生產大豆異黃酮的方法與流程
2024-04-09 02:28:05 1
本發明涉及一種農業技術領域的方法，具體涉及一種生產大豆異黃酮的方法。
背景技術：
大豆異黃酮(soybean isoflavones)是大豆在生長過程中形成的次級代謝產物，是生物黃酮中的一種，也是一種植物雌激素。目前發現的大豆中天然存在的大豆異黃酮為多酚類化合物，主要分布於大豆種子的子葉和胚軸中，種皮中含量極少，80％-90％的異黃酮存在於子葉中，濃度為0.1％-0.3％。胚軸中所含異黃酮種類較多且濃度較高，為1％-2％，但由於胚只佔種子總重量的2％，因此儘管濃度很高，所佔比例卻很少(10％-20％)。
大豆異黃酮是大豆中一類非常重要的非營養成分，它具有抗氧化、抗癌、提高免疫力、防止骨質疏鬆、類似雌性激素的作用。目前國內外主要採用直接從大豆中提取異黃酮、從大豆加工後的中間產物、廢棄物中提取異黃酮，以及用分解與合成的方法生產大豆異黃酮。目前大多數的研究專利是直接從大豆粉、豆粕中提取大豆異黃酮。由於大豆的子葉及胚軸的異黃酮含量較高，尤其是萌發大豆的胚軸中大豆異黃酮含量很高。
經對現有技術的文獻檢索發現，中國專利申請號02114991.7，發明名稱為萃取大豆異黃酮的方法，該專利提出涉及一種通過大豆種子萌動期分離大豆胚軸供萃取大豆異黃酮的方法。但這種方法是將成熟飽滿的大豆種子，經冷水浸泡萌動至初始萌芽狀態，經脫皮、大豆子葉分瓣、子葉與大豆胚軸分離的方法得到胚芽，只有新鮮的能夠萌發的大豆種子才能通過這種方法獲得活的，可以生長的大豆胚芽。而且一粒大豆種子，只有一個胚芽，但胚芽在一粒種子中所佔的重量比很小，佔大豆總重量的2％～2.5％。一粒新鮮的種子經過這種方法去掉胚芽之後，撥掉的子葉必須馬上進行加工處理，否則就會很快變質，失去加工價值，造成浪費。因此，儘管胚芽中大豆異黃酮的含量很高，是子葉中地8～10倍，但由於胚芽的獲得及產量十分有限，因此採用這種方法生產大豆異黃酮也受到很大的限制。
利用大豆高含異黃酮部位(如下胚軸，胚芽，以及萌動的大豆種子)提取大豆異黃酮，已成為提高大豆異黃酮生產效率的有效途徑。但現有方法都是利用大豆植物體本身，取其中含量較高的部位生產和提取大豆異黃酮。
技術實現要素：
本發明的目的在於針對現有技術的不足，提出一種生產大豆異黃酮的方法。本發明不是利用在自然狀態下的大豆種子，萌發的大豆種子，以及大豆種子的某一部分用於異黃酮的提取，而是利用髮根農桿菌感染大豆幼苗(無菌苗)，使之產生髮根，再通過髮根的增殖及擴大培養，生產髮根，供大豆異黃酮的提取及生產使用，解決了從胚芽中提取大豆異黃酮雖然含量高，但生物量小的限制，因此可以達到高效生產大豆異黃酮的效果。
本發明是通過以下技術方案實現的，本發明包括以下步驟：
第一步，大豆無菌苗的獲得：取成熟的大豆種子，用氯氣或過飽和漂白粉精片溶液進行大豆種子滅菌，而後將大豆種子種臍向下接種到萌發培養基上，經過培養得到大豆無菌苗，為「第二步」髮根農桿菌的侵染提供植物受體材料。
所述萌發培養基為MS培養基，B5基本培養基，或MS培養基的無機成分加上B5培養基的有機成分，在溫度為24℃-26℃條件下培養7-10天。
第二步，農桿菌侵染：用經過活化的髮根農桿菌侵染在「第一步」中得到的大豆無菌苗的不同部位，包括下胚軸，子葉節，子葉，真葉及根等部位。接種方法採用常規的農桿菌侵染方法，以及針刺胚軸，子葉節，子葉及真葉，根等部位的方法，也可以採用下胚軸切段，農桿菌侵染的方法。待被侵染部位長出毛狀髮根後，切下髮根，置於擴大繁殖培養基中生長。
