一種新型pamam的衍生物及其應用的製作方法
2024-04-01 05:05:05
專利名稱：一種新型pamam的衍生物及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體地是涉及一種新型PAMAM的衍生物及其應用。
背景技術：
基因治療對於遺傳性和後天形成的疾病是一種極其有效的治療途徑，但是要將遺 傳物質轉移到體內仍然是一個很大的技術難題，尋找安全、有效和特異性的基因轉染方法 仍然是限制基因治療廣泛應用的瓶頸。目前基因轉運主要有兩類載體，及病毒性載體和非 病毒性載體。儘管病毒性載體在體外和體內基因轉運中均表現出很高的效率，但是它們的 免疫原性、病毒基因的永久整合以及操作的繁瑣限制了它們在基因治療中的應用。相對而 言，非病毒載體系統(也叫合成基因轉運系統)因其操作簡單、無免疫原性、基因轉運能力 大等優勢越來越受到人們的重視。但是非病毒轉運也有轉染效率相對較低和細胞毒性較大 的弱點。儘管如此，聚陽離子樹狀大分子仍然具有很大的吸引力，一方面是由於它們的結構 比較明確，另一方面在這些大分子的表面具有多個官能團，能夠進一步地進行化學修飾從 而得到生物活性和生物相容性更高的新型基因轉運載體。聚醯胺胺(PAMAM)是目前研究得最多的樹狀大分子家族之一，研究證明其在體外 具有較強的基因轉運能力。由於PAMAM樹枝狀的表面上具有很多帶正電荷的伯胺基團，它 能夠將帶負電荷的DNA或RNA壓縮成一個多聚的複合體形式，從而促進基因向細胞內轉運。 PAMAM的基因轉運能力和細胞毒性是與其表面功能基團的性質緊密相關的。表面帶負電或 中性的樹狀分子比帶正電荷的樹狀分子毒性要大。此外，聚合物-DNA/RNA複合體的溶解 性、胞內DNA/RNA釋放的難易度等物理化學性質也對PAMAM介導的基因轉運起著決定性的 作用。為了進一步增加PAMAM樹狀分子的基因轉運能力及其生物相容性，很多種配體被連 接到PAMAM表面的伯胺基團上以改變其表面性質。經過這些修飾得到的衍生物有的具有顯 著增加的基因轉運能力，有的細胞毒性下降，還有一些則在這兩方面均有改善。
發明內容
本發明的目的之一提供了 一類新型PAMAM的衍生物，該PAMAM的衍生物具有很好 的轉染效率。一類新型PAMAM的衍生物，該衍生物為苯丙氨酸偶聯修飾PAMAM樹狀分子，其分子
結構為
3 其中，η 為 50 60。本發明的另一目的是提供上述PAMAM的衍生物的應用。具體技術方案如下PAMAM的衍生物作為轉染試劑在生物學研究中的應用。優選地，所述生物轉染為質粒DNA和小分子RNA的細胞轉染；所述應用為siRNA細 胞轉染；或所述應用為用於包裝病毒。本發明的另一目的是提供一種生物轉染試劑。具體技術方案如下一種生物轉染試劑，其主要成份為苯丙氨酸偶聯修飾PAMAM樹狀分子構，分子結
構如下 其中，η 為 50 60。本發明採用胺基酸偶聯的方法，通過比較不同種類和數目的胺基酸對第4代 PAMAM樹狀分子的一系列的修飾反應，利用HEK 293細胞和3T3-L1細胞對這類眾多化合物 的轉染能力進行了篩選，發現表面連接有苯丙氨酸的衍生物PAMAM-Phe具有顯著增強的基 因轉運能力和生物相容性。進一步的，發現該化合物具有較強的體內基因轉運能力，且其 可用於siRNA轉運、病毒包裝等多種廣泛應用的生物學實驗操作。本發明所述的PAMAM-Phe較未經修飾的PAMAM具有顯著的優勢第一，其基因轉運 能力大大增強，既表現在對單個質粒的轉染上，也表現在siRNA的轉染和多個基因的轉染 上，此外，其在體內的基因轉運能力也大大增強；第二，PAMAM-Phe的基因轉染能力不應血 清的存在而降低，因此在細胞轉染前無需像PAMAM介導的轉染那樣需要換無血清培養基， 大大簡化了操作過程；第三，其生物相容性顯著增強，表現出較低的細胞毒性，為其在基因 治療中的應用鋪平了道路；最後，我們的研究證明了 PAMAM-Phe作為一種新型的轉染試劑 可以用於siRNA的高效轉染、逆轉錄病毒以及慢病毒的包裝，說明其在生物學研究中廣泛 應用的可行性。
