一種樺孔茸菌絲體深層發酵的專用培養基和發酵方法

2024-03-26 04:31:05

專利名稱：一種樺孔茸菌絲體深層發酵的專用培養基和發酵方法
技術領域：
本發明涉及大型藥用真菌深層發酵方法及其專用培養基，特別是一種具有多種藥理效應的樺孔茸菌絲體深層發酵專用培養基及其發酵技術。
背景技術：
樺孔茸(Inonotus obliquus)屬擔子菌亞門、層菌綱、非褐菌目、多孔菌科、褐臥孔菌屬的一種生於樺樹上的藥用真菌，其菌絲體為黑色塊狀。主要分布於俄羅斯北部、北歐、日本(北海道)我國大興安嶺等北緯40°～50°的地區。樺孔茸在俄羅斯民間為治療多種疾病的藥用真菌。長期的動物實驗及臨床實驗表明使用樺孔茸無任何毒副作用，對糖尿病的治癒率為93％；對多種腫瘤細胞(如乳房癌、唇癌、胃癌、耳下腺癌、肺癌、皮膚癌、直腸癌、霍金斯淋巴癌)有明顯的抑制作用。有效地防止癌細胞轉移、復發，增強免疫能力，並且用於配合惡性腫瘤患者的放療、化療，增強病人的耐受性，減輕毒副作用；對愛滋病有明顯的抑制作用；有效清除體內的自由基，保護細胞，延長傳代細胞的分裂代數，增進細胞壽命，促進代謝，因而能有效地延緩衰老，長期服用可延年益壽；有效抑制傳染性病毒，預防感冒。有效預防高血壓，為血液的清潔劑和疼痛的緩解劑；對肝炎、胃炎、十二指腸潰瘍、腎炎有明顯的治療作用。並對嘔吐、腹瀉、胃腸功能紊亂有治療作用。研究成果還表明，樺孔茸菌絲體的水提物能顯著地提高不同年齡階段人群的睡眠質量。對不同年齡階段的失眠人群也有顯著的療效(發明專利號200410058531.2)。因此，樺孔茸菌絲體具有重大的藥學價值。由於樺孔茸分布於高寒地區，生長極為緩慢。野生狀態的樺孔茸遠遠不能滿足曰益增長的市場需求。本發明述及樺孔茸菌絲體液體深層發酵的專用培養基及其發酵方法。

發明內容
本發明的目的是提供一種樺孔茸菌絲體深層發酵的專用培養基和發酵方法。
本發明所提供的樺孔茸菌絲體深層發酵的專用培養基，是由產生澱粉的穀類、植物的塊根、塊莖、種子(包括水稻、小麥、玉米、高梁、土豆、紅薯等)的麥芽粉水解液或纖維素的酶水解液和含有較高蛋白質的大豆粉、麥皮的鹽酸水解液組成。在培養基中加入一定量的樺木科植物木屑可為發酵液中的兒茶酚類化合物合成提供引物。
澱粉類原料的處理方法為取適當粉碎的穀類原料若干，以水充分浸泡後，加入2倍體積的水蒸煮30-40分鐘，冷卻至37℃。植物塊莖、塊根等含澱粉類原料，洗淨後絞碎，加入2倍體積的水煮沸30分鐘，冷卻至37℃。將含有澱粉酶和其他多種酶的麥芽粉按1∶50加入處理後的原料中，37℃保溫6-12小時。
纖維素原料的處理方法纖維素材料洗淨後曬乾，充分粉碎後，加入2倍體積水，煮沸30分鐘，加入酶水解液37℃水解30-40小時。
蛋白類原料的處理方法為取適當粉碎的蛋白類原料若干，以水充分浸泡後，加入2倍體積的pH為2的稀鹽酸溶液，在80℃水解10-12小時。冷卻至室溫後以1N NaOH調pH為7.8左右備用。
優化培養基的配方取澱粉類或纖維素類原料的水解液73份，蛋白原料類鹽酸水解液24份，0.8份的KH2PO4和0.2份的MgSO4，2份樺木科植物木屑。
發酵方法優化培養基滅菌後，按4-10％的比例接入液體菌種，26℃環境通氣黑暗培養。通氣量根據培養體積而定。一般20升發酵罐為1立方米/分鐘。每增加20升通氣速度增加1立方米/分鐘。發酵時間歷時14-20天左右。
發酵產率以菌絲體的乾重比原料處理前重量計算，發酵產率在85％以上。
發酵液的特徵按上述培養基和發酵方法生產的樺孔茸菌絲體發酵液為深褐色，有濃鬱的香味。


圖1發酵液黑色素積累與培養時間的關係。
圖2發酵液菌絲體積累與培養時間的關係。
圖3發酵液茸菌絲體中兒茶酚類化合物的積累。
圖4發酵液對MCF-7腫瘤細胞的血清藥理血活性。
圖5發酵液對S180肉瘤的抑制作用。
圖6菌絲體對S180肉瘤的抑制作用。