所述擴大繁殖培養基，為MS固體、液體培養基，或B5液體、固體培養基，培養溫度為24℃-26℃。為第三步的大豆異黃酮提取及不同成分的含量測定提供植物材料。
第三步，大豆異黃酮的提取：用乙醇從第二步得到的髮根中提取大豆異黃酮。
所述乙醇，其體積濃度為70％-80％。
經紫外分光光度計法檢測髮根中大豆異黃酮的不同成分及含量，測定髮根中大豆異黃酮的含量遠遠高於相同培養條件下正常大豆根系中異黃酮的含量，是正常生長的對照根的4-10倍。同時髮根中異黃酮的含量也高於相同培養條件及田間自然生長條件下大豆植物體任何部位中的異黃酮含量，包括公認異黃酮含量最高的下胚軸部位。因此利用髮根農桿菌侵染大豆產生髮根，再通過髮根的擴大培養，可以達到高效產生大豆異黃酮目的。
大豆髮根中大豆苷元等的含量是大豆正常組織的4-10倍，並且髮根有可以無限增殖的優點。大豆的胚芽也有很高的異黃酮含量，但每一粒大豆種子只有一個胚芽，而且萌動後胚芽僅僅佔大豆總量的2-2.5％，因此使大豆胚芽生產大豆異黃酮的產量和效率是有限，而使用髮根培養的方法可以得到高異黃酮含量的髮根，通過髮根的擴大培養，解決了從胚芽中提取大豆異黃酮雖然含量高，但生物量小的限制，因此可以達到高效生產大豆異黃酮的效果。
本發明可用於以大豆為材料的大豆異黃酮生產，同樣也可以用於其它豆科植物材料(如野生及多年生野生大豆等)。
具體實施方式
下面對本發明的實施例作詳細說明：本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。
實施例1
1.選擇優質大豆品種，取健康、成熟的大豆種子，用氯氣消毒2小時-10小時，將大豆種臍向下接種到B5固體培養基中，培養基的pH為5.8。接種在培養基上的大豆種子在24℃-26℃條件下培養7天，得到健康的大豆無菌苗。
2.取大豆無菌苗，用活化後的髮根農桿菌侵染無菌苗的易感部位。待侵染部位長出毛狀髮根後，切下髮根，置於MS固體培養基上，在25℃條件下培養15-20天。
3.取出髮根，打碎研磨，用70％的乙醇提取，以0.5g樣品，5ml乙醇的配比進行提取，將提取後的溶液再稀釋100倍，用紫外分光光度計分別在250及260nm處測定提取液的吸光度。選擇吸光值對應濃度高於對照根的樣品(髮根)，記錄，標號進行擴大培養，得到大量髮根用於大豆異黃酮的提取。髮根中大豆異黃酮的含量是正常大豆根的4倍-10倍。
實施例2
1.選用高產大豆品種東農42，挑選飽滿，無病蟲害的當年大豆種子，用漂白粉精片過飽和溶液浸泡大豆種子15分鐘，再用無菌水漂洗3次，將種子接種到固體B5基本培養基上，B5基本培養基的Ph值為5.8，在25℃條件下培養10天，得到無菌苗，取活化農桿菌接種無菌苗子葉或下胚軸。具體做法為：用手術刀輕輕割破子葉及下胚軸表皮，將農桿菌塗抹傷口處。兩周後在傷口處長出髮根，切下髮根，用抗生素除菌，或在B5基本培養基中加入抗生素，達到除菌的目的。將除菌完全的髮根轉接到B5固體培養基上進行髮根培養。得到髮根中大豆異黃酮的含量是對照根的4倍-10倍。
實施例3
選用高產大豆品種合豐35，挑選飽滿，無病蟲害的當年大豆種子，用氯氣滅菌2小時-24小時，將滅菌的種子接種到MS無機成分加上B5的有機成分所組成的固體培養基上，培養基的Ph值為5.8，在25℃條件下培養7天-10天，得到無菌苗。切取無菌苗的下胚軸，取活化農桿菌塗抹在無菌苗下的胚軸切段的切面上。1周-2周後在傷口處長出髮根。切下髮根，置於添加抗生素的培養基中進行抑菌培養。除菌完全之後，轉接到MS液體培養基中培養髮根。得到髮根中大豆異黃酮的含量是對照根的4倍-10倍。