細菌菌株，微生物菌劑及其應用的製作方法

2024-04-11 01:20:05

本發明涉及微生物應用
技術領域：
，具體而言，涉及一種細菌菌株，微生物菌劑及其應用。
背景技術：
：我國作物秸稈資源豐富，數量巨大，種類多樣，每年的作物秸稈產出量7～8億噸。由於秸稈在短期內不易腐解，利用效率低，絕大部分秸稈廢棄或被焚燒，在種植業為主的地區，作物秸稈已經成為生產中的障礙。所以，焚燒秸稈遍及廣大鄉村，由此引起環境汙染與有機資源的嚴重浪費。據統計，全國用作還田和有機肥料的作物秸稈僅佔總量的20％左右，焚燒佔17％，尚有50％未被利用。我國北方地區的諸多省份都是農業大省，對秸稈處理的需求更為迫切。北方地區秋冬季節氣候冷涼，不利於玉米秸稈木質素、纖維素的降解。所以突破北方地區不良氣候的條件下，秸稈大規模、快速腐熟還田技術瓶頸是實現我國北方地區秸稈利用亟待解決的問題。選育和利用作物秸稈高效耐低溫的降解微生物菌株，研發高效降解菌劑，建立作物秸稈田間原位生物轉化還田技術，是解決我國北方秸稈降解問題的重要發展趨勢之一。利用秸稈降解微生物進行玉米、小麥、水稻秸稈的降解與原位還田具有巨大的應用潛力。複合菌系的篩選研究也有一些報導，有關秸稈發酵菌劑的產品非常少，尚未形成體系，更沒有穩定高效秸稈快速降解菌群的生產使用。秸稈快速腐解技術尚未得到有效地解決，限制了秸稈資源的高效利用。有鑑於此，特提出本發明。技術實現要素：本發明的一方面目的在於提供具有纖維素降解功能的細菌菌株，該菌株耐低溫能力強，且具有非常好的纖維素降解功能。本發明的另一目的在於提供包含如上所述細菌菌株的微生物菌劑，該混合菌劑分解纖維素的能力明顯強於其中任何一個單一菌株，可很好地應用於秸稈降解之中。為了實現本發明的上述目的，特採用以下技術方案：根據本發明的一方面，涉及一種細菌菌株，所述菌株為彎曲芽孢桿菌d3，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為：cgmccno.14091；保藏時間為：2017年5月4日。該菌種的拉丁學名為bacillusflexus，中文學名為香草芽孢桿菌，菌株名為d3。該菌株具有高效的秸稈降解功能，且對低溫耐受性較強。上述的經過分離純化的彎曲芽孢桿菌，其菌落為圓形、扁平、灰白色、不透明、黏稠、大小中等、表面不光滑、邊緣不規則。含有所述彎曲芽孢桿菌d3的微生物菌劑也屬於本申請要求保護的範圍。對於該菌株而言，考慮到應用時的秸稈降解效率及其可能需要運輸等原因，有必要將其擴大培養製成微生物菌劑的形式以擴大其應用範圍。優選的，上述微生物菌劑還包括以下菌株中的一種、兩種或全部：彎曲芽孢桿菌a1，保藏編號為cgmccno.14088；蘇雲金芽孢桿菌a2，保藏編號為cgmccno.14089；以及香草芽孢桿菌b2，保藏編號為cgmccno.14090；上述噬菌體均保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏時間為：2017年5月4日。在一些實施方式中，所述微生物菌劑中含有所述彎曲芽孢桿菌d3及所述彎曲芽孢桿菌a1；在一些實施方式中，所述微生物菌劑中含有所述彎曲芽孢桿菌d3及所述蘇雲金芽孢桿菌a2；在一些實施方式中，所述微生物菌劑中含有所述彎曲芽孢桿菌d3及所述香草芽孢桿菌b2；在一些實施方式中，所述微生物菌劑中含有所述彎曲芽孢桿菌d3、所述彎曲芽孢桿菌a1及所述蘇雲金芽孢桿菌a2；在一些實施方式中，所述微生物菌劑中含有所述彎曲芽孢桿菌d3、所述彎曲芽孢桿菌a1及所述香草芽孢桿菌b2；在一些實施方式中，所述微生物菌劑中含有所述彎曲芽孢桿菌d3、所述蘇雲金芽孢桿菌a2及所述香草芽孢桿菌b2；優選的，如上所述的微生物菌劑，以活菌數計，所述菌劑中彎曲芽孢桿菌a1、蘇雲金芽孢桿菌a2、香草芽孢桿菌b2以及彎曲芽孢桿菌d3的混合比例為(1～5):(1～5):(1～5)：(1～5)。更優選的，所述菌劑中彎曲芽孢桿菌a1、蘇雲金芽孢桿菌a2、香草芽孢桿菌b2以及彎曲芽孢桿菌d3等比混合。