Current protocols in MolecularBiology」.John Wiley and Sons，1995中所述LB-PG瓊脂 補充了0.5％葡萄糖和0.05M磷酸鉀，pH7.0的LB瓊脂PS-1 10％蔗糖，4％大豆粉，1％Na3PO4-12H2O，0.5％CaCO3，和0.01％pluronic acidTE 10mM Tris-HCl，pH7.41mM EDTA，pH8.0TELTE-緩衝液中50mg/ml的Lysozym硫氰酸鹽 5M硫氰酸鈲(guanidium thiocyanate)100mM EDTA0.6％w/v N-月桂醇肌氨酸，鈉鹽60g硫氰酸鹽，20ml 0.5M EDTA，pH8.0，20ml H2O在65℃溶解。冷卻至室溫(RT)，加入0.6g N-月桂醇肌氨酸。加水至100ml，用0.2μ消毒的過濾器過濾。
NH4Ac7.5M CH3COONH4TERTE-buffer緩衝液中1μg/ml的Rnase ACIA氯仿/異戊醇24∶1試驗程序SEQ ID NO1是編碼來自Nocardiopsis alba DSM 15647的蛋白酶前體形式的DNA序列。502-1065位核苷對應於成熟肽編碼部分。
SEQ ID NO2是由SEQ ID NO1推導出來的胺基酸序列。-167至-1位胺基酸是前肽，胺基酸1至188是成熟肽。
SEQ ID NO1克隆野生型在收穫前於下述培養基中30℃生長3天Trypticase 20g酵母提取物 5g氯化鐵 6mg硫酸鎂 15mg蒸餾水加至 1000ml通過加入碳酸鈉將pH調至9按照以下方法分離Nocardiopsis alba DSM 15647的基因組DNA收穫1.5ml培養物，重懸於100μl TEL。37℃保溫30min。
加入500μl硫氰酸鹽緩衝液於室溫放置10min。
加入250μl NH4Ac置於冰上10min。
加入500ul CIA，混合。
轉至微型離心管離心10min。
將上清轉至新的Eppendorf管，加入0.54體積的冰凍異丙醇。徹底混合。用70％EtOH旋轉衝洗DNA顆粒。
於100μl TER中重懸基因組DNA。
基因組DNA用作PCR擴增的模板，以下述的SEQ ID NO.3和4為引物。在0.7％瓊脂糖凝膠上分離PCR片段。
引物14215』-GTT CAT CGA TCG CAT CGG CTG CGA CCG GCC CCC TCCCCC AGT C-3』(SEQ ID NO3)16045』-GCG GAT CCT ATC AGG TGC GCA GGG TCA GAC C-3』(SEQ ID NO4)將消化與純化的PCR片段連接於Cla I和BamH I消化的質粒pDG268NeoMCS-PramyQ/PrcryIII/cryIIIAstab/Sav(US Patent No.5,955,310)上。
將連接所得的混合物轉化至E.coli TOP10F』(Invitrogen BV，TheNetherlands)，選擇若干克隆用於微量製備(miniprep)(QIAprep spin，QIAGENGmbH，Germany)。轉化前，檢查純化的質粒，用破壞的apr、npr和pel基因(Diderichsen等，(1990)，J.Bacteriol.，172，4315-4321)將其插入源於枯草芽孢桿菌DN 1885的枯草芽孢桿菌株系。基因的破壞基本上按照″Bacillus subtilisand other Gram-Positive Bacteria，″American Society for Microbiology，p.618，eds.A.L.Sonenshein，J.A.Hoch and Richard Losick(1993)所述方法進行。將轉化的細胞在添加了6μg/ml氯黴素的1％脫脂乳LB-PG瓊脂板上劃平板。劃平板的細胞於37℃保溫過夜，通過周圍的空白區(clearing)鑑定包含蛋白酶的克隆。選擇蛋白酶陽性克隆，通過DNA序列分析從表達構建體中確定所表達的酶的編碼序列。
發酵將上述轉化的枯草芽孢桿菌宿主細胞置於500ml帶隔板的Erlenmeyer瓶中，Erlenmeyer瓶中含有添加了6μg/ml氯黴素的100ml PS-1培養基，將其放在旋轉搖床(250r.p.m.)上，37℃發酵16小時，再於26℃額外發酵4天。
實施例2來自Nocardiopsis alba DSM 15647的蛋白酶的純化與鑑定蛋白酶測試1)pNA測試pNA底物 Suc-AAPF-pNA(Bachem L-1400).