圖1胺基酸偶聯衍生物PAMAM-Phe合成示意圖；圖2PAMAM和PAMAM-Phe的1H匪R光譜分析圖；
表1合成的19種PAMAM衍生物表；圖3 PAMAM胺基酸偶聯衍生物的初步篩選示意圖(7號為PAMAM-Phe，0號為 PAMAM)；圖4 PAMAM-Phe介導FUGW質粒(含eGFP基因)轉染HEK 293細胞螢光強度定量 示意圖；圖5 PAMAM-Phe介導RSV-Luc質粒(含螢光素酶報告基因)轉染HEK 293細胞定
量示意圖；圖6 PAMAM-Phe介導siRNA轉染HEK 293細胞示意圖(A、白光視野；B、 Lipofectamin 2000 ；C、PAMAM-Phe ；D、PAMAM)；圖7 PAMAM-Phe應用於病毒包裝(A，C 利用Lipofectamin 2000介導包裝的慢病 毒和逆轉錄病毒分別感染3T3-L1細胞；B，D 利用PAMAM-Phe介導包裝的慢病毒和逆轉錄 病毒分別感染3T3-L1細胞)；圖8 PAMAM-Phe對HEK 293細胞毒性測定示意圖；圖9 PAMAM-Phe介導小鼠腓腸肌內GFP基因(FUGW質粒)轉運示意圖(A、 PAMAM-Phe 轉染FUGW ；B、PAMAM轉染FUGW ；C、PAMAM_Phe 單獨注射；D、FUGW質粒單獨注射)。
具體實施例方式本發明化學合成所用試劑均為常規商業試劑，生物實驗所用材料均為商業產品。本發明所述PAMAM-Phe，根據本領域的現有技術，可通過以下技術方案實現的在 有機溶劑中進行，以羥基苯並三唑H0Bt，2-(lH-苯並三唑)-N，N, N』，N』 -四甲基脲磷酸鹽 HBTU，N, N- 二異丙基乙胺DIPEA為催化劑，叔丁氧基羰基Boc為保護基的苯丙氨酸和端氨 基的PAMAM第4代樹狀分子為原料發生縮合反應，後以無水醚沉澱法精製，以三氟乙酸脫去 胺基酸氨基上的Boc保護基，無水醚沉澱法精製，在半透膜中以4°C純水透析得到純化的端 胺基酸修飾的PAMAM樹狀分子。 實施例1、PAMAM-Phe樹狀分子的化學合成與純化如圖1所示，取0.07謹ol的PAMAM G4粉末溶於25ml無水DMF，以次加入5. 63謹ol 的 Boc-L-苯丙氨酸，5. 63mmol 的 HBTU，5. 63mmol 的 HOBt，5. 63mmol 的 DIPEA，室溫攪拌 12h， 加入冷的無水乙醚析出沉澱，濾出沉澱，加入IOml無水DMF溶解中間體，再次加入冷的無水 乙醚析出沉澱得到粗的中間產物。取中間產物溶於22ml 90%三氟乙酸，室溫攪拌2h，脫去Boc保護基，加入大量冷 的無水乙醚析出沉澱，濾出沉澱，加入IOml無水DMF溶解產物，再次加入冷的無水乙醚析出 較純淨產物。取產物溶於純水中，轉入透析袋4°C透析過夜，冷凍乾燥得到白色粉末狀 PAMAM-Phe 產物。(738mg，產率 47. 6 %，胺基酸修飾度 84. 4% )。1H NMR 光譜(400MHz，D2O) 圖 2，PAMAM-Phe δ 2. 