一種利用黃綠木黴發酵製備煙用滇橄欖香料的方法

2024-03-03 04:51:15

一種利用黃綠木黴發酵製備煙用滇橄欖香料的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於微生物發酵及其應用領域，具體設及一株黃綠木黴新菌株。同時，本發 明還設及利用該菌株製備煙用濱橄攬香料的方法。
【背景技術】
[0002] 加香加料是捲菸工藝中的關鍵環節，是有效提升捲菸抽吸品質，形成捲菸特有風 格的有效手段之一。目前我國菸草中添加的煙用香料大多是採用傳統方法萃取再加 W調配 所得，雖然生產操作簡單，但也存在香氣單調、改善捲菸抽吸效果不明顯等缺點。利用微生 物對香原料進行發酵可W增加傳統提取香料中多種香氣物質的含量，提升香氣豐富性，進 而生產出香氣豐富、高品質的捲菸，滿足消費者對捲菸品質的要求。
[0003] 濱橄攬(Phyllanthus emblica Linn.)又名雲南餘甘子，是大戟科落葉灌木或喬 木植物餘甘子的果實，為一種重要的藥食兩用植物資源。濱橄攬果汁風味獨特，營養豐富， 除了含有胺基酸和微量元素外，更為重要的是它Vc含量高，且由於黃酬和單寧類物質的保 護，濱橄攬經加工後其Vc的留存率仍高達72 %，遠遠高於其它果蔬。果實入藥，具有清熱利 咽，潤肺化疲，生津止渴之功效。現代研究，濱橄攬具有抗氧化、清除自由基、抗腫瘤、防衰老 等作用。
[0004]木黴菌(Trichoderma spp.)廣泛分布於自然界，在腐木、種巧、植物殘體、有機肥、 ±壤和空氣中尤多。木黴菌生長營養要求簡單，生長速度快，對於工業化生產十分有利。黃 綠木黴(Trichoderma aureoviride)為木黴屬的一種，作為一種重要的生防因子，對植物病 原的括抗作用具有廣譜性、多制性，還能產生多種酶類分解±壤中的動植物殘體，增加±壤 肥力。已有對黃綠木黴的報導多集中在±壤改良、生物防治及生物肥料等方面。現有技術中 尚未見將黃綠木黴用於濱橄攬發酵製備煙用香料的報導。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一株黃綠木黴新菌株，該菌株具有 產纖維素酶，進而促進纖維素分解成寡糖或單糖的能力。
[0006] 本發明的目的還在於提供一種利用該菌株發酵濱橄攬製備煙用香料的方法。
[0007] 本發明的目的通過W下技術方案予W實現。
[000引除非另有說明，本發明所採用的百分數均為質量百分數。
[0009] 一種黃綠木黴（Trichoderma aureoviride化LMM-04菌株，CGMCC No. 10839,其具 有產纖維素酶，進而促進纖維素分解成寡糖或單糖的能力。
[0010] 利用所述菌株製備煙用香料的方法，包括W下步驟：
[0011] a)將黃綠木黴HLMM-04CGMCCNo.l0839菌株活化兩次後，接種於裝有200mLPDA 液體培養基的S角瓶中，在20~35 °C，1 SOrpm下發酵培養1~7d;所述的PDA液體培養基：馬 鈴馨200g，葡萄糖20g，補蒸饋水至lL，p冊.5~8.5，115°C高壓滅菌15min;
[0012] (2)發酵液過濾去除菌體，取上清液緩慢加入硫酸氨至80%飽和度，4°C下靜置過 夜，離屯、收集沉澱物並溶於2mL緩衝液中，再用緩衝液進行透析，得到粗酶液;所述的緩衝液 為：0.02mol/L Na2HP〇4-fe出P〇4，pH 7.3;
[0013] (3)將濱橄攬破碎後加入兩倍重量的水，混合均勻，調pH至6.0;加入黃綠木黴 HLMM-04粗酶液，發酵，粗酶液添加量為濱橄攬質量的5%~20%，發酵溫度30°C，發酵時間2 ~化；回流提取化，過濾除渣，將上清液減壓濃縮，即得所需煙用香料。
