海水養殖池塘底泥微生物基因組dna的提取方法
2024-04-08 14:28:05
專利名稱：海水養殖池塘底泥微生物基因組dna的提取方法
技術領域：
本發明涉及分子生態學領域，尤其是一種操作方法簡單，在一般實驗室即可快速、 方便地得到大片段微生物基因組總DNA樣品的海水養殖池塘中底泥微生物基因組DNA的提取方法。
背景技術：
底泥微生物是養殖池塘生態系統中的重要組成部分，直接影響池塘中養殖動物尤其是底棲生活習性動物的生長，其組成結構可為指導健康養殖及衡量養殖環境優劣提供科學依據。然而，由於底泥微生物中僅有的可培養菌，因此必需獲得高質量、多樣性程度高、具有代表性的底泥微生物DNA，才能分析出養殖環境的菌群組成結構。目前，在對自然生境中的土壤、汙泥中的微生物多樣性研究中，已嘗試採用溶菌酶、超聲波法及玻璃珠等DNA 提取方法，並在提取過程中應用PVPP、CTAB等去除腐植酸、粘粒等嚴重影響後續分子操作的物質。然而，因海水養殖池塘地處潮間帶的特殊環境，加之有餌料碎屑、養殖動物糞便等沉積，使底泥的組成比自然生境的土壤、汙泥更為複雜，迄今為止，還沒有關於海水養殖池塘底泥微生物基因組DNA提取方法的相關報導。
發明內容
本發明的目的是為了提供一種操作方法簡單，在一般實驗室即可快速、方便地得到大片段微生物基因組總DNA樣品的海水養殖池塘中底泥微生物基因組DNA的提取方法。本發明的技術解決方案是一種海水養殖池塘底泥微生物基因組DNA的提取方法，依次按照如下步驟進行a.取0.3 0.5g底泥樣品於離心管中，加入800 1000 μ 1預處理緩衝液，渦旋混勻；所述預處理緩衝液為100 μ 1 pH 5. 5的IM Tris-HCl buffer,700 μ 1超純水以及 200 μ 1 0. 2Μ A12(S04)3 的混合溶液；b.用4M NaOH調a步驟所得溶液的pH至8，3500gX2min離心棄上清，取沉澱；c.向所得沉澱中加入300 400 μ 1濃度為5mg/ml的溶菌酶渦旋混勻，再加入 100 120 μ 1濃度為10%的SDS、15 25ul 25mg/ml蛋白酶K，渦旋混勻；d.力卩入200 400 μ 1 5Μ NaCl渦旋混勻，力卩入180 280 μ 1 65 "C預熱的 CTAB-NaCl，渦旋混勻，65°C作用20min後11，OOOgX Imin離心取上清；e.在上清液中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，渦旋混勻，11，OOOgX 15min離心取上清，酚/氯仿/異戊醇的體積比為25 24 1 ；f.加入等體積的氯仿/異戊醇渦旋混勻，氯仿/異戊醇的體積比為M 1， 11，OOOgX 15min離心取上清；g.重複步驟f 一次；h.將上清移至1. 5ml離心管，加入0. 7倍體積異丙醇、0. 1倍體積5MNaCl，室溫過夜，18，000gX30min離心棄上清，向沉澱中加入Iml預冷70%乙醇重懸、洗滌；
i. 18，000gX30min離心後棄除上清，乾燥沉澱，加入30 50 μ 1 IX TE, 4°C溶解至少4h。本發明可在一般實驗室快速、方便地得到大片段的池塘底泥微生物群落的總DNA 樣品，獲得的底泥基因組DNA純度大於1. 6 (OD26tlA)D28tl)，片斷大於20Kb，適合作為DGGE (變性梯度凝膠電泳)指紋分析池塘底泥微生物種群結構與多樣性的16S rDNA-PCR擴增的高質量模板，同時也適合作為基因文庫構建的樣品DNA，為指導海水池塘健康養殖及衡量養殖環境優劣提供科學依據。
圖1為本發明實施例1、2所提取的海水養殖池塘底泥微生物總DNA模板的瓊脂糖凝膠圖。圖2為以本發明實施例1、2所提取的海水養殖池塘底泥微生物總DNA為模板16S rDNA-PCR擴增產物的瓊脂糖電泳檢測圖。圖3為以本發明實施例1、2所提取的海水養殖池塘底泥微生物總DNA為模板16S rDNA-PCR擴增產物的DGGE圖譜。
