一種化學發光技術檢測DNA的方法與流程

2024-03-26 03:52:05 2

本發明屬於分析化學領域，具體涉及一種化學發光技術檢測dna的方法。
背景技術：
：魯米諾是常用的化學發光試劑，廣泛應用於各種化學發光分析檢測中。然而，魯米諾化學發光產生較高的背景信號，故其應用受到一定的限制。近年來，功能化的膠體金受到了研究者的青睞，可以使用釕配合物、魯米諾及其衍生物還原氯金酸的方法合成膠體金(cuih,wangw,duancf,etal.synthesis,characterization,andelectrochemiluminescenceofluminol-reducedgoldnanoparticlesandtheirapplicationinahydrogenperoxidesensor[j].chemistry,2007,13(24):6975-6984；gaow,qiw,laij,etal.thioureadioxideasauniqueeco-friendlycoreactantforluminolchemiluminescenceinthesensitivedetectionofluminol,thioureadioxideandcobaltions[j].chemicalcommunications,2014,51(9):1620-1623.)，其中，採用魯米諾還原氯金酸得到的膠體金稱為lumaunps，在雙氧水存在時得到較強的化學發光信號。由於雙氧水不穩定而且可與很多金屬離子反應，所以它的選擇性不好。鑑於現有技術的不足，本發明利用lumaunps—羥胺-o-磺酸化學發光檢測體系實現了dna的測定，具有靈敏度高、方法簡單等特點。技術實現要素：本發明旨在發明一種方法簡單、靈敏度高的測定dna的方法。鑑於現有技術的不足，本發明的目的在於提供一種化學發光技術檢測dna的方法。實現本發明目的技術方案是：一種化學發光技術檢測dna的方法，其原理是以魯米諾還原氯金酸，得到魯米諾膠體金納米粒子lumaunps，以探針dna修飾lumaunps，得化學發光探針；然後以磁珠為載體固定發卡結構的捕獲dna，在目標物dna存在時，捕獲dna的發卡結構被打開，並在化學發光探針上的探針dna的雜交作用下，通過催化發卡自組裝技術將化學發光探針連接在磁珠表面；經過磁分離後，再加入羥胺-o-磺酸，以lumaunps—羥胺-o-磺酸為化學發光體系，進行化學發光測定，根據產生的化學發光實現目標dna的測定。本發明是通過以下措施來實現的：一種化學發光技術檢測dna的方法，其特徵是包括以下步驟：(1)魯米諾膠體金納米粒子的製備；(2)捕獲dna修飾磁珠的製備；(3)探針dna修飾lumaunps的製備；(4)目標dna的檢測。優選的，所述的魯米諾膠體金納米粒子的製備包括以下步驟：實驗開始前，將所用的玻璃儀器用hno3/hcl(3:1,v/v)的王水浸泡24h後，用二次蒸餾水衝洗，放入烘箱烘乾。取一定量的1％的氯金酸溶液加去離子水稀釋成0.02％的氯金酸溶液並置於三口燒瓶中，在磁力攪拌下加熱回流煮沸；待溶液沸騰後，快速加入0.01ml～5ml0.01m的魯米諾溶液，繼續加熱煮沸，溶液的顏色由淺黃色變為黑色，最後變成酒紅色，40min後停止加熱，並在繼續攪拌下冷卻至室溫，得魯米諾膠體金納米粒子，即lumaunps，將製得的lumaunps轉移到棕色廣口瓶中，4℃下保存備用。優選的，所述的捕獲dna修飾磁珠的製備包括以下步驟：取10μl～100μl羧基化磁珠溶液放入1.5ml離心管中，用10μl～200μl濃度為0.1m咪唑緩衝液洗滌三次，然後分散到0.01ml～2ml含有0.1medc和0.05mnhs的0.1m咪唑緩衝液的中，在37℃條件下，振蕩反應30min；然後向離心管中加入10μl～200μl濃度為5.0×10-8m捕獲dna，在37℃條件下振蕩過夜，得到捕獲dna修飾磁珠，然後再用2.0ml0.1mpbs緩衝溶液清洗三次，最後分散到2.0mlpbs緩衝溶液中，4℃保存。