[0014] 進一步的，為防止香料變質，按煙用香料重量的5%添加丙二醇。
[0015] 步驟(1)中最適宜的產香條件為初始抑6.5,培養溫度28°C，培養時間5d。
[0016] 相對於現有技術，本發明具有W下優點：
[0017] (1)本發明首次將黃綠木黴應用於煙用香料製備領域。採用黃綠木黴HLMM-04菌株 發酵液處理濱橄攬，與未處理對照相比，在原有濱橄攬特徵香氣保持的同時，具有生津，減 少喉部刺激，改善餘味的作用。
[0018] (2)本發明成本低廉，操作簡單，便於實現大規模工業化生產，應用前景良好。
[0019] 保藏生物材料的說明
[0020] 本發明的菌株，已於2015年5月22日，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中屯、(CGMCG);該中屯、地址：中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生 物研究所。該菌株分類命名為黃綠木黴（Trichoderma aureoViride)HLMM-04，保藏號為 CGMCC No.10839。
【具體實施方式】
[0021] 下面通過實施例對本發明做進一步的詳細說明，但實施例並不是對本發明技術方 案的限定。
[0022] 實施例1
[0023] 1、黃綠木黴HLMM-04菌株的適宜產酶條件
[0024] 1.1培養基初始抑對HLMM-04菌株產酶的影響
[00巧]將液體培養基的抑分別調到5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5,在28°C、120巧m下振 蕩培養3天後，測定纖維素酶活，表明最適宜的初始抑為6.5。
[0026] 1.2培養溫度對HLMM-04菌株產酶的影響
[0027] 將接種後的液體發酵培養基分別置於20°C、25°C、28°C、32°C、35°C下，120r/min振 蕩培養3d後，測定纖維素酶活，表明最適宜的培養溫度為28°C。
[0028] 1.3培養時間對HLMM-04菌株產酶的影響
[0029] 將接種好的液體培養基(pH 6.5)置於恆溫恆溼箱中，281：，120以111111振蕩培養，每 24h測定一次纖維素酶活，培養到第5天時纖維素酶活達到最大值。
[0030] 2、黃綠木黴HLMM-04粗酶液製備方法
[0031] 根據W上優化結果，將黃綠木黴HLMM-04菌株活化兩次後，接種於裝有200mL PDA 液體培養基(pH 6.5)的=角瓶中，在28°C，ISOrpm下發酵培養5d。過濾去除菌體。取上清液 緩慢加入硫酸氨至80 %飽和度，4 °C下靜置過夜，離屯、收集沉澱物並溶於2mL緩衝液 (0.02mol/L化抽P04-化此P04的緩衝液，pH7.3)中，用同樣的緩衝液進行透析，得到粗酶 液。
[0032] 3、黃綠木黴HLMM-04菌株發酵製備煙用香料的方法
[0033] 將濱橄攬破碎後加入兩倍重量的水，混合均勻，調抑至6.0。加入黃綠木黴HLMM-04 粗酶液，發酵。粗酶液添加量為濱橄攬質量的15%，發酵溫度為30°C，發酵時間化。回流提取 池，過濾除渣，將上清液減壓濃縮，即得濱橄攬發酵煙用香料。
[0034] 為防止變質，按發酵香料重量的5 %添加丙二醇。
[0(X3日]4、產品特徵及理化性質
[0036] 所得發酵煙用香料為紅棟色流狀膏體，不澄清。產品理化性質見表1。
[0037] 表1黃綠木黴HLMM-04發酵濱橄攬香料的理化指標 [00；3 引

