一種增強間充質幹細胞分泌生物活性因子能力及培養液中活性因子的提取方法與流程

2024-03-27 20:17:05

本發明涉及一種用於增強動物間充質幹細胞分泌生物活性因子能力的方法，以及涉及一種提取間充質幹細胞培養液中生物活性因子的技術方法。

背景技術：

間充質幹細胞源於動物胚胎發育早期的中胚層和外胚層。間充質幹細胞是一種具有自我複製能力和多向分化潛能的成體幹細胞，屬於非終末分化細胞，它既有間質細胞，又有內皮細胞及上皮細胞的特徵。間充質幹細胞有體外貼壁生長的特性，利用這種特性，人們已經從骨髓、脂肪、外周血、胎盤、臍帶等多種組織中成功將其分離培養出來，這些組織成為間充質幹細胞實驗研究和臨床應用的重要來源。

間充質幹細胞在體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、軟骨、骨、肌肉、肌腱、神經、肝、心肌、胰島β細胞和內皮等多種組織細胞，連續傳代培養和冷凍保存後仍具有多向分化潛能。不論是自體還是同種異源的間充質幹細胞，一般都不會引起宿主的免疫反應。

間充質幹細胞具有多分化潛能，可產生多種生長因子、細胞因子、調節肽以及幹細胞特異性歸巢和營養因子等生物活性因子的細胞體系，所分泌的上述物質在局部形成複雜的生物活性因子網絡，並受缺血、缺氧、生長因子、性別和激素調節。

現已證實，幹細胞能表達、合成並分泌生長因子、細胞因子、調節肽及信號分子等多種生物活性因子，而且胚胎幹細胞和成體幹細胞以及不同來源的成體幹細胞所產生的生物活性因子譜相似，這些生物活性因子調節代謝、免疫、細胞分化、增殖、遷移、營養、存活、凋亡和組織器官功能。這些研究結果提示幹細胞是機體潛在的旁分泌/自分泌系統，植入後幹細胞的分泌功能不僅直接影響植入幹細胞自身的存活和分化，而且是幹細胞移植髮揮治療效應的重要機制之一。

幹細胞所分泌的生物活性物質在局部形成複雜的生物活性因子網絡，並受缺血、缺氧、生長因子、性別和激素調節。其分泌功能影響移植幹細胞自身及所在組織器官的結構、功能及其病理狀態下的修復，是幹細胞改善靶器官功能、抗凋亡、抗炎等療效的重要機制之一。

體內各組織中的氧濃度存在較大差別，且生理、病理狀態下均處於低氧環境，間充質幹細胞移植後也將處於低氧微環境。然而，目前間充質幹細胞在體外細胞培養時大多在常氧環境下進行，與體內正常組織低氧環境及病理狀態下低氧狀態相差較大.低氧環境對間充質幹細胞生物學特性的影響也有一些研究進展。適度的低氧能夠促進細胞增殖、遷移，抑制凋亡，影響細胞分化。

公開號為CN101461772A的發明專利提供了一種用於美容護膚的人幹細胞分泌因子的制 備方法。但是該專利方法所用的培養液含有胎牛血清成分。利用其技術提取的幹細胞分泌生物活性因子量較少，且存在血清的安全隱患，因此應用上局限性較大，僅適用於美容護膚方面的應用，對於更深一步的醫學治療不適用。

技術實現要素：

鑑於以上方法的缺點，本發明採取了較安全的無血清培養液對擬提取生物活性因子的幹細胞進行培養，並且增強了間充質幹細胞在體外培養過程中分泌生物活性因子的能力。

本發明解決其技術問題所採用的技術方案是：製備原代動物間充質幹細胞——無血清低氧培養、擴增——收集廢棄間充質幹細胞培養液——生物活性因子提取、濃縮、滅菌——高純度幹細胞生物活性因子提取液。