溫度室溫(25℃)測試緩衝液 100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100用HCl或NaOH將pH-值調整至2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，和12.0。
將20μl蛋白酶(稀釋於0.01％Triton X-100中)與100μl測試緩衝液混合。加入100μl pNA底物(50mg溶解於1.0ml DMSO，進一步用0.01％Triton X-100稀釋45x)以開始測試。監測OD405的增強，作為蛋白酶活性的測量值。
2)Protazyme AK測試底物Protazyme AK藥片(交聯並染色的酪蛋白；來自Megazyme)溫度受控的溫度(測試溫度)
測試緩衝液100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mMCABS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100用HCl或NaOH將pH-值調整至2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0和11.0。
輕微攪動，使Protazyme AK藥片懸浮於2.0ml 0.01％Triton X-100中。在Eppendorf管中將500μl的此懸浮液與500μl測試緩衝液混合，置於冰上。加入20μl蛋白酶樣品(稀釋於0.01％Triton X-100中)。將Eppendorf管移至Eppendorf熱混合器以開始測試，其中Eppendorf混合器設定在測試溫度。在Eppendorf熱混合器的最高搖動速率(1400rpm)將Eppendorf管保溫15分鐘。將Eppendorf管轉至冰浴，以終止保溫。然後Eppendorf管在冰凍離心機中離心幾分鐘，將200μl的上層轉至微量滴定盤(microtiter plate)。OD650處讀數作為蛋白酶活性測量值。測試中包括空白緩衝液(buffer blind)(代替酶)。
離心(20000xg，20min)實施例1中的蛋白酶發酵物，從沉澱物上小心移走上清。用Seitz EKS盤過濾合併的上清，以除去殘留的擬諾卡氏菌細胞。將EKS濾液轉至G25 sephadex柱上的50mM H3BO3，5mM琥珀酸，1mMCaCl2，pH為7的溶液，得到混濁的溶液。再次用Seitz EKS盤過濾以除去混濁物。將澄清的濾液置於相同緩衝液平衡過的桿菌肽(bacitracin)矽膠柱。用平衡緩衝液大致衝洗柱子後，用100mM H3BO3，10mM琥珀酸，2mM CaCl2，1M NaCl，25％異丙醇，pH7的溶液逐步洗脫蛋白酶。將桿菌肽洗脫液轉至G25 sephadex柱上的50mM H3BO3，5mM琥珀酸，1mM CaCl2，pH為7的溶液，在配備有5000Da臨界點膜的Amicon濃縮室中超濾濃縮至最小體積。將濃縮的酶置於在100mM H3BO3，10mM琥珀酸，2mM CaCl2，200mM NaCl，pH為7的溶液中平衡過的Superdex 75大小排阻層析柱上，用相同的緩衝液洗脫。用柱子上的組分分析蛋白酶活性(37℃，pH9條件下用Protazyme AK測試分析)，用SDS-PAGE進一步分析活性組分。將在考馬斯染色的SDS-PAGE膠上僅看到一個條帶的組分取下來，作為純化的製品，用於進一步的鑑定。
pH-活性，pH-穩定性，以及溫度-活性用pNA測試獲得pH-活性譜以及pH-穩定性譜。對pH-穩定性譜，將蛋白酶在測試緩衝液中稀釋10x，於37℃保溫2小時。保溫後，在測試殘餘活性之前，將蛋白酶樣品稀釋於pH9的測試緩衝液中，使之轉變為相同的pH-pH9。
Protazyme AK測試用於獲得pH9時的溫度-活性譜。結果列於下面的表1-3。
表1pH-活性譜

表2pH-穩定性譜

表3溫度活性譜

發現蛋白酶被苯基甲基磺醯氟所抑制。其相對分子量經SDS-PAGE測定為Mr＝19kDa。
差示掃描量熱法(DSC)DSC用於測定pH7.0時源於Nocardiopsis alba和Nocardiopsis sp.NRRL18262的蛋白酶的溫度穩定性。純化的蛋白酶置於10mM磷酸鈉，50mM氯化鈉，pH7.0的溶液中4℃滲析過夜，在VP-DSC裝置(Micro Cal)上以1.5℃/min的恆定掃描速率從20至100℃測定。用MicroCal Origin軟體處理數據。
所得的變性或解鏈溫度Tm為對於本發明源於Nocardiopsis alba的蛋白酶為78.3℃；對於源於Nocardiopsis sp.NRRL 18262的蛋白酶為76.5℃。
實施例3源於Nocardiopsis alba的蛋白酶的特異活性用實施例2所述的純化蛋白酶製品測定特異活性。SDS-PAGE(按照WO01/58275中實施例2A所述方法測定)分析顯示製品的純度在95％以上。將蛋白酶樣品一分為二。一部分通過胺基酸分析來分析其蛋白質含量，另一部分用於分析蛋白酶活性。
胺基酸分析(AAA)/(mg/ml)