47 (-NCH2CH2CO-Of PAMAM unit, 248Η), 2. 83 (-CONHCH2CH2N-OfPAMAMunit and-NCH2CH2N-of PAMAM unit) , 2. 98 (-CONHCH2CH2NH2 of PAMAM unit), 3. 12 (-NCH2CH2CO- of PAMAM unit and_CHCH2C6H5 of phenylalanine), 3. 36 (-C0NHCH2CH2N-of PAMAM unit and-CONHCH2CH2NHCO-of PAMAM unit)，4. 08(-HCCH2C6H5 of phenylalanine 54H)，7. 27(-HCCH2C6H5 of phenylalanine 270H)。實施例2、PAMAM胺基酸偶聯衍生物的初步篩選利用HEK 293細胞和可以高表達綠色螢光蛋白的FUGW質粒為載體，對純化得到的 19類PAMAM衍生物(表1)的體外基因轉運能力進行初步的鑑定。在96孔板中進行篩選， 每孔加FUGW質粒0. 1 μ g，PAMAM胺基酸偶聯衍生物的終濃度為0. 04 μ g/ μ 1，按此比例(N/ P = 40)將FUGW和PAMAM胺基酸偶聯衍生物加到20 μ 1 PBS中混勻，室溫靜置30min，然後 加入到無抗性的DMEM培養基中培養4 6h，換完全培養液繼續培養，24h後在螢光倒置顯 微鏡下觀察綠色螢光蛋白表達情況，發現苯丙氨酸偶聯衍生物(PAMA-Phe)具有最強的基 因轉運能力(圖3)。 實施例3、PAMA-Phe-DNA複合體的物理化學性質分析進行DNA凝膠阻滯實驗，將按不同氮磷比(N/P)形成的PAMA-Phe-DNA複合體 (PAMA-Phe分子結構式中，η為50 60這一類)經過1 %瓊脂糖凝膠電泳進行分析，觀察 DNA條帶的遷移情況，發現當Ν/Ρ > 2時，DNA在電場中的遷移完全被阻滯，說明PAMA-Phe 樹狀分子與DNA分子形成很嚴密的複合體。進一步的，利用動態光散射的技術測定複合體 的粒徑，當Ν/Ρ為40時，形成的複合體粒徑為233nm，該粒徑大小有利於細胞的內吞作用。實施例4、PAMA-Phe的體外轉染能力測定
通過螢光強度定量(圖4)以及螢光素酶報告基因(luciferase reporter gene) 檢測(圖5)的方法，測定在不同N/P比的情況下的體外轉染能力，並且對無血清和有血清 環境下的轉染效果進行比較。在96孔板中按N/P比為40的比例每孔轉染0. Iyg FUGW質 粒到HEK293細胞，轉染後四小時換新鮮完全培養液，繼續培養至轉染後24h，在螢光顯微鏡 下觀察螢光並檢測螢光強度。類似的，在96孔板中按N/P比為40的比例每孔轉染0. 05 μ g RSV-Luc質粒到HEK293細胞，轉染後四小時換新鮮完全培養液，繼續培養至轉染後48h，用 螢光素酶檢測試劑盒測定螢光素酶的表達強度。結果顯示PAMA-Phe轉染能力與PAMAM相 比顯著增強，而且血清的存在對其轉染效果沒有明顯的負作用；