具體實施方 式實施例1培養基原料的處理和培養基的優化澱粉類原料的處理方法為取適當粉碎的穀類原料若干，以水充分浸泡後，加入2倍體積的水蒸煮30-40分鐘，冷卻至37℃。植物塊莖、塊根類原料，去皮後絞碎，加入2倍體積的水煮沸30分鐘，冷卻至37℃。將含有澱粉酶和其他多種酶的麥芽粉按1∶50加入處理後的澱粉類原料中，37℃保溫6-12小時。
纖維素原料的處理方法纖維素材料洗淨後曬乾，充分粉碎後，加入2倍體積水，煮沸30分鐘，加入水解酶液37℃水解30-40小時(纖維素水解酶液生產過程另行申請專利)。
蛋白類原料的處理方法為取適當粉碎的蛋白類原料若干，以水充分浸泡後，加入2倍體積的pH為2的稀鹽酸溶液，在80℃水解10-12小時。冷卻至室溫後以1N NaOH調pH為7.8左右備用。
優化培養基的配方取澱粉類或纖維素類原料的水解液75份，蛋白原料類鹽酸水解液24份，0.8份的KH2PO4和0.2份的MgSO4，2份的樺木科植物木屑。
發酵方法優化培養基滅菌後，按4-10％的比例接入液體菌種，26℃環境通氣黑暗培養。通氣量根據培養體積而定。一般20升發酵罐為1立方米/分鐘。每增加20升通氣速度增加1立方米/分鐘。發酵時間歷時14-20天左右。
實施例2本發明培養基深層發酵菌的發酵液特徵1.培養液色素積累(OD值的變化)
取本發明培養基500毫升，置1升三角瓶中，滅菌後接入菌絲體，在恆溫振蕩器中26℃避光培養。每天無菌取發酵液2-3毫升，用分光光度計在496nm處測定吸光度。對於過濃的樣品，光密度值不在儀器測定範圍的先將樣品倍比稀釋，將所得的吸光值乘以稀釋的倍數。結果表明，用本發明培養基培養的樺孔茸菌絲在第10天開始積累黑色素，第16天達最高值(圖1)。
2.菌絲體生物量積累與培養天數關係曲線取本發明培養基500毫升，置1升盛有10顆直徑為6毫米玻璃珠的三角瓶中，滅菌後接入菌絲體，在恆溫振蕩器中26℃避光培養。菌絲體在玻璃珠的碰撞下形成均勻的直徑約為3-4毫米的菌球。每天無菌取發酵液2-3毫升，離心棄上清，菌絲體烘乾後稱重，菌絲體積累以乾物質/10毫升表示。結果表明，菌絲體在第7天開始進入指數生長期，在第17天達最高值。
實施例3發酵液菌絲體中兒茶酚類化合物的積累取本發明培養基500毫升，置1升盛有10顆直徑為6毫米玻璃珠的三角瓶中，滅菌後接入菌絲體，在恆溫振蕩器中26℃避光培養。菌絲體在玻璃珠的碰撞下形成均勻的直徑約為3-4毫米的菌球。每天無菌取發酵液3毫升，離心棄上清，菌絲體均漿後冷凍乾燥，菌絲體乾燥粉末在90℃甲醇中回流2小時，離心去上清。定容2毫升，用紫外分光光度計在275nm處測定OD值，對於OD值超過1的提取物，先作2倍體積稀釋，所的的OD值乘以稀釋的倍數。另取等量野生菌絲體的甲醇回流物作對照。結果表明，用本發明培養基深層培養樺孔茸菌絲體在第5天開始合成兒茶酚類化合物，第8天以後該類化合物合成速度加快，18天以後，合成速度逐漸停止。最終菌絲體中兒茶酚類化合物總量是野生型的70％左右(圖3)。
實施例4發酵液的藥理學活性1.發酵液的血清藥理學活性取SD大鼠18隻，分為3組，每組6隻。將發酵液分別做2倍、4倍體積稀釋，按原液、2倍稀釋液和4倍稀釋液對其中的3組連續灌胃9天，每鼠按1ml/100g給藥。另取2隻大鼠作為空白對照組，每天灌等體積的蒸餾水。每三天取各組大鼠2隻，乙醚輕度麻醉後在無菌室心臟取血5ml，置入無菌離心管中。200g離心20分鐘，無菌取血清，在58℃水浴中滅活30min，置-20℃冰箱保存。取96孔板，每孔加入大鼠血清20μl，100μl含5％FBS的DMEM培養基。再向每孔加2×104/毫升的MCF-7乳腺癌細胞80μl，在5％CO2，37℃的培養箱中培養48h。以不加大鼠血清的MCF-7細胞孔作為對照孔。MTT法測定腫瘤細胞存活率。按公式腫瘤細胞抑制率＝[(對照孔OD值-實驗孔OD)/對照孔OD值]×100％。結果表明，不同劑量的發酵液血清藥理血活性不同，其中2倍稀釋的發酵液顯示出較強的抗腫瘤細胞活性。不同給藥時間的大鼠血清對腫瘤細胞毒性不同。結果顯示，給藥6天的大鼠血清對腫瘤細胞表現出最強的細胞毒性(圖4)。