上述的微生物菌菌劑，優選為液體菌劑，該液體菌劑中，培養液可優選為液體培養基，例如lb液體培養基，或者進一步添加葡萄糖、硫胺素、生物素和煙酸等營養物。優選的，為了實現良好的纖維素降解效果，在該液體菌劑中，每種菌株的活菌的數量≥1×107cfu/ml，優選的，每種菌株的活菌的數量是1×107-16cfu/ml；更優選為1×108-15cfu/ml，也可以選擇1×109cfu/ml，1×1010cfu/ml，1×1011cfu/ml，1×1012cfu/ml，1×1013cfu/ml，1×1014cfu/ml等。優選的，如上所述的微生物菌劑的製備方法，包括以下步驟：本發明基於上述的液體微生物菌劑提供了一種製備方法，包括如下步驟：將如上所述的菌株接種於液體培養基中進行培養，得到液體菌劑；可選的，將所述液體菌劑過濾和/或濃縮。整個微生物菌劑的製備方法簡單，可以短時間保存和方便運輸，使用的時候直接以一定的比例添加到土壤中即可，使用非常方便。上述的微生物菌菌劑，優選為固體菌劑，所述固體菌劑由如上所述的菌株附加固態載體和/或助劑製備而成。優選的，如上所述的微生物菌劑，所述固態載體包括草炭、糠粉、麥麩、高嶺土、輕質碳酸鈣、硅藻土、白炭黑、滑石粉、細沙以及粘土中的一種或多種。優選的，如上所述的微生物菌劑，所述助劑選自蔗糖、葡萄糖、蛋白腖、豆粕、十二烷基苯磺酸鈉、烷基萘磺酸鈉縮聚物中的一種或兩種以上的混合物。本發明基於上述的固體微生物菌劑提供了一種製備方法，包括如下步驟：將經過純化後得到的所述菌株混於固態載體和/或助劑中既得。如上所述的菌株、或如上所述的菌劑在秸稈消納中的應用。該菌劑可用於玉米、小麥、水稻秸稈的降解與原位還田。與現有技術相比，本發明提供一種高效降解秸稈的微生物菌株，以及包含該菌株的微生物菌劑，該菌劑的主要成分四種微生物菌株構成，尤其適合北方玉米秸稈的快速降解，在作物秸稈田間原位還田中具有重要作用。同時，具有能夠增加土壤腐殖質、提高土壤肥力的作用。本發明提供的彎曲芽孢桿菌(bacillusflexus)，菌株名為a1，保藏編號cgmccno.14088；本發明提供的蘇雲金芽孢桿菌(bacillusthuringensis)，菌株名為a2，保藏編號cgmccno.14089；本發明提供的香草芽孢桿菌(bacillusvanillea)，菌株名為b2，保藏編號cgmccno.14090；本發明提供的彎曲芽孢桿菌(bacillusflexus)，菌株名為d3，保藏編號cgmccno.14091；上述菌株均保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所；保藏時間均為：2017年5月4日。經保藏中心於2017年5月4日檢測為存活菌株。具體實施方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不應視為限制本發明的範圍。實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市購買獲得的常規產品。實施例1本實施例提供了個微生物菌株的篩選方法及菌劑的組合方法。1、實驗材料1.1菌株與土壤供試菌株：菌種庫保藏纖維素降解細菌。東北黑土：吉林公主嶺田間0～20cm表土。1.2培養基1.2.1細菌培養基：牛肉膏3g，蛋白腖10g，nacl5g，瓊脂16～18g，去離子水1l。1.2.2細菌發酵培養基(ypd全營養培養基)：溶解酵母膏/酵母粉10g/l、蛋白腖20g/l於1l去離子水中，ph7.0。1.2.3纖維素降解菌培養基：kh2po40.5g、mgso40.25g、蛋白腖2g、羧甲基纖維素鈉(cmc)1.88g、剛果紅0.2g、瓊脂16～18g，去離子水1l，ph7.0。1.2.4基礎營養液(赫奇遜氏培養基)：磷酸二氫鉀1.0g，nacl0.1g，nano32.5g，去離子水1l，ph自然。單菌株低溫活性篩選方法2.1菌株活化與復壯接種環挑取保藏斜面管內的菌落接種於不加瓊脂的細菌液體培養基(1.2.1)內，在28℃溫度下培養72h，製備單菌株供試菌液。