一種用於可見光致體外培養的細胞/細胞薄層收割的矽/石墨烯基複合表面及其製備方法與流程

2024-03-27 23:21:05

本發明屬於組織工程領域，具體涉及一種用於可見光致體外培養的細胞/細胞薄層收割的矽/石墨烯基複合表面及其製備方法。

背景技術：

「細胞片層組織工程技術」一經提出，就在組織工程修復及重建及細胞治療過程中，作為一種新的可構建三維組織及器官中表現出巨大潛力。細胞片層不僅保存組織所必需的細胞表面蛋白、細胞間連接蛋白及細胞外基質環境，還可提供促進細胞和組織再生的生物活性因子。目前，層層堆疊細胞片層組織工程技術被用於治療許多疾病(心臟、肝臟及泌尿系統等)，並表現出光明的前景。因此，高效獲取完整的高活性及功能性的細胞片層對於細胞片層組織工程來說是關鍵問題。目前，大多數的細胞片層獲取都是採用溫敏系統，而其存在的問題在於長時間的低溫會在一定程度上損傷細胞功能，並會促使一些非相關基因錯誤表達。同時，溫敏基板製備過程複雜，價格昂貴，也是限制其在組織工程應用的另一個重要因素。因此，如何低成本的、高效的、易操縱的實現細胞片層收割對細胞片層技術的發展非常關鍵。

洪逸等採用光敏半導體二氧化鈦通過紫外光照改變材料表面的親疏水性成功獲得細胞片層(yihong,etal.light-inducedcelldetachmentforcellsheettechnology,biomaterials,34(2013)11-18)。但是，紫外光對細胞存在一定的毒性並可能造成基因突變，故這種方法也存在一定缺陷。因此，利用可見光實現細胞脫附受到關注。

太陽能是人類取之不盡的清潔能源，太陽能電池材料即對可見光敏感，並可將其轉化為電。因此，如何將可見光相應的材料利用到可調控蛋白及細胞行為上，是一個值得研究的課題。本課題組之前利用可見光響應的si(p/n)結基板及鈣鈦礦薄膜器件作為細胞培養表面，光照後基板表面積累負電荷實現吸附蛋白的脫附並最終獲取細胞片層(106085948a，106047692a)。因此，表面光生電荷的積累會對蛋白的吸附狀態進行調控。生理條件下，蛋白帶負電，並與基板相互總用。有研究表明，當表面電性反轉(由負轉正)，蛋白的穩定性下降，與基板的連接可能會受到破壞，蛋白穩定的摺疊狀態及疏水鍵被打破，蛋白的多肽鏈可能會發生重排(cnickpace，etal,charge-chargeinteractionsinfluencethedenaturedstateensembleandcontributetoproteinstability)。因此，製備光生正電荷積累的表面去調控蛋白的吸附狀態，從而獲取細胞片層值得研究。

本發明選取可見光生正電荷的帶有肖特基結的si/gr複合薄膜作為細胞培養表面，通過可見光的強弱、光照時間、si的摻雜濃度及細胞的種類等來調控光敏材料對可見光的響應及表面光生正電荷的數量，研究可見光下帶正電的gr表面與吸附蛋白及細胞或細胞與細胞之間的相互作用，對於細胞片層脫附、組織工程、細胞治療等的發展都有重要的意義。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種用於可見光致體外培養的細胞/細胞薄層收割的矽/石墨烯(si/gr)基複合表面及其構建方法，該si/gr基複合表面是典型的「三明治」結構，可有效吸收可見光，並通過肖特基結將電子和空穴分離，使gr表面帶正電，此外該複合表面具有良好的細胞相容性。利用該si/gr基複合表面作為細胞培養表面，在可見光照射下gr表面帶正電使得表面吸附的蛋白層脫附，最終高效溫和的獲取低損傷的完整細胞片層。

本發明的一種用於可見光致體外培養的細胞/細胞薄層收割的矽/石墨烯(si/gr)基複合表面採用典型的「三明治」結構，所述的si/gr基複合表面自下而上依次包括si基板、單層gr及蛋白層，所述的si/gr具有肖特基結，所述的si基板為n型摻雜；所述的蛋白層為胎牛血清、牛血清白蛋白、纖連蛋白或膠原蛋白層。

優選地，其si基板厚度為100～1000μm，si基板晶面為(100)或(111)，si基板摻雜濃度為5×1015～1×1018/cm3；所述gr的厚度為0.3～0.4nm；所述的蛋白層為胎牛血清、牛血清白蛋白、纖連蛋白或膠原蛋白，可通過物理吸附製備得到。

本發明的一種用於可見光致體外培養的細胞/細胞薄層收割的矽/石墨烯(si/gr)基複合表面的構建方法如下：利用機械轉移的方法將一層gr轉移到潔淨的si基板的拋光面，乾燥後在氬氣環境下500攝氏度保溫60min，燒掉gr層的有機物，將所得si/gr用水和乙醇清洗乾淨，將樣品放入蛋白溶液中浸泡0.5～24h，在gr層上物理吸附獲得蛋白層，所述的蛋白溶液為胎牛血清、牛血清白蛋白溶液、纖連蛋白溶液、膠原蛋白溶液。所述的蛋白溶液濃度通常為0.1～10mg/ml。