本發明選用無血清培養液培養間充質幹細胞。

優選地，選用Invitrogen公司STEMPRO MSC SFM培養液培養間充質幹細胞。

本發明採用低氧培養技術增加間充質幹細胞分泌生物活性因子的能力。

優選地，低氧培養間充質幹細胞所選用的氧氣濃度為1％～2％。

本發明定期對培養的間充質幹細胞的無血清培養液進行更換。

優選地，間充質幹細胞每培養3-4天對培養液進行半量更換，並收集廢棄培養液。

本發明對收集到的間充質幹細胞廢棄培養液進行生物活性因子的超濾和濃縮。

優選地，選用50KD中空纖維超濾柱進行超濾濃縮。

本發明對濃縮後的間充質幹細胞生物活性因子提取液進行過濾除菌。

優選地，選用孔徑為0.22μm的濾膜進行過濾除菌。

本發明的有益效果是：

1.對間充質幹細胞的培養使用無血清培養液，避免了血清源性汙染。

2.使用不含動物源性成分的無血清培養液培養間充質幹細胞，所提取到的生物活性因子在應用上不受血清等動物源性成分的應用限制。

3.採用低氧培養技術，特異性地增加間充質幹細胞分泌生物活性因子的能力，降低傳統方法生產間充質幹細胞生物活性因子的成本。

4.通過超濾除菌等步驟，保證了間充質幹細胞生物活性因子提取物的安全性。

5.用本方法技術所得到的間充質幹細胞生物活性因子提取液可應用於醫學治療、美容保健等各個領域。

附圖說明

圖1為顯示利用本發明方法培養的臍帶間充質幹細胞培養液中SCF(幹細胞因子)含量與常氧組的差異。

圖2為顯示利用本發明方法培養的臍帶間充質幹細胞培養液中SDF-1(基質細胞衍生 因子)含量與常氧組的差異。

圖3為顯示利用本發明方法培養的臍帶間充質幹細胞VEGF(血管表皮生長因子)含量與常氧組的差異。

圖4為顯示利用本發明方法培養的臍帶間充質幹細胞bFGF(鹼性纖維細胞生長因子)含量與常氧組的差異。

圖5為顯示利用本發明方法培養的臍帶間充質幹細胞G-CSF(粒細胞集落刺激因子)含量與常氧組的差異。

具體實施方式

下面結合具體實施例進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的應用範圍。

實施例1：

對人臍帶間充質幹細胞進行低氧培養。按如下步驟操作：(1)無菌條件下，將人臍帶切成0.7mm3左右大小的組織塊；(2)用Hank’s液衝洗後去除組織塊上殘留的血液並分離血管；(3)將處理後的組織塊用胰蛋白酶消化，觀察到細胞大部分分散時終止消化；(4)對消化後的物質過濾；(5)將所得濾液低速離心；(6)用Hank’s液對間充質幹細胞混懸液離心清洗5次；(7)在離心後的濾液中加入細胞培養液，製成細胞混懸液。(8)在2％氧氣濃度條件下，對臍帶間充質幹細胞進行培養。細胞傳至第3代，用流式細胞儀檢測培養所得細胞表面標誌物，結果CD31、HLA-DR、CD34、CD45陰性，CD44、CD73、CD90和CD105陽性，證實為臍帶間充質幹細胞。

實施例2：

取人臍帶間充質幹細胞為實驗材料。分為低氧濃度組(2％O2、5％CO2、93％N2)和正常氧濃度組(20％O2、5％CO2、75％N2)，具體操作如下：將人臍帶間充質幹細胞以1X104/cm2接種到6孔培養板上，每孔中加入培養液2ml(STEMPRO MSC SFM)。將常氧組各培養板放入20％O2濃度的培養箱中，低氧組各培養板放入2％O2濃度的三氣培養箱中培養，分別於培養後第24h、48h、72h，吸出相應培養孔的上清液，離心後分裝於EP管中，標記後置於零下20度冰箱中待測。取凍存的人臍帶間充質細胞的培養基上清液，並於常溫下解凍融化。酶聯免疫分析人臍帶間充質幹細胞細胞因子SCF、SDF-1、VEGF、bFGF、G-CSF的表達情況。結果如下：

低氧組培養基上清液中SCF含量在24h低於常氧組，且差異存在統計學意義，但隨時間延長，兩者差距逐漸縮小，48小時兩組SCF含量差異無統計學意義，72h低氧組SCF含量較常氧組顯著增高(圖1)。

與常氧組比較，培養後24h低氧組SDF-1濃度較常氧組低而後低氧組SDF-1濃度隨時間逐漸升高，並於72h明顯高於常氧組(圖2)。

與常氧組比較，低氧組VEGF濃度於培養後24h、48h兩組VEGF濃度差異不明顯，後隨培養時間的延長逐漸升高，56h開始明顯高於常氧組(圖3)。

與常氧組比較，培養後24h兩組bFGF濃度差異不顯著，後隨低氧組bFGF濃度不斷升高，48h開始明顯高於常氧組(圖4)。

與常氧組比較，低氧組G-CSF濃度於72h明顯高於常氧組(圖5)。

實施例3：

將用本發明方法提取的臍帶間充質幹細胞生物活性因子或幹細胞內生物活性物質加入到培養基中，並以此種濃度的培養基培養正常傳代至第8代的臍帶間充質幹細胞(此代細胞的增殖能力減弱，活性降低)，以不加生物活性提取因子的培養基培養傳至第8代的臍帶間充質幹細胞作為對照組。顯微鏡下觀察細胞的生長狀態，並於第3天收集細胞，與對照組相比，添加臍帶間充質幹細胞生物活性因子的組別，間充質幹細胞增殖能力顯著增強。