2.2菌株低溫活性篩選250ml三角搖瓶內加入40克土壤，噴水潤溼潤至含水量為30～50％田間持水率，透氣膜封口溼熱滅菌3～5次，用細菌培養基(1.2.1)平板檢驗土壤無活菌後，接種2ml供試菌液，28℃培育3天，然後以-20℃保溫24h；20℃保溫24h為一個循環。凍融循環9次後，在搖瓶內加入100ml無菌水，往復震蕩(轉速170r/min)30分鐘製備土壤懸液，逐級稀釋，平板計數法進行活菌計數測定。當凍融循環后土壤中菌體數量>1011cfu/g土時，所接種的菌株判定為低溫高活性。表1接種菌株凍融循環9次後計數(cfu/g.土)a11.38×1012a22.72×1011b19.50×1012b21.16×1012d16.50×1012d25.60×1016d31.26×10122.3搖瓶法篩選高效秸稈降解菌株於100ml三角瓶中，加入50ml基礎營養液(1.2.4)和5g烘乾玉米碎秸稈，溼熱法滅菌後，接種表1高活性低溫菌株，在30℃、170r/min振蕩培養10天、15天和20天，每個處理重複三次，同時做基礎營養液+秸稈對照ck，測定培養10天、15天和20天秸稈失重率，接種菌株處理秸稈的減重率比不接種菌空白對照秸稈減重率相對提高10％以上分別為降解功能強的菌株。表2表3根據表2和表3，接種10天降解效果好的菌株有a1、a2、b1和b2，接種15天秸稈降解功能強的菌株有b1、b2、d1、d2和d3，接種20天的高效秸稈降解菌株包括a1、a2、b2和d3。2.4複合菌系篩選設置a1a2-b-d型4株菌組合即除去2株菌之後任意b1或b2菌與d1、d2或d3的組合。將各菌株組合的菌懸液按照體積比1∶1混合，分別接種6ml於混合有5克烘乾秸稈的滅菌蛭石內，保持蛭石飽和吸水狀態，在人工氣候室培養20天(25℃日、20℃夜)；測定20d時秸稈失重率，每個重複3次，同時做基礎營養液+秸稈對照ck。接種菌劑秸稈失重率與相對空白提高百分率為促腐率，促腐率大於10％者為所篩選的複合菌系。實驗結果得到a1a2b3d3、a1a2b2d3、a1a2b2d1、a1a2b2d5、a1a2b2d4等5組複合菌系。其中，a1即對應本發明保藏的彎曲芽孢桿菌a1；a2對應本發明保藏的蘇雲金芽孢桿菌a2；b2對應本發明保藏的香草芽孢桿菌b2；d3對應本發明保藏的彎曲芽孢桿菌d3；表4實施例2本實施例提供了一種液體菌劑及其製備方法，具體包括以下步驟：在細菌發酵培養基中(1.2.2)製備單株菌液，糠麩粉按固液比1：2比例吸附單菌液，製備單菌劑a1、a2、b2、d3；4種單菌劑等比例混合、風乾裝袋，完成複合菌劑的製備。測得所得液體菌劑中為各菌株的含量均為1×1010-11cfu/ml。實施例3在本實施例中，製備操作同實施例1，與實施例1不同的是，在本實施例中，製備單菌劑a1、b2、d3；3種單菌劑按照活菌數1:3:5的比例混合、風乾裝袋，完成複合菌劑的製備。實施例4本實施例提供了一種固體菌劑及其製備方法，具體包括以下步驟：將上述實施例2製成的液體菌劑按照每1千克液體菌劑配30克滑石粉(作為固體載體)的比例加入至滑石粉中充分攪拌混勻，過濾、乾燥、粉碎，即得固體菌劑。實施例5本實施例中，製備操作同實施例4，與實施例4不同的是，在本實施例中，所用的固體載體為滑石粉、細沙以及粘土等比例的混合物。實驗例田間效果驗證玉米10月收穫後粉碎，在秸稈表面均勻施撒5公斤實施例2製備得到的複合菌劑，深翻30公分把秸稈埋入土中，同時埋入秸稈樣袋，第二年春天開始測定秸稈樣品腐解率(以減重率計算)。表5表6表7由表6和表7結果看出，在公主嶺和雙城春季玉米苗期和大喇叭口期(5月～7月)生長階段，本發明提供的複合菌劑在田間對翻埋秸稈有很好的促腐效果。儘管已用具體實施例來說明和描述了本發明，然而應意識到，在不背離本發明的精神和範圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權利要求中包括屬於本發明範圍內的所有這些變化和修改。當前第1頁12