優選的，所述的探針dna修飾lumaunps的製備包括以下步驟：將1μl～20μl的tcep加到10μl～200μl濃度為1.0×10-6m的探針dna溶液中，37℃振蕩活化1小時，再取100μl～1000μl合成好的lumaunps加入到該溶液中，在37℃條件下震蕩過夜，然後再加入10μl～200μl含0.3mnaclph8.2的10mmtris-hcl緩衝液；繼續震蕩48h後，在12000rpm的條件下離心30min後，將紅色沉澱用1mlph7.4的0.1mpbs緩衝溶液清洗，再次離心，如此重複三次，得探針dna修飾lumaunps，即化學發光探針。最後得到的化學發光探針分散到1000μlph7.4的0.1mpbs緩衝溶液中，4℃保存備用。優選的，所述的目標dna的檢測包括以下步驟：取10μl～200μl捕獲dna修飾磁珠溶液置於離心管中，然後取10μl～100μl含目標dna的溶液加入到此離心管中，37℃條件下震蕩反應40min，然後再加入10μl～100μl探針dna修飾lumaunps溶液，37℃條件下震蕩反應40min，通過目標dna與捕獲dna的作用、探針dna與目標dna和捕獲dna的作用，化學發光探針連接在磁珠表面；經過磁分離後，將磁性分離物分散在50μlph7.4的0.1mpbs緩衝溶液中，然後再加入羥胺-o-磺酸溶液，產生化學發光，根據化學發光強度定量，實現目標dna的測定。所述的dna序列為：捕獲dna：5`-atatacgccatgtagcattcggttaggcgtatatttgctt-nh2-3`；目標dna：5`-aatatacgcctaaccg-3`；探針dna：5`-sh-tatacgcctaaccgaatgcttaccacgcgtatagcatccga-3`本發明研究了不同濃度目標dna與化學發光強度之間的關係，得到了檢測目標dna的標準曲線，線性範圍及線性方程。發明的優點與效果當目標dna的濃度在80pm到10nm之間時，隨著目標dna濃度的變化，化學發光強度有明顯變化。經計算得到檢測目標dna的非線性方程為y＝3663.39648+332.34823x(y：化學發光強度；x：目標dna濃度的對數，單位為m)，線性相關係數為0.9987，檢測限為30pm(3σ)(圖2)。該測定方法的精密度通過對濃度為500pm的目標dna進行11次平行測定而計算得出，相對標準偏差為3.6％，表明本發明的測定方法有較好的重現性。另外，利用lumaunps-h2o2為檢測體系，在其他步驟相同時，按本發明的方法對目標dna進行檢測，測定的檢測限為500pm。表明本發明提出的一種化學發光技術檢測dna的方法具有高的靈敏度。附圖說明圖1檢測目標dna的原理示意圖。圖2目標dna的濃度與化學發光強度關係圖。具體實施方式下面的實例將進一步說明本發明的操作方法，但不構成對發明的進一步限制。實例1：一種化學發光技術檢測dna的方法1.實驗部分1.1儀器與試劑1.1.1儀器設備dhg鼓風乾燥箱(善志儀器設備有限公司，上海)；ar224cn型奧豪斯分析天平(青島中和恆信電子有限公司，青島)；thz型恆溫振蕩箱(佳源興業科技有限公司，北京)；rfl-1型超微弱化學發光檢測儀(瑞邁分析儀器有限公司，西安)；anke-tgl-16c飛翁牌高速離心機(安亭科學儀器廠，上海)。1.1.2試劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)、n-羥基丁二醯亞胺(nhs)、氯金酸(haucl4)從sigma公司購買；粒徑為0.5μm，濃度為10mg/ml的羧基磁珠從天津倍思樂色譜技術開發中心購買；魯米諾(luminol)、羥胺-o-磺酸(hosa)和tcep(三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽)購買於aladdin公司；0.01m的魯米諾用0.1mnaoh溶解，在棕色瓶中保存在4℃冰箱中；取1g氯金酸加100ml水配成1％的氯金酸溶液，用棕色瓶保存，使用前用二次蒸餾水稀釋。pbs緩衝溶液是0.10m，ph7.4，其配製方法是稱取0.1gkh2po4、4.0gnacl、1.45gna2hpo4·12h2o及0.1gkcl溶解於1l水中，即得。