檢測柑橘冬生疫黴褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法
2024-03-02 14:01:15 1
專利名稱：檢測柑橘冬生疫黴褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測柑橘冬生疫黴褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法，尤其涉及一種高靈敏性的應用二重PCR擴增技術檢測柑橘冬生疫黴褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法。
背景技術：
柑橘冬生疫黴褐腐病原菌Phytophthora hibernalis Carne具有寄主範圍廣，為害柑橘生產嚴重，分布地域廣的特點，且都可以帶病果實、組織或無性繁殖材料進行遠距離傳播。我國柑橘種植區域分布廣泛，近年來這些病原菌隨著引進優質的種子苗木傳人我國的機率越來越大。一旦該病傳入，將對我國柑橘產業造成極大危害。柑橘冬生疫黴褐腐病原菌引起的柑橘冬生疫黴褐腐病害是在澳大利亞西部的柑橘果實上首次發現的，隨後在其他國家和地區也陸續發現。該疫病是侵染柑橘引起的是一種毀滅性病害，侵染初期，果實表皮出現淺褐色變色，感染部位皮質堅硬，溼度適合時長出白色菌絲體。受害果實味苦、具腐臭味。中國的柑橘種植區域廣泛，地理氣候多樣，有適合病害發生的地區，故定殖可能性大。 近距離傳播方式有風雨、工具等傳播途徑，遠距離傳播主要以土壤、果實、繁殖材料進行傳播。該病害一直持續困擾著義大利、葡萄牙等地的柑橘生產。
柑橘枝瘤病原菌Sphaeropsis tumefaciens Hedges,主要危害墨西哥酸橙、來檬和大多數的橘科植物。表現枝瘤和叢枝兩類症狀,但以枝瘤及枝瘤潰瘍為主。帶病的植物組織可傳病原菌。病原菌可借風、雨等近距離傳播，帶病的植物組織如樹枝、病葉以及繁殖材料是遠距離傳播病原菌的途徑。許多柑橘栽培種都對此病敏感，影響極大。2008年5月 22日，歐盟食品安全局發布由法國當局完成的關於柑橘有害生物的風險評估報告就包括了該病原菌的評估。
目前針對疫黴屬真菌的系統發育已有部分研究，針對柑橘冬生疫黴褐腐病原菌的分子檢測技術也有PCR檢測的報導。2008年，張海峰等比較分析了冬生疫黴和其它疫黴的ITS序列，在此基礎上設計了 I對檢測冬生疫黴的特異引物751F/752R，該對引物可從冬生疫黴菌中擴增到一條長616 bp的DNA條帶，而其它19種疫黴和其它真菌均無擴增條帶。其檢測限度可達到每25 UL反應體系只需10 fg基因組DNA的水平，但帶菌柑橘樣品的擴增條帶不特別明顯。
針對柑橘枝瘤病原菌，目前，柑橘枝瘤病原菌的檢測僅見到有使用通用引物ITS4 和ITS5進行PCR檢測的報導。從NCBI的資料庫中搜索，也只有區區2條核糖體序列。因此，PCR引物設計成了難題。
由上可見，柑橘枝瘤病原以及柑橘冬生疫黴褐腐病原菌是國外的柑橘中常見的兩種對柑橘的危害很大的兩種病菌，因此提供一種更高靈敏性的同時檢測上述兩種病菌的檢測方法，成了本領域內的研究熱點。發明內容`
本發明解決了上述背景技術中的難題，提供了一種基於二重PCR擴增檢測柑橘枝瘤病原以及柑橘冬生疫黴褐腐病原菌的方法，該方法步驟簡單、能夠有效果的對兩種病菌進行檢測。
實現本發明上述目的所採用的技術方案為
一種基於二重PCR擴增檢測柑橘冬生疫黴褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法，其特徵在於包括以下步驟(I)、取一隻無菌離心管，在離心管中依次加入滅菌去離子水、PCR緩衝液、dNTPs混合物、正義引物PHIB1、反義引物PHIB2、正義引物SPT1、反義引物 SPT2、目標物DNA以及TaqDNA聚合酶，然後將其混合均勻後離心，將反應液離心至管底；
(2)、將離心管置於PCR儀上進行擴增，擴增後得到PCR反應產物；
(3)、PCR產物用2%-3%瓊脂糖凝膠電泳分離，經溴化乙錠溶液染色12_20min後， 在紫外透射儀上觀察PCR反應結果。
步驟(I)中所述的PCR緩衝液為IO X PCR緩衝液，所加入的去離子水、PCR緩衝液、 dNTPs混合物、正義引物PHIB1、反義引物PHIB2、正義引物SPT1、反義引物SPT2、目標物DNA 以及TaqDNA聚合酶之間的體積比為16 2. 5 1 1 1 1 1 1 :0. 5，其中正義引物PHIB1、反義引物PHIB2、正義引物SPTl以及反義引物SPT2的濃度均為10 μ M，dNTPs混合物的濃度為2. 5 mM each, TaqDNA聚合酶的濃度為5υ/μ 1，目標物DNA的濃度為100-200 ng/μ I。
步驟(2)中擴增的程序為94°C3min，94°C 30S，62°C 30S，72°C 30S，循環 32-36 次，最後72°C補時5min。