用酸水解蛋白酶樣品的肽鍵，然後在Biochrom 20 Plus胺基酸分析儀上根據生產商的說明分離並量化釋放的胺基酸，該分析儀在商業上可從Bie Berntsen A/S，Sandbaekvej 5-7，DK-2610 Roedovre，Denmark獲得。將蛋白質樣品於真空離心機中乾燥，溶解於18.5％(體積/體積)HCl+0.1％(體積/體積)苯酚中，110℃保溫16小時，用於酸水解。保溫之後，樣品於真空離心機中再次乾燥，溶解於上樣緩衝液(0.2M檸檬酸鈉，pH2.2)，上樣到Biochrom 20Plus胺基酸分析儀。
為了進行量化，將水解的樣品上樣到鈉形式的陽離子交換樹脂UltroPacno.8上，該柱子可通過商業途徑從Bie Berntsen A/S獲得，商品目錄號為no.80-2104-15。根據生產商的上述說明，使改變pH(pH1至pH8)和離子強度的緩衝液通過柱子，分離不同的胺基酸。同樣根據生產商的說明，精確地控制柱子溫度(從53℃到92℃再回到53℃)，以確保所需的分離。將柱子洗脫液與茚三酮試劑(Bie Berntsen，商品目錄號no.80-2038-07)混合，使所得混合物通過胺基酸分析儀的高溫反應盤管。在反應盤管中，茚三酮與胺基酸反應形成有色化合物，有色化合物的量直接與所存在的胺基酸的量成比例。
蛋白酶活性測試(AU/ml)變性的血紅蛋白(在6.7mM KH2PO4/NaOH緩衝液中佔0.65％(w/w)，pH7.50)於25℃用蛋白酶降解10分鐘，用三氯乙酸(TCA)沉澱未消化的血紅蛋白，過濾除去。用Folin Ciocalteu’s苯酚試劑測定濾液中的TCA可溶性血紅蛋白降解產物，有幾種胺基酸會顯示藍色。參考ALCALASETM標準測量並確定活性單位(AU)，ALCALASETM標準可請求Novozymes A/S，Krogshoejvej 36，DK-2880 Bagsvaerd，Denmark(測試號為no.EB-SM-0349.02/01)提供。
按下述計算特異活性特異活性(AU/g)＝(活性(AU/ml)/AAA(mg/ml))×1000(mg/g)源於Nocardiopsis alba DSM 15647的蛋白酶的特異活性為53.5AU/g，與之對照，源於Nocardiopsis sp.NRRL 18262的蛋白酶的特異活性為38.3AU/g。
實施例4蛋白酶L1a如實施例1所述，使Nocardiopsis dassonvillei subsp.dassonvillei DSM43235生長於野生型胰蛋白酶培養基，分離基因組DNA。
用下述引物1424和1485在基因組DNA上擴增成熟蛋白酶L1a前體的編碼序列(SEQ ID NO1的88-1143位核苷)引物1485(SEQ ID NO7)5′-gcttttagttcatcgatcgcatcggctgcgaccgtaccggccgagccag-3′引物1424(SEQ ID NO8)5′-ggagcggattgaacatgcgattactaaccggtcaccagggacagcc-3′用PCR手段將L1a多核苷酸在閱讀框中與編碼Sav信號肽(SEQ ID NO9)的異源DNA片段融合。
通過在枯草芽孢桿菌MB 1053宿主細胞基因組(WO 03/95658)上的同源重組合併基因(包括信號肽編碼部分)，構建了定名為Sav-L1a的枯草芽孢桿菌株系。在由地衣芽孢桿菌α-澱粉酶基因(amyL)啟動子、解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶基因(amyQ)啟動子和蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)cryIIIA啟動子包括穩定化序列組成的三倍啟動子系統(如WO 99/43835所述)的控制下表達基因。氯黴素乙醯轉移酶用作標記(如Diderichsen，B.；Poulsen，G.B.；Joergensen，S.T.；A useful cloning vector for Bacillus subtilis.Plasmid 30312(1993)中所述)。
按實施例1所述檢查了氯黴素抗性轉化體的蛋白酶活性，並選擇轉化體用於序列確定，然後同樣按照實施例1的方法發酵，只是於26℃下發酵6天。
離心培養物肉湯(20000xg，20min)，小心地將上清從沉澱上轉移走。將合併的上清通過Seitz EKS盤過濾，以除去芽孢桿菌宿主細胞的剩餘物質。將EKS濾液轉至G25 sephadex柱上的50mM H3BO3，5mM琥珀酸，1mMCaCl2，pH為7的溶液。從G25 sephadex柱向酶溶液加入固體硫酸銨，酶溶液中(NH4)2SO4的終濃度為1.6M。加入(NH4)2SO4期間用磁力攪拌器輕輕混合酶溶液，添加完成後繼續攪動30分鐘，使系統平衡。然後將酶溶液上樣至在100mM H3BO3，10mM琥珀酸，2mM CaCl2，1.6M(NH4)2SO4，pH為7的溶液中平衡過的Butyl Toyopearl柱。用平衡緩衝液徹底衝洗柱子後，在相同的緩衝液中用線性(NH4)2SO4梯度(1.6至0M)洗脫蛋白酶。取出含有蛋白酶的組分，轉至G25 sephadex柱上的20mM HEPES，pH為8的溶液，上樣至相同緩衝液平衡過的Q sepharose FF柱。用相同緩衝液徹底衝洗柱子後，在相同緩衝液中用線性NaCl梯度(0至0.5M)洗脫蛋白酶。用從柱子得到的組分分析蛋白酶活性(用Suc-AAPF-pNA測試，pH9)，進一步用SDS-PAGE分析活性組分。將僅有一個條帶的組分(用考馬斯染色的SDS-PAGE膠判斷)取下來，作為純化的製品用於進一步的鑑定。
