地鱉酶解提取物在製備預防和/或治療四氯化碳肝損傷藥物中的應用的製作方法
2024-04-08 18:42:05
本發明屬於醫藥技術領域，具體涉及地鱉酶解提取物在製備預防和/或治療四氯化碳肝損傷藥物中的應用。
背景技術：
肝臟是機體最重要的臟器之一，承擔著物質代謝和生物轉化的功能，易受到體內外各種致病因素和刺激因子的侵襲，引起肝臟的損傷與炎症反應。肝損傷是各種有害因素如病毒、細菌、藥物、酒精、缺血、肝臟部分切除等，直接或間接損傷肝臟，造成肝細胞的炎症、壞死、甚至凋亡和纖維化等一系列病變，是各種肝病共同的病理基礎。因此，研究具有護肝保肝功能的保健食品或藥物，對保護人體健康是非常必要的。
四氯化碳有輕度麻醉作用，對肝、腎有嚴重損害作用，其可在體內轉變為自由基，擾亂肝細胞膜上類脂質的代謝，引起肝細胞壞死，是常用的致肝損傷化合物，利用其構建的肝損傷動物模型是目前研究化學性肝損傷和氧化應激介導的肝損傷的首選實驗動物模型之一，也是開發保肝護肝類藥物的常用模型之一。
地鱉是我國傳統活血化瘀類中藥，現代醫學研究及臨床試驗證明，地鱉具有抑制腫瘤、調節血脂、抗衰老、抗突變、耐缺氧等功效，其含生物鹼、蛋白質、胺基酸、酚類、糖類、甾體、油質等多種營養成分，有著極高的藥用及保健價值。目前有關地鱉生物學功能的化學(組分)基礎和生物學機理尚未完全闡明。
技術實現要素：
本發明的目的是提供地鱉酶解提取物的一種藥物新用途。
本發明所提供的地鱉酶解提取物的新用途是其在製備預防和/或治療四氯化碳肝損傷藥物中的應用。
所述地鱉酶解提取物是通過包括下述步驟的方法製備得到的：
將地鱉粉溶於水中，加入木瓜蛋白酶，調節體系的pH值至6.0-7.0，酶解反應，離心，收集上清液，即可。
上述方法中，地鱉粉與水的料水比為1g:15mL-1g:25mL，具體可為1g:15mL。
所述水具體可為蒸餾水。
地鱉粉與木瓜蛋白酶的配比為1g:500U-1g:700U，具體可為1g:500U。
所述酶解反應的反應溫度為55℃，時間為3-5h，具體可以4h。
所述離心的條件為：10000r/min下離心15min。
上述方法在對酶解體系進行離心之前還包括將所述酶解體系置於100℃沸水中10min以終止酶解反應的操作。
包含上述地鱉酶解提取物的藥物製劑也屬於本發明的保護範圍。
上述藥物製劑可製成各種形式的口服製劑，包括：膠囊劑、片劑、顆粒劑、散劑、丸劑、滴丸劑、緩控釋製劑、口服液、合劑和糖漿劑。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規方法製備。
本發明採用小鼠CCl4致肝損傷模型進行動物實驗，通過分光光度法檢測急性肝損傷小鼠血清中AST、ALT活力，與模型組比較，地鱉酶解提取物組血清中ALT、AST活力均極顯著降低，地鱉酶解提取物組小鼠肝組織中的CAT活力極顯著升高，中高劑量組SOD、GSH-Px活力顯著升高，而低高劑量組MDA的含量明顯降低，另外，地鱉酶解提取物組小鼠肝組織中TNF-α、IL-6及iNOS含量及基因相對表達量均顯著降低。綜上說明，地鱉酶解提取物能顯著減低CCl4對小鼠肝細胞的損傷，增強急性肝損傷小鼠的抗氧化能力，可能成為一種非常優秀的預防和/或治療四氯化碳肝損傷的候選藥物。
附圖說明
圖1示出了地鱉酶解提取物對急性肝損傷小鼠肝組織病理形態學的影響。
具體實施方式
下面通過具體實施例對本發明進行說明，但本發明並不局限於此。
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法；下述實施例中所用的試劑、生物材料等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
1材料與方法
1.1試驗材料
四氯化碳(CCl4)購自北京化工廠，水飛薊素膠囊購自德國馬博士大藥廠，丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、穀胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、總蛋白定量試劑盒購自南京建成生物科技有限公司，TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit購自北京艾德萊生物科技有限公司， Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(RR420A)購自日本TaKaRa公司，所用引物由華大科技公司合成，地鱉酶解提取物由本實驗室製備。
健康昆明小鼠，雄性，體重20-22g，購於中國軍事醫學科學院實驗動物中心【SCXK-(軍)2012-0004】。
1.2方法
1.2.1地鱉酶解物的提取
取地鱉粉按料水比為1g:15mL的比例溶於蒸餾水，根據1g:500U的料酶比(W/U)加入木瓜蛋白酶，調節pH為6.0，將上述溶液置於55℃水浴鍋內水浴4h後再置於100℃沸水中10min以終止酶解反應，然後10000r/min離心15min，吸取上清即得到地鱉酶解液。
1.2.2試驗分組
