一種柑橘潰瘍病菌侵染過程實時觀察方法
2024-04-02 18:22:05 1
專利名稱：一種柑橘潰瘍病菌侵染過程實時觀察方法
技術領域：
本發明涉及一種柑橘潰瘍病菌侵染過程觀察方法，尤其是涉及一種利用增強型綠色螢光蛋白基因egfp對柑橘潰瘍病菌進行標記，實現對柑橘潰瘍病菌侵染過程進行實時觀察的方法。
背景技術：
對柑橘潰瘍病菌入侵途徑的傳統研究手段，主要是掃描電鏡和透射電鏡兩種觀察方法，但是，這兩種方式均費時、費力，且不能實時地進行跟蹤。
利用綠色螢光蛋白基因對病原菌進行標記，可以對病原菌進行快速、原位、實時、 活體的觀察，有利於觀察病原菌的入侵過程和了解病原菌與寄主的互作。
目前，國內外已有不少利用螢光標記這一手段對病原菌進行標記，從而觀察植物病原菌與寄主互作的報導。
但是，在柑橘潰瘍病菌的研究中，由於多種原因，目前僅限於將綠色螢光蛋白基因作為報告基因與目的基因融合，以輔助研究目的基因。迄今為止，尚無利用綠色螢光蛋白標記對柑橘潰瘍病菌侵染過程進行實時觀察的報導。發明內容
本發明要解決的技術問題是，克服現有技術使用掃描電鏡和透射電鏡等費時費力的不足，提供一種操作簡便快捷的柑橘潰瘍病菌侵染過程實時觀察方法。
本發明解決所述技術問題所採用的技術方案是，一種柑橘潰瘍病菌侵染過程實時觀察方法，包括以下步驟(1)利用三親本雜交法將廣泛寄主載體PMPM63上的基因導入野生型柑橘潰瘍病菌，使野生型潰瘍病菌在不喪失其致病能力的情況下能產生綠色螢光蛋白，這種EGFP在紫外光激發下可經螢光顯微鏡或雷射共聚焦顯微鏡檢測到綠色螢光信號，從而獲得EGFP標記的潰瘍病菌；(2)將步驟(1)所得EGFP標記的潰瘍病菌通過噴霧方式接種到柑橘葉片表面及通過注射方式接種到柑橘葉肉間隙；(3)於不同的時間點撕取葉表皮或者利用冷凍切片等快速制樣方法制樣，EGFP標記的潰瘍病菌在激發光的激發下呈綠色，通過雷射共聚焦顯微鏡觀察柑橘潰瘍病菌在葉片表面及葉肉間隙的數量和分布。
採用本發明，能夠利用EGFP標記的柑橘潰瘍病菌對該病原菌在侵染柑橘過程中的附著、繁殖和空間分布進行實時觀察，從而獲得柑橘潰瘍病與柑橘互作的時空關係；不同柑橘品種對該病原菌的抗病性也能得到直觀體現；操作簡便、快捷。
圖1是野生型和EGFP標記的柑橘潰瘍病菌菌株螢光顯微鏡觀察到的形態及活體針刺接種後的症狀圖；圖2是EGFP標記的潰瘍病菌侵染冰糖橙葉片的過程圖。
具體實施方式
以下結合附圖和具體實施例對本發明作進一步詳細說明。 實施例
本實施例包括以下步驟(1)利用三親本雜交法將供體菌大腸桿菌DH5 α所含廣泛寄主載體ΡΜΡΜ63上的基因導入野生型柑橘潰瘍病菌，獲得EGFP標記的潰瘍病菌；經EGFP標記的柑橘潰瘍病菌在紫外光激發下發出綠色螢光，經螢光顯微鏡檢測到綠色螢光信號，被EGFP標記的柑橘潰瘍病菌，其生長動力學及致病力較野生型沒有顯著差異；所述三親本雜交法使用的供體菌大腸桿菌DH5 α (含egfp質粒pMPM63，該質粒具有慶大黴素抗性)由華中農業大學微生物重點實驗室提供；輔助菌大腸桿菌DH5 α冶mob 位點的質粒PRK2013，該質粒具有卡那黴素抗性)由義大利卡塔尼亞大學Vittoria Catara 教授提供；受體菌黃單胞桿菌柑橘致病變種Xac DL509 (Janthomonas axonopodis pv. ciiriXac DL509，具氨苄青黴素抗性)由本發明者分離得到，該菌株於2012年2月M日保藏於武漢的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO M 2012034。