L1a蛋白酶是α-裂解蛋白酶樣的酶(S1E肽酶家族，舊符號為S2A)，發現其被苯基甲基磺醯氟(PMSF)和鏈黴菌枯草桿菌蛋白酶抑制劑(SSI)所抑制。通過SDS-PAGE測定的其相對分子量為Mr＝22kDa。
按照實施例3所述方法測定的L1a蛋白酶的特異活性為49.8AU/g。
實施例5單胃動物體外測試結果在體外模型中測試了實施例2所述的純化蛋白酶刺激單胃動物消化的性能。特別地，測定了蛋白酶提高玉米/-SBM(玉米/-大豆粉)蛋白質溶解和消化的能力。體外系統由10個瓶子組成，先將瓶中的玉米/-SBM底物與HCl/胃蛋白酶一起保溫-刺激胃內消化-然後再與胰酶一起保溫-刺激腸內消化。胃內階段起始時在5個瓶子中加入蛋白酶，而其餘的五個瓶子作為空白。腸內保溫階段結束時，取出體外消化物樣品用於分析溶解和消化的蛋白質。
大致的體外消化程序

條件底物4g SBM，6g玉米(預混的)pH3.0 胃步驟/6.8-7.0腸步驟HCl0.105M，1.5小時(例如30min HCl-底物預混合)胃蛋白酶3000U/g食物1小時胰酶8mg/g食物4小時溫度40℃重複數n溶液0.39M NaOH0.105M HCl
0.105M HCl，每5ml含有6000U胃蛋白酶1M NaHCO3，每ml含有16mg胰酶125mM NaAc-緩衝液，pH6.0以A280的值和胺基酸序列(胺基酸組合物)為基礎，用S.C.Gill P.H.vonHippel，Analytical Biochemistry 182，319-326，(1989)中概述的原理計算蛋白酶蛋白(EP)的量。
實驗程序依據上述的概要。在1、2.5、和5.5小時時測量pH。6小時後終止保溫，取出30ml的樣品先放置在冰上，然後離心(10000xg，10min，4℃)。移出上清，-20℃保存。
通過膠過濾分析所有樣品中溶解的和消化的蛋白質的含量，並用OPA方法分析其水解程度(DH)。
用OPA-方法測定DH用基於比色方法的半自動微量滴定盤(Nielsen，PM.；Petersen，D.；Dambmann，C.Improved method for determining food protein degree ofhydrolysis.J.Food Sci.2001，66，642-646)測定不同樣品中蛋白質的水解程度。如下製備OPA試劑將7.620g十水四硼酸二鈉和200mg十二烷基硫酸鈉(SDS)溶於150ml去離子水中。試劑完全溶解後再繼續。將160mg 97％的鄰苯二醛(OPA)溶解於4ml乙醇。將OPA溶液定量轉移至上述溶液，用去離子水衝洗。在溶液中加入176mg 99％的二硫蘇糖醇(DTT)，用去離子水加至200ml。將50mg絲氨酸(Merck，Germany)溶解於500ml去離子水中製備絲氨酸標準(0.9516 meqv/l)。
通過將每個樣品稀釋至吸光值(280nm)約0.5來製備樣品溶液。通常，用自動Tecan稀釋臺(Mnnedorf，Switzerland)稀釋(100×)上清。所有其他的分光光度計讀數均在340nm進行，以去離子水為對照。將25μl樣品、標準和空白分配到微量滴定盤。將微量滴定盤插入iEMS MF讀數器(Labsystems，Finland)，自動分配200μl OPA試劑。測定吸光值前搖動微量滴定盤(2min；700rpm)。最後，計算DH。所有樣品的測定均進行五次。
估算溶解和消化的蛋白質通過膠過濾HPLC定量粗蛋白(CP)，以估算體外消化樣品的上清中溶解蛋白的含量。解凍上清，用0.45μm聚碳酸酯過濾器過濾，用H2O稀釋(1∶50，v/v)。稀釋的樣品用Superdex Peptide PE(7.5×300mm)膠過濾柱(Global)進行HPLC層析。用於等度洗脫的洗脫液為含有150mM NaCl的50mM磷酸鈉緩衝液(pH7.0)。每次洗脫的洗脫液總體積為26ml，流速為0.4ml/min。在214nm處記錄洗脫曲線，測定洗脫曲線下的總面積。為了由總面積估算蛋白質含量，用體外消化的參照玉米/-SBM樣品的系列稀釋製作校準曲線(R2＝0.9993)，其中玉米/-SBM樣品的總蛋白含量已知。此參照樣品中蛋白質的測定用Kjeldahl法(％氮的測定；A.O.A.C.(1984)Official Methods ofAnalysis 14th ed.，Washington DC)進行。