本實驗所用到的單鏈dna和發卡dna(由上海生工生物工程有限公司合成)的序列如下：捕獲dna：5`-atatacgccatgtagcattcggttaggcgtatatttgctt-nh2-3`；目標dna：5`-aatatacgcctaaccg-3`；探針dna：5`-sh-tatacgcctaaccgaatgcttaccacgcgtatagcatccga-3`。發卡結構的dna進行孵育處理後再使用。1.2lumaunps的合成實驗開始前，所用的玻璃儀器均用hno3/hcl(3:1,v/v)的王水浸泡24h後，用二次蒸餾水衝洗，放入烘箱烘乾。取100μl1％的氯金酸溶液加去離子水稀釋成50ml0.02％的氯金酸溶液並置於三口燒瓶中，在三口燒瓶中加磁子，並將其放入磁力攪拌器中，磁力攪拌下加熱回流煮沸。待溶液沸騰後，快速加入1ml0.01m的魯米諾溶液，繼續加熱煮沸40min，溶液的顏色由淺黃色變為黑色，最後變成酒紅色，40min後停止加熱並在繼續攪拌下冷卻至室溫。將製得的lumaunps轉移到棕色廣口瓶中，4℃下保存備用。1.3捕獲dna修飾磁珠的製備取50μl羧基化磁珠溶液放入1.5ml離心管中，用100μl濃度為0.1m咪唑緩衝液洗滌三次，然後分散到1ml含有0.1medc和0.05mnhs的0.1m咪唑緩衝液中，在37℃條件下，振蕩反應30min；然後在離心管中加入100μl濃度為5.0×10-8m捕獲dna，在37℃條件下振蕩過夜，得到捕獲dna修飾的磁珠，然後再用2.0ml0.1mpbs緩衝溶液清洗三次，最後分散到2.0mlpbs緩衝溶液中，4℃保存。1.4探針dna修飾lumaunps的製備將5μl的tcep加到100μl濃度為1.0×10-6m的探針dna溶液中，37℃振蕩活化1小時，再取600μl合成好的lumaunps加入到該溶液中，在37℃條件下震蕩過夜，然後再加入50μl含0.3mnaclph8.2的10mmtris-hcl緩衝液；繼續震蕩48h後，在12000rpm的條件下離心30min後，將紅色沉澱用1mlph7.4的0.1mpbs緩衝溶液清洗，再次離心，如此重複三次，得探針dna修飾lumaunps，即化學發光探針。最後得到的化學發光探針分散到1000μlph7.4的0.1mpbs緩衝溶液中，4℃保存備用。1.5目標dna的檢測取50μl捕獲dna修飾磁珠溶液置於離心管中，然後再取50μl含目標dna的溶液加入到離心管中，37℃震蕩反應40min，然後再加入50μl探針dna修飾lumaunps溶液，37℃條件下震蕩反應40min，通過目標dna與捕獲dna的作用以及探針dna與目標dna和捕獲dna的作用，化學發光探針連接在磁珠表面；經過磁分離後，將磁性分離物分散在50μlph7.4的0.1mpbs緩衝溶液中，然後再加入羥胺-o-磺酸溶液，產生化學發光。根據標準溶液濃度和化學發光強度關係作圖得標準曲線。實例2：樣品分析將含目標dna的樣品溶液按實例1中步驟1.5方法進行實驗，根據化學發光強度和實例1中步驟1.5所得標準曲線可以獲取目標dna含量。根據發明的方法對目標dna含量進行了測定，並採用標準加入法對方法進行了評價，樣品測定回收率為96.00–102.2％，測定結果見表1，本發明的方法在目標dna檢測中具有精密度高的特點。表1.樣品分析測定結果編號含量a,b標準加入量測得量回收率11.221.002.1896.0％23.595.008.67103.4％34.705.009.81102.2％a7次測量結果b單位：nm。sequencelisting青島科技大學一種化學發光技術檢測dna的方法3patentinversion3.3140dna人工序列1atatacgccatgtagcattcggttaggcgtatatttgctt40216dna人工系列2aatatacgcctaaccg16341dna人工序列1tatacgcctaaccgaatgcttaccacgcgtatagcatccga41當前第1頁12