利用上述的矽/石墨烯(si/gr)基複合表面進行可見光致細胞收割的方法，是以si/gr基複合表面作為細胞培養表面接種細胞並進行細胞體外培養，再採用可見光照射該培養表面，gr表面帶正電使吸附蛋白脫附，最終細胞及細胞片層從上述器件表面脫附。

所述細胞為在體外模擬生理環境下培養的貼壁細胞，包括成骨細胞、成纖維細胞、成肌細胞、上皮細胞、內皮細胞或骨髓間充質幹細胞。

上述方法具體包括以下步驟：

a.在進行體外細胞培養前，將所述的si/gr基複合表面以紫外光照或蒸氣消毒方式消毒；

b.將上述複合表面作為體外細胞培養表面，在其表面以2×104～2×106個/cm2的密度種植細胞，加入細胞培養基，並放入37攝氏度恆溫及5％二氧化碳的細胞培養箱中培養1～10天；

c.將經上述培養後的培養表面移入pbs中，以波長為400～800nm、強度30～300mw/cm2的可見光照射上述si/gr複合薄膜1～20min，即可使培養後的細胞或細胞薄層脫附。

本發明的方法選擇在可見光照射下存在光生正電的si/gr基複合表面，其可以高效的吸收可見光並實現電子空穴高效分離，使gr表面帶正電，在細胞培養過程中將該器件作為細胞培養表面，所培養的細胞在經可見光照射後，帶正電的gr表面誘發吸附蛋白脫附，使得細胞自發從培養器具表面脫離，實現細胞脫附。

與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果：

本發明所用的si/gr基複合表面利用gr表面光生正電實現細胞/細胞片層的脫附，避免了傳統酶解法細胞脫附時對細胞功能造成的損傷，具有高效的、低損傷、操作簡便並且適用細胞範圍廣等特點，具有很強的實用性。對於散在的細胞，可使85％以上的細胞脫附；對於細胞薄層，則可使細胞薄層完整脫附。本發明細胞培養表面所需的si/gr基複合材料成本低，易於實現，便於推廣應用。

附圖說明

圖1為實施例2中細胞脫附流程圖；

圖2為實施例2中光致脫附細胞片層的活染色螢光圖。

圖3為實施例2中光致脫附細胞片層的死染色螢光圖；

圖4為光學顯微鏡獲得的細胞片層再遷移螢光圖片。

具體實施方式

下面結合實施例和附圖來詳細說明本發明，但本發明並不僅限於此。

購買n型的單晶si片，單層gr經過機械轉移的方法製備於si基板表面，獲得含有肖特基結的si/gr基複合表面，將製備好的si/gr基複合表面放入蛋白溶液中浸泡，得到物理吸附的蛋白層。並以此複合表面膜作為細胞培養表面，進行下列培養。si基板的厚度為100～1000μm，晶面為(100)及(111)，摻雜濃度為5×1015～1×1018/cm3，單層gr的厚度為0.3～0.4nm，複合薄膜表面為單層gr。

實施例1

在潔淨的si基板的拋光面採用機械轉移的方法製備一層gr，乾燥後在氬氣環境下500攝氏度保溫60min，將所得si/gr用水和乙醇清洗乾淨，將樣品放入0.1mg/ml的胎牛血清蛋白溶液中浸泡0.5h，在gr層上物理吸附獲得蛋白層，得到si/gr基複合薄膜。在上述si/gr基複合薄膜表面，進行成骨細胞體外培養，接種密度為2×104個/cm2，放入37攝氏度恆溫及5％二氧化碳的細胞培養箱中培養1天後，以波長為400～800nm、強度30mw/cm2的可見光從細胞培養器皿頂部入射，照射20min，即可使95％細胞從表面脫離。

實施例2

在實例1所述的si/gr基複合薄膜表面，進行成骨細胞體外培養，接種密度為1×105個/cm2，放入37攝氏度恆溫及5％二氧化碳的細胞培養箱中培養培養7天後，細胞形成膜片，以波長為400～800nm、強度50mw/cm2可見光從細胞培養器皿頂部入射，照射10min，即可使細胞片層從表面脫離。圖1為採用nikon相機所觀察到的實施例2中培養細胞片層脫附的過程。可以看出經可見光照射後整個細胞片層實現完整脫附。圖2、3分別為實施例2中光致脫附後的細胞片層的活/死細胞染色，可以發現脫附後的細胞片層保持了高的活性。