累加對應於具有1500道爾頓或以下分子量的肽和胺基酸的層析圖面積(Savoie，L.；Gauthier，S.F.Dialysis Cell For The In-vitro Measurement Of ProteinDigestibility.J.Food Sci.1986，51，494-498；Babinszky，L.；Van，D.M.J.M.；Boer，H.；Den，H.L.A.An In-vitro Method for Prediction of The Digestible CrudeProtein Content in Pig Feeds.J.Sci.Food Agr.1990，50，173-178；Boisen，S.；Eggum，B.O.Critical Evaluation of In-vitro Methods for Estimating Digestibilityin Simple-Stomach Animals.Nutrition Research Reviews 1991，4，141-162)來估算消化的蛋白質的含量。為測定1500道爾頓分界線，以細胞色素C(Boehringer，Germany)、aprotinin、gastrin I、和substance P(Sigma Aldrich.USA)作為分子量標準校準膠過濾柱。
以下表4和5列出的結果顯示，相對於空白而言，蛋白酶顯著地提高了可消化蛋白質的水平，以及水解程度。
表4水解程度(DH)

同一欄中的不同字母代表顯著差異(1-way ANOVA，Tukey-Kramer test，P＜0.05)。SD＝標準誤。％CV＝變異係數＝(SD/平均值)×100％表5溶解和消化的粗蛋白

同一欄中的不同字母代表顯著差異(1-way ANOVA，Tukey-Kramer test，P＜0.05)。SD＝標準誤。％CV＝變異係數＝(SD/平均值)×100％實施例6動物飼料與動物飼料添加劑按實施例2所述製備含蛋白酶的動物飼料添加劑，維生素與礦質元素預混料形式的動物飼料添加劑由下述表6所示組成。維生素和類胡蘿蔔素商業上可以從DSM Nutritional Products獲得。所有用量均以g/kg計。
表6預混料組合物

產蛋雞的食物中包括表6的預混料和下面表7中顯示的組合物。每種成分的量以均為％(w/w)。食物中L2a蛋白酶的含量為100mg蛋白酶蛋白每kg食物。
表7產蛋雞食物

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由受理局填寫

由國際局填寫

序列表110諾維信公司(Novozymes A/S)120蛋白酶13010476.204-WO1609170PatentIn version 3.221012111068212DNA213Nocardiopsis alba DSM 15647220
221CDS222(1)..(1065)220
221mat_peptide222(502)..(1065)4001gcg acc ggc ccc ctc ccc cag tcc ccc acc ccg gat gaa gcc gag45Ala Thr Gly Pro Leu Pro Gln Ser Pro Thr Pro Asp Glu Ala Glu-165-160-155gcc acc acc atg gtc gag gcc ctc cag cgc gac ctc ggc ctg tcc90Ala Thr Thr Met Val Glu Ala Leu Gln Arg Asp Leu Gly Leu Ser-150-145-140ccc tct cag gcc gac gag ctc ctc gag gcg cag gcc gag tcc ttc 135Pro Ser Gln Ala Asp Glu Leu Leu Glu Ala Gln Ala Glu Ser Phe-135-130-125gag atc gac gag gcc gcc acc gcg gcc gca gcc gac tcc tac ggc 180Glu Ile Asp Glu Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Asp Ser Tyr Gly-120-115-110ggc tcc atc ttc gac acc gac agc ctc acc ctg acc gtc ctg gtc acc 228Gly Ser Ile Phe Asp Thr Asp Ser Leu Thr Leu Thr Val Leu Val Thr-105-100-95gac gcc tcc gcc gtc gag gcg gtc gag gcc gcc ggc gcc gag gcc aag 276Asp Ala Ser Ala Val Glu Ala Val Glu Ala Ala Gly Ala Glu Ala Lys-90 -85 -80gtg gtc tcg cac ggc atg gag ggc ctg gag gag atc gtc gcc gac ctg 324Val Val Ser His Gly Met Glu Gly Leu Glu Glu Ile Val Ala Asp Leu-75 -70 -65 -60aac gcg