本發明提供的基於二重PCR擴增檢測柑橘冬生疫黴褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法有以下優點(I)、該方法能準確診斷出柑橘是否攜帶有這兩種檢疫性的病原真菌；(2)該方法採用二重PCR的方法，只需要半天就可以鑑定出柑橘冬生疫黴褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的種類，可以快速通關；(3)該方法重複性好，靈敏度高，目標物DNA只需要 IOOng/ μ L就可以鑑定出柑橘攜帶病原真菌的種類。
圖1為實施例1中的凝膠電泳檢測結果圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明做詳細具體的說明。
本實施例中菌種柑橘冬生疫黴褐腐病原菌(Phytophthora hibernalis Carne)購自美國ATCC菌種保藏中心，編號為32995 ，並嚴格按照檢疫危險性菌種進行操作與使用。 使用前經過DNA的PCR擴增、克隆和測序的驗證。
本實施例所用菌種柑橘枝瘤病原菌(Sphaeropsis tumefaciens Hedges)購自美國ATCC菌種保藏中心，編號為20908 ，並嚴格按照檢疫危險性菌種進行操作與使用。使用前經過DNA的PCR擴增、克隆和測序的驗證。
本實施例中目標物DNA的提取方法如下將100 μ I濃度為IO7孢子懸液塗布於鋪有滅菌玻璃紙的PDA和V8平板上，18°C下培養7-10天，刮取 菌絲冷凍備用。取O. 5g菌絲，置於離心管中，加2ml己預熱(65°C)的CTAB提取緩衝液中，將離心管顛倒混勻，65°C 水浴5min,輕輕混勻;力口入等體積的苯酌·:氯仿:異戍醇(25:24:1),混勻，12000r/min離心15min，取上清液於離心管中，再加入等體積氯仿異戊醇(24:1)混勻，12000r/min離心 15min，取上清液於離心管中，加入2倍體積的100%乙醇顛倒混勻，12000r/min離心lOmin，傾去上清液，用70%乙醇將沉澱洗滌兩次。洗滌結束後將含有DNA的離心管置於37°C溫箱中乾燥。乾燥後加30 μ I TE溶解沉澱，於-20°C保存備用。
以下實施例中正義引物PHIBl的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示 5，-TCGGGTCTGAGCTAGTAGTCTT-3』 ；反義引物 PHIB2 的核苷酸序列如 SEQ ID NO 2 所示 5，-CTTCCACAACCAATTCCATTATGC-3。正義引物 SPTl 的核苷酸序列如 SEQ ID NO 3 所示 5' -GAACGCAGCGAAATGCGATAAG- 3';反義引物 SPT2 的核苷酸序列如 SEQ ID NO :4 所示 5' -ATGCTNAAGTTCAGCGGGTAT- 3' 。
實施例1
本實施例中二重PCR反應體系的總體積為25μ 1，具體的檢測方法如下(1)取一隻無菌離心管，在離心管中依次加入滅菌去離子水、PCR緩衝液、濃度為2. 5mM each的 dNTPs混合物、濃度為1(^11的正義引物？!1181、濃度為10 μ M的反義引物PHIB2、濃度為 10 μ M的正義引物SPT1、濃度為10 μ M的反義引物SPT2、濃度為lOOng/μ I的目標物DNA以及濃度為5υ/μ I的TaqDNA聚合酶，各物質的體積分別為:16 μ 1、2· 5 μ 1、1 μ 1、1 μ 1、1 μ1、 1μ1、1μ1、1μ1、0. 5μ1。然後將其混合均勻後離心,將反應液離心至管底。
(2)、將離心管置於PCR儀上進行擴增，擴增程序為94°C下3min，94°C下30S， 62°C下30S，72°C下30S，循環36次，最後72°C下補時5min，擴增後得到PCR反應產物。
(3)、PCR產物用3%瓊脂糖凝膠電泳分離，經溴化乙錠溶液染色20min後，在紫外透射儀上觀察PCR反應結果。
結果顯示應用引物對PHIB1/PHIB2與SPT1/SPT2進行二重PCR擴增，同時檢測柑橘冬生疫黴褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌，在瓊脂糖凝膠上可以觀察到僅有泳道5上有2 條清晰的特異性的DNA片段(307bp和407 bp)，如圖1所示，圖1中泳道M，DL2000;泳道 1，冬生疫黴菌+水；泳道2，枝瘤病原菌+水；泳道3，冬生疫黴菌+PHIB，泳道4，枝瘤病原菌+SPT ;泳道5，冬生疫黴菌+枝瘤病原菌+PHIB +SPT ;泳道6，冬生疫黴菌+SPT ;泳道7， 枝瘤病原菌+ PHIB0
實施例2