取60隻健康小鼠隨機分為Ⅰ組(溶劑組)、Ⅱ組(模型組)、Ⅲ組(水飛薊素100mg/kg)、Ⅳ～Ⅵ組(地鱉酶解提取物50、100、200mg/kg)，每組10隻。溶劑組和模型組每天灌服生理鹽水，陽性對照組灌服水飛薊素，地鱉酶解提取物組灌服不同劑量酶解物，每天一次，連續7d，末次給藥2h後，除溶劑組外(橄欖油)，模型組及各給藥組均腹腔注射0.1％CCl4橄欖油溶液10ml/kg，禁食不禁水，18h後眼眶採血，離心製備血清，分離肝組織，取小鼠肝左葉作HE染色進行組織學檢查，其餘部分製成10％組織勻漿備用。
1.2.3肝功能指標檢測
根據ALT、AST試劑盒說明，檢測血清中ALT、AST含量。
1.2.4抗氧化能力的測定
根據SOD、CAT、GSH-Px和MDA試劑盒說明，檢測肝組織中SOD、CAT、GSH-Px活力及MDA含量。
1.2.5肝中TNF-α、IL-6和iNOS含量及mRNA相對表達量測定
根據TNF-α、IL-6和iNOS試劑盒說明，檢測肝中TNF-α、IL-6含量及iNOS活性。Trizol法提取肝組織中總RNA，將RNA用Oligo(dT)18Primer反轉錄合成cDNA第一鏈，以cDNA為模板進行PCR擴增。最後採用與螢光定量PCR儀配套Step OneSoftware v2.1分析PCR數據。
1.2.6肝組織切片觀察
將小鼠肝組織用4℃生理鹽水衝洗後，濾紙拭乾，浸泡於體積分數4％多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，常規切片，蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡下觀察肝組織切片的病理變化。
1.3統計分析
試驗數據用平均值±標準差表示，採用Graphpad Prism6.0軟體進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著時進行LSD各組間多重比較，P<0.05為差異顯著。2結果
2.1地鱉酶解提取物對急性肝損傷小鼠肝功能的影響
轉氨酶是反映肝功能的一項重要指標，通過分光光度法檢測急性肝損傷小鼠血清中AST、ALT活力，結果如表1所示，與溶劑組比較，模型組小鼠血清中的ALT、AST含量顯著升高(P<0.01)，說明CCl4致小鼠肝損傷造模成功。與模型組比較，陽性對照組和地鱉酶解提取物組血清中ALT、AST活力均極顯著降低(P<0.01)。
表1地鱉酶解提取物對急性肝損傷小鼠肝功能的影響
註：與溶劑組相比，**P<0.01；與模型組相比，++P<0.01。
2.2地鱉酶解提取物對急性肝損傷小鼠抗氧化能力的影響
由表2可知，與溶劑組對比，肝損傷模型組小鼠肝組織中的SOD、CAT、GSH-Px活力均顯著降低(P<0.01或P<0.05)，而MDA含量顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，地鱉酶解提取物組小鼠肝組織中的CAT活力極顯著升高(P<0.01)，中高劑量組SOD、GSH-Px活力顯著升高(P<0.01或P<0.05)，而低高劑量組MDA的含量明顯降低(P<0.01或P<0.05)。
表2地鱉酶解提取物對急性肝損傷小鼠肝抗氧化能力的影響
註：與溶劑組相比，**P<0.01，*P<0.05；與模型組相比，++P<0.01，+P<0.05。
2.3地鱉酶解提取物對急性肝損傷小鼠肝組織中TNF-α、IL-6和iNOS含量及mRNA相對表達量的影響
由表3可知，與溶劑組對比，肝損傷模型組小鼠肝組織中TNF-α、IL-6及iNOS含量明顯升高(P<0.05或P<0.01)。與模型組對比，陽性對照組和地鱉酶解提取物組小鼠肝組織中TNF-α、IL-6及iNOS含量均極顯著降低(P<0.01)。
通過螢光定量PCR檢測小鼠肝組織TNF-α、IL-6及iNOS mRNA相對表達量，結果如表4所示，與溶劑組對比，肝損傷模型組小鼠肝組織中TNF-α、IL-6及iNOS mRNA相對表達量明顯升高(P<0.01)。與模型組對比，陽性對照組和地鱉酶解提取物組肝組織中TNF-α、IL-6mRNA相對表達量顯著降低(P0.05)。
表3地鱉酶解提取物對急性肝損傷小鼠肝組織中TNF-α、IL-6和iNOS含量的影響
註：與溶劑組相比，**P<0.01，*P<0.05；與模型組相比，++P<0.01。
表4地鱉酶解提取物對急性肝損傷小鼠肝組織中TNF-α、IL-6和iNOS mRNA相對表達量的影響
註：與溶劑組相比，**P<0.01；與模型組相比，++P<0.01。
2.4地鱉酶解提取物對急性肝損傷小鼠肝組織形態的影響
圖1示出了地鱉酶解提取物對急性肝損傷小鼠肝組織病理形態學的影響。
如圖1所示，溶劑組小鼠肝小葉結構正常，肝索結構清晰可辨，未見肝細胞出現明顯變性、壞死等病理變化。模型組小鼠肝小葉失去正常結構，肝細胞體積增大，呈現氣球樣病變。與模型組比較，陽性對照組和地鱉酶解提取物組小鼠肝小葉結構明顯改善，CCl4誘導肝損傷過程中產生的肝細胞水腫、壞死等現象均有不同程度地減弱，正常肝細胞數目增多。