實施例5、PAMAM-Phe在生物學研究中的應用利用PAMAM-Phe (PAMA-Phe分子結構式中，η為50 60這一類)來轉染螢光探針 Cy3標記的siRNA，轉染效率較PAMAM和商業化的轉染試劑Lipofectamin 2000明顯要高很 多(圖6)。此外，並用其介導病毒包裝過程中的細胞轉染，也取得了很好的效果，可以生產 得到滴度很高的逆轉錄病毒和慢病毒。對於逆轉錄病毒的包裝，用PAMAM-Phe將pMXs_GFP 質粒按N/P40的比例轉入Plat-E細胞；對於慢病毒的包裝，用PAMAM-Phe將FUGW質粒以及 Invitrogen購買的Packing Mix(由三種包裝質粒混合而成，FUGW與Packing Mix的質量 比為1 2)按N/P 40的比例轉入Plat-E細胞。轉染四小時後換完全培養液，分別收集轉 染後48h和72h的培養上清，用這兩種上清與新鮮培養基1 1混勻，各感染小鼠3T3-L1 細胞12h，之後用新鮮完全培養液繼續培養24h，在螢光顯微鏡下觀察螢光表達情況。實施例6、PAMAM-Phe細胞毒性測定在96孔板中鋪HEK 293細胞，8X IO3個細胞/孔，一天後用不同濃度的 PAMAM-Phe (PAMA-Phe分子結構式中，η為50 60這一類)和PAMAM處理HEK 293細胞24h， 加入MTT (終濃度lmg/ml) 37°C孵育4h，每孔加150 μ 1 DMS0,測量570nm的吸光度，結果表 明(圖7)PAMAM-Phe的細胞毒性與PAMAM比較顯著降低，而且在其轉染應用濃度細胞毒性較小。實施例7、PAMA-Phe的體內基因轉染PAMA-Phe (PAMA-Phe分子結構式中，η為50 60這一類)與FUGW質粒按照Ν/Ρ 40的比例形成複合體，以每克體重注射2μ g質粒的劑量注射C57BL/6J小鼠腓腸肌，48h後 取注射區域冰凍切片，顯微鏡下觀察螢光蛋白表達情況，結果顯示PAMA-Phe可以較好的介 導小鼠體內基因轉運(圖8)。以上是針對本發明的可行實施例的具體說明，但該實施例並非用以限制本發明的 專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為的等效實施或變更，均應包含於本案的專利範圍 中。
權利要求
一種PAMAM的衍生物，其特徵是，所述衍生物為苯丙氨酸偶聯修飾PAMAM樹狀分子構，其分子結構如下其中，n為50～60。FSA00000075306900011.tif
2.權利要求1所述的PAMAM的衍生物作為轉染試劑在生物學研究中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特徵是，所述生物學研究中的應用為質粒DNA和小分 子RNA的細胞轉染。
4.根據權利要求3所述的應用，其特徵是，所述應用為siRNA的細胞轉染。
5.根據權利要求2所述的應用，其特徵是，所述應用為用於包裝病毒。
6.一種生物轉染試劑，其特徵是，其主要成份為苯丙氨酸偶聯修飾PAMAM樹狀分子構， 分子結構如下 其中，η為50 60。
全文摘要
本發明公開了一種新型PAMAM的衍生物及其應用，所述衍生物為苯丙氨酸偶聯修飾PAMAM樹狀分子構，其分子結構如下其中，n為50～60。本發明所述的PAMAM的衍生物作為轉染試劑在生物轉染中的應用，所述PAMAM-Phe極大地了增強了原始試劑PAMAM的基因轉運能力，並顯著降低了細胞毒性，而且其轉染能力不受血清存在的影響，無需轉染前換無血清培養基，極大的簡化了實驗操作的步驟；PAMAM-Phe還可以有效地用於siRNA的轉染和基因的體內轉染，顯示了其在基因治療中的潛在應用價值。
文檔編號C12N15/63GK101899154SQ20101014228
公開日2010年12月1日 申請日期2010年4月1日 優先權日2010年4月1日
發明者丁克, 吳東海, 周毅, 常少華, 楊淑偉, 高學飛 申請人:中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院