具體實施例方式實施例1 a.使用滅菌藥匙刮除大連黑石礁養殖池塘表面底泥後，採集深2 3cm處底泥約 20g放入滅菌廣口玻璃瓶，使用滅菌藥匙於無菌操作臺內充分攪拌、混合底泥，取0. 3g樣品於離心管中，加入800 μ 1預處理緩衝液，渦旋混勻3min，預處理緩衝液為100 μ 1 pH 5. 5的 IM Tris-HCl buffer,700 μ 1 超純水以及 200 μ 1 0. 2MA12(S04)3 的混合溶液；b.用4M NaOH調a步驟所得溶液的pH至8，3500gX2min離心棄上清，取沉澱；c.向沉澱中加入300 μ 1濃度為5mg/ml的溶菌酶(BBI公司生產)，37°C，225r/ min，作用 Ih 渦旋混勻後，再加入 100μ 1 10% (W/V) SDS、15ul 25mg/ml 蛋白酶 K，50°C， 225r/min，作用Ih渦旋混勻；d.加入200 μ 1 5Μ NaCl渦旋混勻，加入180 μ 1 65°C預熱的CTAB-NaCl，渦旋混勻，65°C作用20min後離心(11，OOOgX Imin)，取上清；e.在上清液中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，渦旋混勻3 5min， 11，OOOgX 15min離心取上清，酚/氯仿/異戊醇的體積比為25 24 1 ；f.加入等體積的氯仿/異戊醇渦旋混勻，氯仿/異戊醇的體積比為M 1， 11，OOOgX 15min離心取上清；g.重複步驟f 一次；e.將上清移至1. 5ml離心管，加入0. 7倍體積異丙醇、0. 1倍體積5M NaCl，室溫過夜，18，000gX30min離心棄上清，向沉澱中加入Iml預冷70%乙醇重懸、洗滌；i. 18，000gX30min離心後棄除上清，將離心管倒置於超淨臺內通風乾燥0. 5h後， 再正放通風乾燥0. 5h，加入30 50 μ 1 1XTE，輕彈離心管，4°C溶解至少4h後冷凍保存。檢驗使用紫外分光光度計及瓊脂糖電泳檢測獲得的DNA ；以獲取DNA為模板，進行細菌16S rDNA特異片段的PCR擴增及擴增片段的變性凝膠電泳以檢測DNA提取效果。
DNA提取效果經紫外分光光度計檢測，所獲得DNA的0D26(1/0D28(1為1. 76 ；瓊脂糖電泳顯示，所獲得的DNA條帶清晰，片段大於20Kb(見圖1中的1)，以其為模板獲得樣品中細菌16S rDNA的特異性擴增片段，大小為230bp (見圖2中的1)，擴增產物在變性凝膠電泳圖中出現近30個不同的擴增條帶，反映了豐富的基因信息，表明該池塘底泥中的菌種多樣性較高(見圖3中的1)。實施例2:a.將底泥採樣器投入大連莊河某刺參養殖池塘塘底，採集底泥後放入滅菌鋁製飯盒，放置於冰盒中運送至實驗室，取0. 5g樣品於離心管中，加入1000 μ 1預處理緩衝液，渦旋混勻3min，預處理緩衝液為100 μ 1 ρΗ 5.5的IM Tris-HClbuffer,700 μ 1超純水以及 200 μ 1 0. 2MA12 (S04) 3 的混合溶液；b.用4M NaOH調a步驟所得溶液的ρΗ至8，3500gX2min離心棄上清，取沉澱；c.向沉澱中加入400μ 1濃度為5mg/ml的溶菌酶(sigma公司生產)，37°C，225r/ min，作用 Ih 渦旋混勻後，再加入 120μ 1 10% (W/V) SDS、25ul 25mg/ml 蛋白酶 K，50°C， 225r/min，作用Ih渦旋混勻；f.加入400 μ 1 5MNaCl渦旋混勻，加入280 μ 1 65°C預熱的CTAB-NaCl，渦旋混勻， 65°C作用 20min 後離心(11，OOOgX Imin)，取上清；e.在上清液中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，渦旋混勻3 5min， 11，OOOgX 15min離心取上清，酚/氯仿/異戊醇的體積比為25 24 1 ；f.加入等體積的氯仿/異戊醇渦旋混勻，氯仿/異戊醇的體積比為M 1， 11，OOOgX 15min離心取上清；g.