利用有性孢子保存葡萄霜黴菌的方法
2024-04-15 16:01:05
1.本發明涉及生物技術領域，具體地，涉及一種利用有性孢子保存葡萄霜黴菌的方法。
背景技術：
2.葡萄霜黴病是危害葡萄生產的卵菌病害，世界上種植葡萄的地區均有發病，嚴重影響葡萄的產量和果實品質。葡萄霜黴病的病原菌為葡萄霜黴菌(plasmopara viticola)，是一種專性活體寄生菌，無性階段的孢子囊為其繁殖體，在葡萄生長季完成傳播和侵染，有性階段產生厚壁卵孢子，可以抵禦外界不良環境隨病殘體越冬。卵孢子作為翌年發生病害的初侵染源，是葡萄霜黴菌病害循環中的重要的一個階段。
3.葡萄霜黴菌目前不能夠在培養基上繁殖和保存，嚴重製約了利用該病原菌進行葡萄抗性品種鑑定、病原菌遺傳多樣性分析和致病力分化等方面的研究。研究者不得已需要定期在葡萄生長季去田間採集病原菌供試驗研究，不僅增加了工作量也提高了實驗成本，且不便於非生長季採集樣本。因此將葡萄霜黴菌保存，在葡萄非生長季進行試驗研究是解決此困境的有效途徑。
4.目前，葡萄霜黴菌的長期保存，主要通過針對無性階段產生的孢子囊(即無性孢子)開發不同類型的保護劑來實現，例如二甲基亞碸、液氮等，這些試劑或具有一定的毒性或屬於危化品，因此存在一定的危險性，並且葡萄霜黴菌離體保存活力下降明顯。而葡萄霜黴菌卵孢子(即有性孢子)由於提取困難、形成周期長、誘導萌發困難、常處於休眠狀態等原因極少被關注。葡萄霜黴菌卵孢子作為葡萄霜黴菌生活史有性階段的重要一環，應當予以足夠的重視。
5.因此，本發明的目的是從葡萄霜黴菌有性階段的卵孢子入手，通過保存、誘導萌發來提供一種簡單有效的葡萄霜黴菌的長期保存方法。
技術實現要素：
6.本發明要解決的技術問題在於，提供一種利用有性孢子保存葡萄霜黴菌的方法，根據葡萄霜黴菌的特性，從有性階段產生的卵孢子入手，解決葡萄霜黴菌離體保存活力下降的問題，相較於針對無性孢子開放的保存方法，降低儲存成本，實現對葡萄霜黴菌的長期保存。
7.本發明提供了一種利用有性孢子保存葡萄霜黴菌的方法，包括以下步驟：
8.(1)葡萄霜黴菌卵孢子的收集：
9.10月中旬，在葡萄生長季的末期，收集葡萄園自然感染葡萄霜黴菌的病葉，通過體式顯微鏡檢測，剪下感病葉片上含有卵孢子的部分，裝入尼龍袋中，放到葡萄園4～7cm深的地表淺埋，使卵孢子在自然條件下成熟，3個月後同尼龍袋一起取出，得到含有卵孢子的病殘體；
10.(2)葡萄霜黴菌卵孢子的保存：
11.將步驟(1)所得含有卵孢子的病殘體，同尼龍袋一起覆蓋溼沙維持溼度在60～70％，放入3～5℃冰箱保存，在保存後12個月後，提取、收集卵孢子進行活力和侵染力檢測；
12.(3)葡萄霜黴菌卵孢子的富集：
13.保存一定時間後，取步驟(2)保存於冰箱中的含有卵孢子的病殘體放入研缽，將研缽放置於冰上將病殘體研磨細碎，使用10倍體積的無菌蒸餾水浸潤、勻漿後用200目篩網過濾，收集濾液，2000r/min離心5min棄上清，隨後加入無菌蒸餾水，製成卵孢子懸浮液；
14.(4)卵孢子的活力與侵染力檢測：
15.活力檢測：利用步驟(3)所得卵孢子懸浮液，將單個卵孢子接種到1cm無菌
『
黑比諾』葡萄葉盤上，葉背朝上，每個葉盤接種一個卵孢子，葉盤下墊兩層溼潤的濾紙置於20～25℃光照培養箱中，誘導卵孢子產生芽孢囊釋放遊動孢子，培養兩周後，葉盤上長出白色霜黴層形成初侵染視為卵孢子萌發，計算萌發率；
16.侵染力檢測：取20ml步驟(3)所得卵孢子懸浮液，倒入9cm培養皿中，將1cm無菌
『
黑比諾』葡萄葉盤葉背接觸懸浮液浮在培養皿中，在20～25℃培養箱中培養4～6日，隨後取出葉盤，葉背朝上，葉盤下墊兩層溼潤的濾紙置於20～25℃光照培養箱中培養6～8日，計算侵染率和嚴重度。
17.優選的，所述步驟(1)中尼龍袋的尺寸為10cm
×
8cm，60目。
18.優選的，所述步驟(3)卵孢子懸浮液中卵孢子濃度為10個/ml。
19.優選的，所述步驟(3)中卵孢子的活力與侵染力檢測，每次分別接種100個葉盤，每次實驗重複三次。
20.本發明的工作原理：本發明的利用有性孢子保存葡萄霜黴菌的方法，在葡萄生長季的末期收集葡萄園自然感染葡萄霜黴菌的病葉，剪下感病葉片上含有卵孢子的部分裝入尼龍袋中，淺埋使卵孢子成熟。淺埋地表主要是模擬病葉落在土壤裡，維持至少3個月使得卵孢子成熟。在尼龍袋內可以使病殘體通過孔徑與土壤接觸保持一定溼度，同時有利於統一回收病殘體，葡萄園4～7cm深的地表淺埋有利於病殘體內的卵孢子成熟。然後將處理後含有卵孢子的病殘體覆蓋溼沙放入3～5℃冰箱，保持溼度60～70％保存，該條件下，卵孢子可以保持最大活力。
