柑橘潰瘍病菌螢光pcr快速檢測引物及試劑盒的製作方法
2024-04-02 17:22:05 1
專利名稱：柑橘潰瘍病菌螢光pcr快速檢測引物及試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體涉及一種柑橘潰瘍病菌螢光PCR快速檢測引物及包含該引物的試劑盒。
背景技術：
柑橘潰瘍病菌是柑橘上的最為重要的病害之一，在世界各國主要柑橘產區幾乎都有分布報導。該病菌嚴重時可導致整株死亡，一般情況下由於阻礙了幼苗正常生長發育，促使成年果樹的落葉、落果和樹勢削弱等原因，可導致產量降低、果實品質嚴重下降。1910年，該病菌在美國從日本引種時，隨枳苗傳入，後爆發了多次大規模流行，對美國的柑橘產業形成了毀滅性的災害，迫使美國政府耗費了大量的物力和財力進行了徹底地病樹根除措施，才基本控制了疫情的蔓延。目前，我國已將柑橘潰瘍病菌列為檢疫性有害物種，嚴格禁止入境。柑橘潰瘍病菌的傳統檢測與鑑定方法主要為病菌分離及致病性測定、血清學檢測技術、噬菌體檢測法。分離及致病性測定需要3至5天的時間才能觀察到有效症狀。我國的王中康等製備了該病菌的多克隆抗體，建立了 DAS-ELISA和PAS-ELISA快速檢測技術，也可用硝酸纖維代替傳統聚苯乙烯微量反應板，採用Dot-ELISA檢測。限為5X 103cfu/ml，可用玻片凝集反應、沉澱反應及免疫螢光法。但值得注意的是，單克隆抗體法無法檢測該種細菌的全部菌系。日本的研究人員曾利用柑橘潰瘍病菌噬菌體進行輔助鑑定。在採用噬菌體檢測時，一般要求所用噬菌體對該菌所有菌系產生溶菌作用而對其他菌無溶菌作用。在國內，王中康等(1990)也開展了相關研究，分離到專化性的噬菌體。現代檢測技術越來越傾向於聚合酶鏈式反應法(PCR法)等分子檢測手段，柑橘潰瘍病菌螢光PCR是一種建立在高解析度熔解曲線分析基礎上的高精度核酸檢測手段，該種技術無需後期圖像處理，所有檢測信息全部由螢光PCR儀自動採集完成，無需使用螢光探針即可完成基因、單鹼基篩 查，對於植物病原細菌一類病原微生物是一種理想的分子生物學檢測手段。
發明內容
本發明的目的是提供柑橘潰瘍病菌螢光PCR快速檢測，即一種能夠通過檢測柑橘潰瘍病菌特異性片段來判斷檢測樣品中是否存在柑橘潰瘍病菌的螢光引物。本發明的螢光引物，包括:I)序列為SEQID NO:1的上遊引物和序列為SEQID NO:2的下遊引物；2)對I)中的引物對通過轉換、插入、缺失或5』添加基所形成的引物對，且引物對擴增的產物在嚴謹條件下與I)的引物的擴增產物發生雜交；3)在I)或2)所描述的擴增片段上設計得到的引物對本發明的柑橘潰瘍病菌的螢光PCR快速檢測試劑盒，包括如下組分1)2倍濃度的PCR體系預混合物；
2)上遊引物和下遊引物，濃度分別為lOymol/L ；3) 20倍濃度的螢光染料；4)DNA 樣品 / 報告質粒，10 μ g/μ L ;5)雙蒸水。本發明根據柑橘潰瘍病菌保守基因序列，通過分子生物學分析獲得了特異性引物，該保守基因序列為不同柑橘潰瘍病菌菌系所共有，以保證從種的水平上檢測不同來源菌株的可靠性。另外，本發明的引物採用螢光標記，與普通PCR技術相比，不必用凝膠電泳方法來觀察，實現了檢測流程一體化封閉檢測。
具體實施例方式本發明根據柑橘潰瘍病菌保守基因序列，通過分子生物學分析獲得了特異性引物，該引物包括:I)序列為SEQID NO:1的上遊引物和序列為SEQID NO:2的下遊引物；2)對I)中的引物對通過轉換、插入、缺失或5』添加基所形成的引物對，且引物對擴增的產物在嚴謹條件下與I)的引物的擴增產物發生雜交；3)在I)或2)所描述的擴增片段上設計得到的引物對對於2)中描述的引物，包括在引物的5』添加了內切酶識別標識片段所形成的長度不同引物，以及鹼基替換、插入、刪除所形成的變異引物。這些由序列為SEQ ID Ν0:1的上遊引物和序列為SEQ ID NO:2的下遊`引物所衍生出的引物也能用來檢測柑橘潰瘍病菌，即2)中所描述的衍生引物所擴增出的核苷酸片段能夠在嚴謹條件下與I)的引物的擴增產物發生雜交；所述的嚴謹條件參照Roche公司的DIG高效DNA標記及檢測Starter Kitl手冊中的雜交條件。本發明的引物用於螢光PCR檢測柑橘潰瘍病菌，PCR反應體系中各組分構成比例如下:
權利要求
1.一種柑橘潰瘍病菌的實時螢光PCR快速檢測引物，其特徵在於，所述的引物包括序列為SEQ ID NO:1的上遊引物和序列為SEQ ID NO:2的下遊引物。
2.柑橘潰瘍病菌的螢光PCR快速檢測試劑盒，包括如下組分: 1)2倍濃度的PCR體系預混合物； 2)上遊引物和下遊引物，濃度分別為lOymol/L; 3)20倍濃度的螢光染料； 4)DNA樣品/報告質粒，10 yg/μ L 5)雙蒸水。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於上述的DNA樣品/報告質粒中包括序列為SEQ ID NO:3 的 片段。
全文摘要
本發明涉及一種柑橘潰瘍病菌的實時螢光PCR快速檢測引物及試劑盒，所述的引物包括序列為SEQ ID NO1的上遊引物和序列為SEQ ID NO2的下遊引物。本發明根據柑橘潰瘍病菌的全基因組序列，利用分子生物學分析獲得了具有特異性的保守序列，並設計其特異性擴增引物。該保守基因序列為不同柑橘潰瘍病菌株系所共有，以保證從種的水平上檢測不同來源的柑橘潰瘍病菌的可靠性。另外，本發明的引物採用螢光標記，與普通PCR技術相比，不必用凝膠電泳方法來觀察，實現了檢測流程一體化封閉檢測。
文檔編號C12R1/64GK103114135SQ20131002750
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月25日 優先權日2013年1月25日
發明者鄭媛, 王中康, 吳興海 申請人:鄭媛