gcc gac gct cag ccc ggc gtc gtg ggc tgg tac ccc gac atc 372Asn Ala Ala Asp Ala Gln Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Ile-55 -50 -45cac tcc gac acg gtc gtc ctc gag gtc ctc gag ggc tcc ggt gcc gac 420His Ser Asp Thr Val Val Leu Glu Val Leu Glu Gly Ser Gly Ala Asp-40 -35 -30gtg gac tcc ctg ctc gcc gac gcc ggt gtg gac acc gcc gac gtc aag 468Val Asp Ser Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Thr Ala Asp Val Lys-25 -20 -15gtg gag agc acc acc gag cag ccc gag ctg tac gcc gac atc atc ggc 516Val Glu Ser Thr Thr Glu Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile Gly-10 -5 -1 1 5
ggt ctc gcc tac acc atg ggt ggg cgc tgc tcg gtc ggc ttc gcg gcc 564Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala10 15 20acc aac gcc tcc ggc cag ccc ggg ttc gtc acc gcc ggc cac tgc ggc 612Thr Asn Ala Ser Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly25 30 35acc gtc ggc acc ccg gtc agc atc ggc aac ggc cag ggc gtc ttc gag 660Thr Val Gly Thr Pro Val Ser Ile Gly ASh Gly Gln Gly Val Phe Glu40 45 50cgt tcc gtc ttc ccc ggc aac gac tcc gcc ttc gtc cgc ggc acc tcg 708Arg Ser Val Phe Pro Gly ASh Asp Ser Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser55 60 65aac ttc acc ctg acc aac ctg gtc agc cgc tac aac acc ggt ggt tac 756Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Thr Gly Gly Tyr70 75 80 85gcg acc gtc tcc ggc tcc tcg cag gcg gcg atc ggc tcg cag atc tgc 804Ala Thr Val Ser Gly Ser Ser Gln Ala Ala Ile Gly Ser Gln Ile Cys90 95 100cgt tcc ggc tcc acc acc ggc tgg cac tgc ggc acc gtc cag gcc cgc 852Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Val Gln Ala Arg105 110 115ggc cag acg gtg agc tac ccc cag ggc acc gtg cag aac ctg acc cgc 900Gly Gln Thr Val Ser Tyr Pro Gln Gly Thr Val Gln Asn Leu Thr Arg120 125 130acc aac gtc tgc gcc gag ccc ggt gac tcc ggc ggc tcc ttc atc tcc 948Thr Asn Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser135 140 145ggc agc cag gcc cag ggc gtc acc tcc ggt ggc tcc ggc aac tgc tcc 996Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser150 155 160 165ttc ggt ggc acc acc tac tac cag gag gtc aac ccg atg ctg agc agc 1044Phe Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Asn Pro Met Leu Ser