21.本發明的有益效果：本發明的利用有性孢子保存葡萄霜黴菌的方法，將葡萄霜黴菌卵孢子保存12個月，經誘導處理後，卵孢子的侵染率＞5.67％，病情指數＞3.07％。本發明根據葡萄霜黴菌的特性，從有性階段產生的卵孢子入手，解決了葡萄霜黴菌離體保存活力下降的問題，相較於針對無性孢子開放的保存方法，此法成本較低，儲存條件要求不高，操作方法環保且簡單易行，實現了對葡萄霜黴菌的長期保存。
附圖說明
22.圖1為葡萄生長末期霜黴菌卵孢子含量百分率。
具體實施方式
23.為了使本發明技術方案更容易理解，現結合附圖採用具體實施例的方式，對本發明的技術方案進行清晰、完整的描述。
24.實施例1：
25.本實施例的利用有性孢子保存葡萄霜黴菌的方法，包括以下步驟：
26.(1)葡萄霜黴菌卵孢子的收集時間
27.在葡萄生長季的末期落葉前1月，日期分別為8月5日，8月15日，8月25日，9月4日，9月14日，9月24日，10月4日，10月14日，10月24日，分別收集葡萄園自然感染葡萄霜黴菌的病葉，每次隨機選取3株葡萄，每株取10片，重複3次。
28.通過體式顯微鏡檢測葉片中是否含有卵孢子，計算含有卵孢子的百分率如附圖1。可見在10月14日霜黴菌卵孢子含量最高。
29.實施例2：
30.(1)將實施例1中採集的病葉，剪下感病葉片上含有卵孢子的部分，裝入尺寸為10cm
×
8cm尼龍袋中，放到葡萄園4cm深的地表淺埋，使卵孢子在自然條件下成熟，淺埋地表3個月後同尼龍袋一起取出，得到含有卵孢子的病殘體；
31.(2)葡萄霜黴菌卵孢子的保存：
32.將步驟(1)所得含有卵孢子的病殘體，同尼龍袋一起覆蓋溼沙維持溼度，放入冰箱或培養箱維持相應的溫度。根據溫度(-20℃，4℃，10℃，25℃)、溼度(20％，40％，60％，90％)、處理時間(3個月，6個月，9個月，12個月)設置三因素四水平的正交試驗表，同時模自然越冬，將含有病殘體的尼龍袋淺埋地表，分別處理6個月(ck1)和9個月(ck2)作為對照，詳見表1。收集不同處理下的卵孢子進行活力和侵染力檢測。
33.(3)葡萄霜黴菌卵孢子的富集：
34.不同處理下，分別取步驟(2)保存於冰箱中的含有卵孢子的病殘體放入研缽，將研缽放置於冰上將病殘體研磨細碎，使用10倍體積的無菌蒸餾水浸潤、勻漿後用200目篩網過濾，收集濾液，2000r/min離心5min棄上清，隨後加入無菌蒸餾水，製成卵孢子濃度為10個/ml的卵孢子懸浮液；
35.(4)卵孢子的活力與侵染力檢測：
36.活力檢測：利用步驟(3)所得卵孢子懸浮液，將單個卵孢子接種到1cm無菌
『
黑比諾』葡萄葉盤上，葉背朝上，每個葉盤接種一個卵孢子，葉盤下墊兩層溼潤的濾紙置於20℃光照培養箱中，誘導卵孢子產生芽孢囊釋放遊動孢子，培養兩周後，葉盤上長出白色霜黴層形成初侵染視為卵孢子萌發，計算萌發率，每次接種100個葉盤，每次實驗重複三次；
37.侵染力檢測：取20ml步驟(3)所得卵孢子懸浮液，倒入9cm培養皿中，將1cm無菌
『
黑比諾』葡萄葉盤葉背接觸懸浮液浮在培養皿中，在20℃培養箱中培養5日，隨後取出葉盤，葉背朝上，葉盤下墊兩層溼潤的濾紙置於20℃光照培養箱中培養7日，計算侵染率和嚴重度，每次接種100個葉盤，每次實驗重複三次。
38.表1.不同溫度、溼度和處理時間下對卵孢子侵染率和病情指數的影響
[0039][0040][0041]
本發明的方法處理含有卵孢子的病殘體，並將處理後含有卵孢子的病殘體放入不同的溫度和溼度下，保存3、6、9及12個月後，分別取樣經誘導處理。其中，將取出後的卵孢子在4℃，60％的溼度情況下保存12個月，侵染率仍然達到5.67％，病情指數為3.07％。
[0042]
可見，本發明收集秋末葡萄園自然感染葡萄霜黴菌的病葉，剪下含有卵孢子的部分放入尼龍袋中，淺埋於地表3個月後取出，覆蓋溼沙維持溼度在60％，放入4℃冰箱保存。利用該處理及保存方法，可以在長期保存12個月後，卵孢子的活力與侵染力保持較為穩定。且在具體實施例的技術方案中，活力與侵染力最強，即該條件下樣品保存效果最優。
[0043]
應當注意，在此所述的實施例僅為本發明的部分實施例，而非本發明的全部實現方式，所述實施例只有示例性，其作用只在於提供理解本發明內容更為直觀明了的方式，而不是對本發明所述技術方案的限制。在不脫離本發明構思的前提下，所有本領域普通技術人員沒有做出創造性勞動就能想到的其它實施方式，及其它對本發明技術方案的簡單替換和各種變化，都屬於本發明的保護範圍。