[0039] 5、捲菸加香實驗
[0040] 取濱橄攬發酵煙用香料0 . Ig，取無菌水稀釋50倍後，均勻噴灑在50g未加香葉組 中，裝入乾淨的密封袋內，於室溫下放置化後，將菸絲於12(TC烘箱中烘乾，使水分含量達到 將處理後的菸絲及對照放入恆溫恆溼箱中，在溫度22°C、溼度60%條件下平衡 2地，手工卷製成捲菸，由評吸專家組成的評吸小組進行感官評吸。W未發酵濱橄攬提取香 料及枯草芽抱桿菌發酵濱橄攬香料為對照。加香結果表明，濱橄攬黃綠木黴HLMM-04發酵香 料與對照區別明顯，具有生津，減少喉部刺激，改善餘味的作用。評價結果見表2。
[0041] 表2濱橄攬發酵香料評吸結果
[0042]

[0043] 實施例2
[0044] 重複實施例1，有W下不同點:粗酶液添加量為濱橄攬質量的5%，發酵時間化。
[0045] 1、產品特徵及理化性質
[0046] 所得發酵煙用香料為紅棟色流狀膏體，不澄清。產品理化性質見表3。
[0047] 表3黃綠木黴HLMM-04發酵濱橄攬香料的理化指標 [004引
[OC

[(K)加]2、捲菸加香實驗
[0051 ]取加香結果表明，濱橄攬黃綠木黴HLMM-04發酵香料與對照區別明顯，具有減少喉 部刺激，改善餘味的作用。評價結果見表4。
[0052]表4濱橄攬發酵香料評吸結果
[0化3]

[0054] 實施例3
[0055] 重複實施例1，有W下不同點:粗酶液添加量為濱橄攬質量的20%，發酵時間化。
[0056] 1、產品特徵及理化性質
[0057] 所得發酵煙用香料為紅棟色流狀膏體，不澄清。產品理化性質見表5。
[005引表5黃綠木黴HLMM-04發酵濱橄攬香料的理化指標
[0化9]
[0

[0061 ] 2、捲菸加香實驗
[0062] 取加香結果表明，濱橄攬黃綠木黴HLMM-04發酵香料與對照區別明顯，具有減少喉 部刺激，改善餘味的作用，但雜氣增加。評價結果見表6。
[0063] 表6濱橄攬發酵香料評吸結果
[0064]


【主權項】
1. 一種黃綠木黴（Trichoderma aureoviride)HLMM_04菌株，CGMCC No. 10839,其具有 產纖維素酶，進而促進纖維素分解成寡糖或單糖的能力。2. 利用權利要求1所述菌株製備煙用香料的方法，包括以下步驟： (1) 將黃綠木黴1麗-04 061〇：如.1839菌株活化兩次後，接種於裝有21^?0糹液體 培養基的三角瓶中，在20~35°C，180rpm下發酵培養1~7d;所述的PDA液體培養基：馬鈴薯 200g，葡萄糖20g，補蒸餾水至lL，pH5.5~8.5,115°C高壓滅菌15min; (2) 發酵液過濾去除菌體，取上清液緩慢加入硫酸氨至80%飽和度，4°C下靜置過夜，離 心收集沉澱物並溶於2mL緩衝液中，再用緩衝液進行透析，得到粗酶液;所述的緩衝液為： 0.02mol/L Na2HP〇4-NaH2P〇4,pH 7.3； (3) 將滇橄欖破碎後加入兩倍重量的水，混合均勻，調pH至6.0;加入黃綠木黴HLMM-04 粗酶液，發酵，粗酶液添加量為滇橄欖質量的5%~20%，發酵溫度30°C，發酵時間2~5h;回 流提取3h，過濾除渣，將上清液減壓濃縮，即得所需煙用香料。3. 根據權利要求2所述的製備煙用香料的方法，其特徵在於：為防止香料變質，按煙用 香料重量的5 %添加丙二醇。4. 根據權利要求2所述的製備煙用香料的方法，其特徵在於：步驟（1)中最適宜的發酵 培養條件為初始pH 6.5，培養溫度28 °C，培養時間5d。
【專利摘要】本發明公開了一種利用黃綠木黴發酵製備煙用滇橄欖香料的方法。所述菌株為黃綠木黴(Trichoderma aureoviride)HLMM?04 CGMCC No.10839，具有產纖維素酶，進而促進纖維素分解成寡糖或單糖的能力。將菌株通過活化、發酵、過濾、透析製得纖維素酶粗酶液，用於發酵滇橄欖，再經提取、過濾、減壓濃縮製成煙用香料。菌株的最適產酶條件為培養基初始pH 6.5，培養溫度28℃，培養時間5d。加香結果表明，所製備的香料具有生津、減少喉部刺激、改善餘味的作用。CGMCC No. 1083920150522
【IPC分類】C12R1/885, C11B9/00, C12N1/14
【公開號】CN105713845
【申請號】CN201610239878
【發明人】陳興, 張翼鵬, 劉秀明, 段焰青, 李源棟, 黨立志, 李海濤
【申請人】雲南中煙工業有限責任公司