Ser170 175 180tgg ggt ctg acc ctg cgc acc tga 1068Trp Gly Leu Thr Leu Arg Thr1852102211355212PRT213Nocardiopsis alba DSM 156474002Ala Thr Gly Pro Leu Pro Gln Ser Pro Thr Pro Asp Glu Ala Glu-165-160-155Ala Thr Thr Met Val Glu Ala Leu Gln Arg Asp Leu Gly Leu Ser-150-145-140Pro Ser Gln Ala Asp Glu Leu Leu Glu Ala Gln Ala Glu Ser Phe-135-130-125
Glu Ile Asp Glu Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Asp Ser Tyr Gly-120-115-110Gly Ser Ile Phe Asp Thr Asp Ser Leu Thr Leu Thr Val Leu Val Thr-105-100-95Asp Ala Ser Ala Val Glu Ala Val Glu Ala Ala Gly Ala Glu Ala Lys-90 -85 -80Val Val Ser His Gly Met Glu Gly Leu Glu Glu Ile Val Ala Asp Leu-75 -70 -65 -60Asn Ala Ala Asp Ala Gln Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Ile-55 -50 -45His Ser Asp Thr Val Val Leu Glu Val Leu Glu Gly Ser Gly Ala Asp-40 -35 -30Val Asp Ser Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Thr Ala Asp Val Lys-25 -20 -15Val Glu Ser Thr Thr Glu Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile Gly-10 -5 -1 1 5Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala10 15 20Thr Asn Ala Ser Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly25 30 35Thr Val Gly Thr Pro Val Ser Ile Gly Asn Gly Gln Gly Val Phe Glu40 45 50Arg Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ser Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser55 60 65Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Thr Gly Gly Tyr70 75 80 85Ala Thr Val Ser Gly Ser Ser Gln Ala Ala Ile Gly Ser Gln Ile Cys90 95 100Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Val Gln Ala Arg105 110 115Gly Gln Thr Val Ser Tyr Pro Gln Gly Thr Val Gln Asn Leu Thr Arg120 125 130Thr Asn Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser135 140 145Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser
150 155 160 165Phe Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Asn Pro Met Leu Ser Ser170 175 180Trp Gly Leu Thr Leu Arg Thr185210321143212DNA213合成的220
221misc_feature223引物4003gttcatcgat cgcatcggct gcgaccggcc ccctccccca gtc43210421131212DNA213合成的220
221misc_feature223引物4004gcggatccta tcaggtgcgc agggtcagacc 3121052111146212DNA213Nocardiopsis dassonvillei亞種dassonvillei DSM 43235220