(2)將步驟(1)所得EGFP標記的潰瘍病菌通過噴霧方式接種到冰糖橙葉片表面及通過注射方式接種到冰糖橙葉肉間隙；(3)於不同的時間點撕取葉表皮或者利用冷凍切片等快速制樣方法制樣，EGFP標記的潰瘍病菌在激發光的激發下呈綠色，通過雷射共聚焦顯微鏡可觀察潰瘍病菌在冰糖橙葉表面及葉肉間隙的數量和分布情況。
螢光觀察所用顯微鏡型號為Nikon SMZ1000。
冰糖橙潰瘍病菌在葉片表面及葉肉間隙的數量和分布情況觀察所用雷射共聚焦顯微鏡型號為Zeiss LSM 710。
圖1中A為EGFP標記的柑橘潰瘍病菌菌株在Nikon SMZ1000顯微鏡明場下的形態；B為EGFP標記的柑橘潰瘍病菌菌株在Nikon SMZ1000顯微鏡紫外激發光下的形態(帶綠色螢光菌落，菌落形態清晰可見);C為EGFP標記的柑橘潰瘍病菌活體針刺接種後的症狀; D為野生型柑橘潰瘍病菌菌株在Nikon SMZ1000顯微鏡明場下的形態；E為野生型柑橘潰瘍病菌菌株在Mkon SMZ1000顯微鏡紫外激發光下的形態(非綠色螢光菌落，菌落形態不清晰)；F為野生型柑橘潰瘍病菌活體針刺接種後的症狀。
圖2中A為噴霧接種冰糖橙葉面後M小時觀察到潰瘍病菌的分布情況(菌體為白色箭頭所指);B為噴霧接種6天時葉面潰瘍病菌的分布情況(菌體為白色箭頭所指);C為 B的局部放大圖(菌體為白色箭頭所指);D為注射接種2天後冰糖橙葉片葉肉間隙潰瘍病菌數量少，葉肉細胞保持正常均勻排列；E為注射接種4天後冰糖橙葉片葉肉間隙潰瘍病菌擴散至柵欄組織，葉肉細胞開始出現不規則；F為注射接種14天後冰糖橙葉片葉肉間隙全被潰瘍病菌佔據，葉肉細胞全部瓦解。
從圖2可見，觀察EGFP標記的潰瘍病菌與感病冰糖橙互作的時空關係，接種前期24小時冰糖橙葉片表面的潰瘍病菌數量少，接種6天以後葉片表面聚集大量潰瘍病菌，細菌分布於氣孔及氣孔以外的區域；對於葉肉間隙，接種2天內，潰瘍病菌數目少，主要分布在海綿組織，此時海綿組織細胞規則排列；接種4天時，細菌已經擴散至柵欄組織，且數量極顯著增加，海綿組織葉綠體分布出現不規則形狀；接種14天時，細菌佔據了整個葉肉間隙，海綿組織葉綠體細胞全部瓦解。
權利要求
1.一種柑橘潰瘍病菌侵染過程實時觀察方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)利用三親本雜交法將廣泛寄主載體PMPM63上的增強型綠色螢光蛋白基因egfp基因導入野生型的柑橘潰瘍病菌，獲得增強型綠色螢光蛋白EGFP標記的潰瘍病菌；(2)將步驟(1)所得EGFP標記的潰瘍病菌通過噴霧方式接種到柑橘葉片表面及通過注射方式接種到柑橘葉肉間隙；(3)撕取葉表皮或者利用冷凍切片方法制樣，在雷射共聚焦顯微鏡下觀察柑橘潰瘍病菌在葉片表面及葉肉間隙的數量和分布情況。
全文摘要
一種柑橘潰瘍病菌侵染過程實時觀察方法，包括以下步驟(1)利用三親本雜交法將廣泛寄主載體pMP2463上的增強型綠色螢光蛋白基因(egfp)導入野生型柑橘潰瘍病菌，獲得增強型綠色螢光蛋白(EGFP)標記的潰瘍病菌；(2)將獲得的EGFP標記的柑橘潰瘍病菌通過噴霧方式接種到柑橘葉片表面，通過注射方式接種到柑橘葉肉間隙；(3)撕取葉表皮或者利用冷凍切片方法制樣，在雷射共聚焦顯微鏡下觀察柑橘潰瘍病菌在葉表面及葉肉間隙的數量和分布情況。採用本發明，能夠利用EGFP標記的柑橘潰瘍病菌對該病原菌在侵染柑橘過程中的附著、繁殖和空間分布進行實時觀察，從而獲得柑橘潰瘍病與柑橘互作的時空關係；且操作簡便，快捷。
文檔編號C12R1/64GK102559843SQ20121005262
公開日2012年7月11日 申請日期2012年3月2日 優先權日2012年3月2日
發明者劉利平, 李大志, 李建揮, 鄧子牛, 龍桂友 申請人:湖南農業大學