2.發酵液對實體瘤的抑制作用取體重為18-22g的ICR小鼠40隻，分為4組(10隻/組)，分別接種S180肉瘤。將發酵液分別做2倍、4倍體積稀釋，按原液、2倍稀釋液和4倍稀釋液於接種肉瘤的同一天分別對其中的3組連續灌胃10天，每鼠按0.2ml/10g給藥。另一組為空白對照組。第11天處死小鼠，取腫瘤稱重，並按公式抑瘤率＝[(空白組瘤重-實驗組瘤重)/空白組瘤重]×100％計算發酵液對腫瘤的抑制率。結果表明，三個劑量組的發酵液對S180肉瘤有顯著的抑制作用。空白組的平均瘤重在1.12克左右，經發酵液給藥的小鼠S180瘤重都在0.4克以下，抑制率分別為79.46％，80.35％和72.32％(圖5)。
3.菌絲體對實體瘤抑制活性取體重為18-22g的ICR小鼠60隻，分6組(10隻/組)，分別接種S180肉瘤。將菌絲體凍乾粉按20、60、100、140、180mg/kg於接種肉瘤的同一天分別對5組連續灌胃10天。另一組胃空白對照組。第11天處死小鼠，取腫瘤稱重，並按公式抑瘤率＝[(空白組瘤重-實驗組瘤重)/空白組瘤重]×100％計算發酵菌絲體對腫瘤的抑制率。結果表明，五個劑量組的發酵液對S180肉瘤有顯著的抑制作用。空白組的平均瘤重在1.12克左右，經菌絲體給藥的小鼠S180瘤重都在0.7克以下，其中，140mg/kg劑量組的平均瘤重僅為0.25克，抑制率達77.67％(圖6)。
權利要求
1.一種樺孔茸菌絲體深層發酵的專用培養基，它包括下列成分之一(a)培養基中還加有由富含澱粉的穀類、植物的塊根、塊莖、種子(包括土豆、紅薯、水稻、小麥、玉米、高梁等)的水解(酶解)產物；(b)培養基中澱粉原料可以由纖維素材料代替，纖維素材料經充分粉碎後，加入2-3倍體積水，煮沸30分鐘，加入酶水解液37℃水解30-40小時，水解(酶解)產物可作為樺孔茸菌絲體生長所需的碳源；(c)培養基中還加有蛋白質原料的鹽酸水解液，蛋白類原料經充分粉碎後，以水充分浸泡，加入適量體積的pH為2的稀鹽酸溶液，在80℃水解10-12小時，水解(酶解)產物冷卻至室溫後並以1N NaOH調pH為7.8左右，即可作為樺孔茸菌絲體生長所需的氮源；(d)培養基中還加有一定量樺木科植物木屑作為發酵液中的兒茶酚類化合物合成的引物；(e)發酵方法為培養基滅菌後，按4-10％的比例接入液體菌種，24-28℃黑暗環境中通氣攪拌培養。
2.按照權利要求1所述培養基，其中，所述碳源和氮源是由一定比例的澱粉的麥芽粉水解液或纖維素的酶水解液和含有較高蛋白質的大豆粉、麥皮的鹽酸水解液以及樺木科植物木屑組成，其配方為澱粉類或纖維素類原料的水解液58-78份，蛋白原料類鹽酸水解液19-29份，KH2PO40.8份、MgSO40.2份、樺木科植物木屑2份。
3.按照權利要求1所述發酵方法，其中，發酵方法為優化培養基滅菌後，按4-10％的比例接入液體菌種，24-28℃黑暗環境中通氣攪拌培養，通氣量根據培養體積而定，一般20升發酵罐為1立方米/分鐘，每增加20升通氣速度增加1立方米/分鐘，發酵時間歷時14-20天左右。
全文摘要
本發明公開了一種樺孔茸菌絲體深層發酵的專用培養基組成及其樺孔茸菌絲體深層發酵技術。該技術利用澱粉和纖維材料以及蛋白及水解(或酶解)物作為樺孔茸菌絲體深層發酵的碳源和氮源，可降低發酵成本，縮短生長周期。在培養基中加入一定量的樺木木屑作為樺孔茸菌絲體中兒茶酚類化合物合成的引物，可提高發酵液中具有藥理活性的次生代謝產物，從而提高發酵液的品質，縮小與樺孔茸野生菌絲體的差異。
文檔編號C12N1/14GK1804024SQ200510002018
公開日2006年7月19日 申請日期2005年1月12日 優先權日2005年1月12日
發明者鄭維發, 項小燕, 陳才法, 儲成才 申請人:鄭維發, 儲成才