221CDS222(1)..(1143)220
221sig_peptide222(1)..(87)220
221mat_peptide222(568)..(1143)4005atg cga ccc tcc ccc gct atc tcc gct atc ggc acc ggc gca ctc45Met Arg Pro Ser Pro Ala Ile Ser Ala Ile Gly Thr Gly Ala Leu-185-180-175gcg ttc ggt ctg gcg ttc tcc gtg acg ccg ggc gcc agt gcg gcg90Ala Phe Gly Leu Ala Phe Ser Val Thr Pro Gly Ala Ser Ala Ala-170-165-160acc gta ccg gcc gag cca gcg agc gag gcc cag acg atg atg gaa135Thr Val Pro Ala Glu Pro Ala Ser Glu Ala Gln Thr Met Met Glu-155-150-145
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1.具有蛋白酶活性，且在pH 7.5及25℃時對血紅蛋白具有至少39AU/g特異活性的分離的多肽，其中多肽選自下組(a)具有與SEQ ID NO2的1至188位胺基酸，和/或SEQ ID NO6的1-192位胺基酸有至少65％同-性的胺基酸序列的多肽；(b)由在低嚴謹條件下與SEQ ID NO1的502-1065位核苷酸，和/或SEQID NO5的568-1143位核苷酸雜交的核酸序列所編碼的多肽；(c)由與SEQ ID NO1的502-1065位核苷酸，和/或SEQ ID NO5的568-1143位核苷酸具有至少74％同一性的核酸序列所編碼的多肽。
2.包含編碼權利要求1的多肽的核酸序列的分離的核酸序列。
3.分離的核酸序列，其包含編碼具有蛋白酶活性，且在pH 7.5及25℃時對血紅蛋白具有至少39AU/g特異活性的多肽的核酸序列的，其中該核酸序列(a)在低嚴謹條件下與SEQ ID NO1的502-1065位核苷酸，和/或SEQ ID NO5的568-1143位核苷酸中任何一個雜交；(b)與SEQ ID NO1的502-1065位核苷酸，和/或SEQ ID NO5的568-1143位核苷酸中任何一個具有至少74％的同一性；和/或(c)編碼與SEQ ID NO2的1至188位胺基酸，和/或SEQ ID NO6的1-192位胺基酸有至少65％同一性的多肽。
4.包含可操作地連接至一個或多個控制序列的權利要求2-3中任一個的核酸序列的核酸構建體，控制序列引導多肽在適當表達宿主中的生產。
5.包含權利要求4的核酸構建體的重組表達載體。
6.包含權利要求4的核酸構建體或權利要求5的載體的重組宿主細胞。
7.生產權利要求1的多肽的方法，該方法包含(a)培養權利要求6的重組宿主細胞以生產包含所述多肽的上清；和(b)回收該多肽。
8.轉基因植物，或植物部分，其能夠表達權利要求1所述的多肽。
9.轉基因非人動物，或者產品，或其部分，其可以表達權利要求1的多肽。
10.生產權利要求1的多肽的方法，該方法包含(a)培養下述株系中任何一個(i)Nocardiopsis dassonvillei亞種dassonvillei DSM 43235，(ii)Nocardiopsis alba DSM 15647；和(b)回收所述多肽。
11.權利要求1中定義的至少一種多肽(i)在動物飼料中；(ii)在製備用於動物飼料的組合物中；(iii)用於改善動物飼料的營養價值；(iv)用於增加動物食物中的可消化和/或可溶性蛋白；(v)用於提高動物食物中蛋白質的水解程度；和/或(vi)用於蛋白質處理的用途。
12.動物飼料添加劑，其包含權利要求1定義的至少一種多肽；和(a)至少一種脂溶性維生素，和/或(b)至少一種水溶性維生素，和/或(c)至少一種微量礦質。
13.粗蛋白含量為50至800g/kg的動物飼料組合物，其包含至少一種權利要求1定義的多肽，或者至少一種權利要求12的飼料添加劑。
14.包含權利要求1定義的至少一種多肽的組合物，其還同時包含至少一種選自澱粉酶、肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶、和/或β-葡聚糖酶的其他酶。
15.權利要求1所定義的至少一種多肽在洗滌劑中的用途。
16.Nocardiopsis alba DSM 15647。
全文摘要
與來自擬諾卡氏菌的蛋白酶同源的高特異活性蛋白酶，及其在野生型，和包括轉基因植物和非人轉基因動物的重組宿主細胞中的生產。蛋白酶在動物飼料和洗滌劑中是有效的。公開了與蛋白酶的高特異活性有關的特有結構特徵，該蛋白酶屬於肽酶家族S2A或S1E。
文檔編號C12N15/57GK1809634SQ200480017079
公開日2006年7月26日 申請日期2004年6月21日 優先權日2003年6月19日
發明者索倫·F·拉森, 卡斯滕·肖霍姆, 彼得·R·奧斯特加德 申請人:諾維信公司