本實施例中二重PCR反應體系的總體積為25μ 1，具體的檢測方法如下(1)取一隻無菌離心管，在離心管中依次加入滅菌去離子水、PCR緩衝液、濃度為2. 5mM each的 dNTPs混合物、濃度為1(^11的正義引物？!1181、濃度為10 μ M的反義引物PHIB2、濃度為 10 μ M的正義引物SPT1、濃度為10 μ M的反義引物SPT2、濃度為200ng/μ I的目標物DNA以及濃度為5υ/μ I的TaqDNA聚合酶，各物質的體積分別為14 μ 1、2. 5 μ1、I μ1、I μ1、I μ1、 I μ IU μ 1>1 μ1、0. 5μ1。然後將其混合均勻後離心,將反應液離心至管底。
(2)、將離心管置於PCR儀上進行擴增，擴增程序為94°C下3min，94°C下30S， 62°C下30S，72°C下30S，循環33次，最後72°C下補時5min，擴增 後得到PCR反應產物。
(3)、PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離，經溴化乙錠溶液染色13min後，在紫外透射儀上觀察PCR反應結果。
結果顯示應用引物對PHIB1/PHIB2與SPT1/SPT2進行二重PCR擴增，同時檢測柑橘冬生疫黴褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌，在瓊脂糖凝膠上可以觀察到有2條清晰的特異性的 DNA 片段(307bp 和 407 bp)。
胺基酸序列表:中華人民:ft.和W湖北出入境檢驗檢疫局；檢測柑橘冬生疫黴褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法 4 I 22 DNA :人工序列 :1tcgggtctga gctagtagtc tt72 2 24 DNA 人Τ:序列 2cttccacaac caartccatt atgc3 22；DNA :人工序列3gaacgcagcg aaatgcgata ag22
4 21 DNA:人工序列 4atgctnaagt tcagcgggta t2權利要求
1.一種基於二重PCR擴增檢測柑橘冬生疫黴褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法，其特徵在於包括以下步驟(1)、取一隻無菌離心管，在離心管中依次加入滅菌去離子水、PCR緩衝液、dNTPs混合物、正義引物PHIB1、反義引物PHIB2、正義引物SPT1、反義引物SPT2、目標物DNA以及TaqDNA聚合酶，然後將其混合均勻後離心，將反應液離心至管底； (2)、將離心管置於PCR儀上進行擴增，擴增後得到PCR反應產物； (3)、PCR產物用2%-3%瓊脂糖凝膠電泳分離，經溴化乙錠溶液染色12-20min後，在紫外透射儀上觀察PCR反應結果。
2.根據權利要求1所述的基於二重PCR擴增檢測柑橘冬生疫黴褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法，其特徵在於步驟(I)中所述的PCR緩衝液為IOXPCR緩衝液，所加入的去離子水、PCR緩衝液、dNTPs混合物、正義引物PHIB1、反義引物PHIB2、正義引物SPT1、反義引物SPT2、目標物DNA以及TaqDNA聚合酶之間的體積比為16 :2. 5:1 1 1 :1 :1 :1 :0. 5，其中正義引物PHIB1、反義引物PHIB2、正義引物SPTl以及反義引物SPT2的濃度均為10 μ M，dNTPs混合物的濃度為2. 5 mM each, TaqDNA聚合酶的濃度為5U/ μ 1，目標物DNA的濃度為 100-200 ng/μ I。
3.根據權利要求1所述的基於二重PCR擴增檢測柑橘冬生疫黴褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法，其特徵在於步驟(2)中擴增的程序為94°C 3min，94°C 30S，62°C 30S，72°C 30S，循環 32-36 次，最後 72°C補時 5min。
全文摘要
本發明提供了一種基於二重PCR擴增檢測柑橘冬生疫黴褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法，包括以下步驟首先取一隻無菌離心管，在離心管中依次加入滅菌去離子水、PCR緩衝液、dNTPs混合物、正義引物PHIB1、反義引物PHIB2、正義引物SPT1、反義引物SPT2、目標物DNA以及TaqDNA聚合酶，然後將其混合均勻後離心，將反應液離心至管底；將離心管置於PCR儀上進行擴增，擴增後得到PCR反應產物；將PCR產物用2%-3%瓊脂糖凝膠電泳分離，經溴化乙錠溶液染色12-20min後，在紫外透射儀上觀察PCR反應結果。本發明提供的方法步驟簡單、能夠有效果的對兩種病菌進行檢測。
文檔編號C12Q1/04GK103031383SQ20121058342
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月28日 優先權日2012年12月28日
發明者王振華, 張建坤, 徐家文, 馮漢利 申請人:中華人民共和國湖北出入境檢驗檢疫局