實施例3

在潔淨的si基板的拋光面採用機械轉移的方法製備一層gr，乾燥後在氬氣環境下500攝氏度保溫60min，將所得si/gr用水和乙醇清洗乾淨，將樣品放入1mg/ml的牛血清白蛋白溶液中浸泡6h，在gr層上物理吸附獲得蛋白層。在上述si/gr基複合薄膜表面，進行成骨細胞體外培養，接種密度為5×105個/cm2，放入37攝氏度恆溫及5％二氧化碳的細胞培養箱中培養4天後，細胞形成膜片，以波長為400～800nm、強度100mw/cm2可見光從細胞培養器皿頂部入射，照射8min，即可使細胞片層從表面脫離。圖4為採用光學顯微鏡所觀察到的實施例3中培養細胞片層在可見光照後脫附再培養1天和3天後的遷移圖片。可以看出經可見光脫附後的細胞片層重新再培養後，能夠很好的爬出新的細胞，並保持良好的細胞形態及活力，說明可見光脫附的細胞片層保持了良好的再遷移性能，這在組織工程中細胞片層的再應用是很關鍵的。

實施例4

在潔淨的si基板的拋光面採用機械轉移的方法製備一層gr，乾燥後在氬氣環境下500攝氏度保溫60min，將所得si/gr用水和乙醇清洗乾淨，將樣品放入10mg/ml的纖連蛋白溶液中浸泡24h，在gr層上物理吸附獲得蛋白層。在上述si/gr基複合薄膜表面，進行成纖維細胞體外培養，接種密度為1×106個/cm2，放入37攝氏度恆溫及5％二氧化碳的細胞培養箱中培養3天後，細胞形成膜片，以波長為400～800nm、強度40mw/cm2可見光從細胞培養器皿頂部入射，照射15min，即可使細胞片層從表面完整脫離。

實施例5

在潔淨的si基板的拋光面採用機械轉移的方法製備一層gr，乾燥後在氬氣環境下500攝氏度保溫60min，將所得si/gr用水和乙醇清洗乾淨，將樣品放入5mg/ml的膠原蛋白溶液中浸泡6h，在gr層上物理吸附獲得蛋白層。在上述si/gr基複合薄膜表面，進行成肌細胞體外培養，接種密度為2×104個/cm2，放入37攝氏度恆溫及5％二氧化碳的細胞培養箱中培養10天後，細胞形成膜片，以波長為400～800nm、強度200mw/cm2可見光從細胞培養器皿頂部入射，照射5min，即可使細胞片層從表面完整脫離。

實施例6

在實例5所述的si/gr基複合薄膜表面，進行上皮細胞體外培養，接種密度為8×104個/cm2，放入37攝氏度恆溫及5％二氧化碳的細胞培養箱中培養7天後，細胞形成膜片，以波長為400～800nm、強度300mw/cm2可見光從細胞培養器皿頂部入射，照射1min，即可使細胞片層從表面完整脫離。

實施例7

在實例5所述的si/gr基複合薄膜表面，進行骨髓間充質幹細胞體外培養，接種密度為1×105個/cm2，放入37攝氏度恆溫及5％二氧化碳的細胞培養箱中培養7天後，細胞形成膜片，以波長為400～800nm、強度50mw/cm2可見光從細胞培養器皿頂部入射，照射6min，即可使細胞片層從表面完整脫離。

實施例8

在實例5所述的si/gr基複合薄膜表面，進行內皮細胞體外培養，接種密度為1.5×106個/cm2，放入37攝氏度恆溫及5％二氧化碳的細胞培養箱中培養2天後，細胞形成膜片，以波長為400～800nm、強度150mw/cm2可見光從細胞培養器皿頂部入射，照射3min，即可使細胞片層從表面完整脫離。

實施例9

在實例5所述的si/gr基複合薄膜表面，進行成纖維細胞體外培養，接種密度為5×104個/cm2，放入37攝氏度恆溫及5％二氧化碳的細胞培養箱中培養1天後，以波長為400～800nm、強度30mw/cm2可見光從細胞培養器皿頂部入射，照射5min，85％細胞從基板表面脫離。

實施例10

在實例5所述的si/gr基複合薄膜表面，進行成肌細胞體外培養，接種密度為4×104個/cm2，放入37攝氏度恆溫及5％二氧化碳的細胞培養箱中培養1天後，以波長為400～800nm、強度50mw/cm2可見光從細胞培養器皿頂部入射，照射20min，91％的細胞從基板表面脫離。

實施例11

在實例5所述的si/gr基複合薄膜表面，進行上皮細胞體外培養，接種密度為6×104個/cm2，放入37攝氏度恆溫及5％二氧化碳的細胞培養箱中培養1天後，以波長為400～800nm、強度100mw/cm2可見光從細胞培養器皿頂部入射，照射10min，97％的細胞從基板表面脫離。

實施例12

在實例5所述的si/gr基複合薄膜表面，進行骨髓間充質幹細胞體外培養，接種密度為5×104個/cm2，放入37攝氏度恆溫及5％二氧化碳的細胞培養箱中培養1天後，以波長為400～800nm、強度300mw/cm2可見光從細胞培養器皿頂部入射，照射8min，95％的細胞從基板表面脫離。

實施例13

在實例5所述的si/gr基複合薄膜表面，進行內皮細胞體外培養，接種密度為2×104個/cm2，放入37攝氏度恆溫及5％二氧化碳的細胞培養箱中培養1天後，以波長為400～800nm、強度200mw/cm2可見光從細胞培養器皿頂部入射，照射1min，85％的細胞從基板表面脫離。