重複步驟f 一次；h.將上清移至1. 5ml離心管，加入0. 7倍體積異丙醇、0. 1倍體積5MNaCl，室溫過夜，18，000gX30min離心棄上清，向沉澱中加入Iml預冷70%乙醇重懸、洗滌；i. 18，000gX30min離心後棄除上清，將離心管倒置於超淨臺內通風乾燥0. 5h後， 再正放通風乾燥0. 5h，加入30 50 μ 1 1XTE，輕彈離心管，4°C溶解至少4h後冷凍保存。檢驗使用紫外分光光度計及瓊脂糖電泳檢測獲得的DNA ；以獲取DNA為模板，進行細菌16S rDNA特異片段的PCR擴增及擴增片段的變性凝膠電泳以檢測DNA提取效果。DNA提取效果經紫外分光光度計檢測，所獲得DNA的0D26(1/0D28(1為1. 71 ；瓊脂糖電泳顯示，所獲得的DNA條帶清晰，片段大於20Kb (見圖1中的2)，以其為模板獲得樣品中細菌16S rDNA的特異性擴增片段，大小為230bp (見圖2中的2)，擴增產物在變性凝膠電泳圖中出現近30個不同的擴增條帶，反映了豐富的基因信息，表明該池塘底泥中的菌種多樣性較高(見圖3中的2)。此方法也適用於對海岸灘涂和淺海底泥微生物基因組DNA的提取。
權利要求
1. 一種海水養殖池塘底泥微生物基因組DNA的提取方法，依次按照如下步驟進行a.取0.3 0.5g底泥樣品於離心管中，加入800 1000 μ 1預處理緩衝液，渦旋混勻； 所述預處理緩衝液為100 μ 1 ρΗ 5. 5的IM Tris-HCl buffer,700 μ 1超純水以及200 μ 1 0. 2Μ Al2(SO4)3的混合溶液;b.用4MNaOH調a步驟所得溶液的ρΗ至8，3500gX2min離心棄上清，取沉澱；c.向所得沉澱中加入300 400μ 1濃度為5mg/ml的溶菌酶渦旋混勻，再加入100 120 μ 1濃度為10%的SDS、15 25ul 25mg/ml蛋白酶K，渦旋混勻；d.加入200 400μ 1 5Μ NaCl渦旋混勻，加入180 280 μ 1 65°C預熱的CTAB-NaCl， 渦旋混勻，65°C作用20min後11，OOOgX Imin離心取上清；e.在上清液中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，渦旋混勻，11，OOOgX15min離心取上清，酚/氯仿/異戊醇的體積比為25 24 1 ；f.加入等體積的氯仿/異戊醇渦旋混勻，氯仿/異戊醇的體積比為M 1， 11，OOOgX 15min離心取上清；g.重複步驟f一次；h.將上清移至1.5ml離心管，加入0. 7倍體積異丙醇、0. 1倍體積5M NaCl，室溫過夜， 18，000gX30min離心棄上清，向沉澱中加入Iml預冷70%乙醇重懸、洗滌；i.18，OOOgX 30min離心後棄除上清，乾燥沉澱，加入30 50 μ 11 XTE，4°C溶解至少4h。
全文摘要
本發明公開一種海水養殖池塘底泥微生物基因組DNA的提取方法，依次按照如下步驟進行取底泥樣品於離心管中，加入800～1000μl預處理緩衝液，渦旋；用NaOH調a步驟所得溶液的pH至8，離心取沉澱；向所得沉澱中加入溶菌酶渦旋混勻，再加入SDS、蛋白酶K，渦旋混勻；加入NaCl渦旋混勻，加入65℃預熱的CTAB-NaCl，渦旋混勻，65℃作用20min後離心取上清；在上清液中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，渦旋混勻，離心取上清；加入等體積的氯仿/異戊醇渦旋混勻，離心取上清，重複一次；將上清移至離心管，加入異丙醇、NaCl，室溫過夜，離心棄上清，向沉澱中加入預冷70％乙醇重懸、洗滌；離心後棄除上清，乾燥沉澱，加入30～50μl 1×TE，4℃溶解至少4h。
文檔編號C12N15/10GK102161987SQ20101010957
公開日2011年8月24日 申請日期2010年2月20日 優先權日2010年2月20日
發明者丁君, 劉豔萍, 宋堅, 常亞青, 朱世偉, 王軼南 申請人:大連水產學院