一種毛細管電泳檢測抗體與多肽相互作用的方法
2024-04-03 04:26:05
專利名稱：一種毛細管電泳檢測抗體與多肽相互作用的方法
技術領域：
本發明涉及生物分析領域，特別涉及一種毛細管電泳檢測抗體與多肽相互作用的方法。
背景技術：
多價結合的相互作用在研究溶液中生物分子之間的相互作用起著非常重要的作用。例如，IgG抗體有兩個抗原多肽結合位點，可以結合兩種抗原，屬於一種二價結合作用。然而，通過色譜分辨1:1和1:2的IgG抗體-肽複合物，在溶液中是非常具有挑戰性的，因為在分子量、表面形狀和疏水性的差異兩者之間是非常接近的。因此，實現兩種不同比例的抗體-肽複合物的分離是非常困難的。 FLAG標籤多肽是一個與重組蛋白相融合的由8個親水胺基酸組成的多肽片段，傾向於定位在融合蛋白表面，因此更易與抗體結合。FLAG標籤只有8個胺基酸組成，因此它不會佔據融合蛋白的其他表位和結合域，導致融合蛋白·的功能、分泌性以及轉運發生改變。因此，該標籤被廣泛的應用於融合蛋白的表達、純化和檢測等方面。抗FLAG單克隆抗體能識別位於氨基端或羧基端的FLAG標籤，具有高靈敏度，高特異性和高親和力。生物分析技術在揭示抗體和多肽的相互作用中起到了至關重要的作用。目前研究抗體與多肽相互作用的方法主要有表面等離子體共振(SPR) (M. Oda, T. Azuma,Mol.1mmunol., 2000，37，1111 - 1122)，酶聯免疫吸附試驗(ELISA) (F. Hardy, L.Djavad1-Ohaniance, Μ. E. Goldberg, J. Tmmunn1. Methods. , 1997, 200, 155 - 159)和高效凝膠過濾色譜法(HPSEC) (B. J. McFarland, J. F. Katz, A. J. Sant et al.,J. Mol. Biol. , 2005，350，170 - 183)等。其中，SPR和ELISA通常需要將抗體分子固定，操作上帶來一定的困難，而且不適合檢測溶液中的抗體多肽相互作用。HPSEC色譜適合分離溶液中的蛋白，游離肽和蛋白質-肽複合物，但它無法提供更高的解析度。因此，目前大多數的分析方法只能測量單個多肽和抗體的結合過程，而無法分析抗體與多肽之間的多價相互作用。毛細管電泳(CE)具有高效、高速、微量、低消耗、操作模式多，分離方法開發容易等優點，由於具備如此多的優點以及分離生物大分子的能力，CE成為近年來發展最迅速的分離分析方法之一。尤其是將螢光檢測與毛細管電泳相結合，大大提高了檢測限，拓展了毛細管電泳的應用。本方法建立的抗體與抗原多肽相互作用的檢測方法，克服了已有方法存在的缺陷，可滿足大批量檢測需要，適用範圍較廣，有較高的精確性及較好的穩定性，解決了抗體與多肽之間多價相互作用的檢測難題。
發明內容
本發明要解決的技術問題是為了克服現有技術對抗體多肽相互作用檢測的不足，本發明提供一種毛細管電泳檢測抗體與多肽相互作用的方法。本發明解決其技術問題所採用的技術方案是一種毛細管電泳檢測抗體與多肽相互作用的方法，是首先將抗體與不同比例的多肽混合，然後進行毛細管電泳檢測，同時檢測抗體多肽複合物和螢光多肽的出峰時間及螢光強度，對抗體多肽複合物的電泳峰進行積分，根據公式可計算抗體與多肽的解離常數KD。該方法還可以檢測兩種外源多肽與抗體相互作用的競爭過程。本發明方法中所述的毛細管電泳檢測中，電泳緩衝液優選為25mM硼酸緩衝液，PH9.3。所述硼酸緩衝液經O. 22 μ m濾膜過濾。本發明方法可用於檢測各種抗體與多肽的相互作用。將抗體與多肽混合後，可根據毛細管電泳譜圖的變化檢測抗體多肽相互作用。實驗證明，該方法操作簡單，檢測靈敏度高，所需時間短。該方法是對傳統抗體與多肽的相互作用檢測技術進行改進，結合螢光檢測靈敏度高等優點，建立的一種新的高靈敏檢測技術。本發明的有益效果是，一種毛細管電泳檢測抗體與多肽相互作用的方法，操作容易，檢測靈敏度高，可實現抗體多肽相互作用檢測；可同時檢測多個螢光波長，從而減少了 誤差，提高了檢測的準確性。
下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。圖1 M2與FLAG多肽相互作用示意圖。圖2毛細管電泳螢光檢測M2與FLAG2_Cy5的相互作用。其中，a是FLAG2_Cy5的電泳譜圖山是112與FLAG2-Cy5混合物(M2:FLAG2-Cy5=l:2)的電泳譜圖。激發光源λ ex=530nm,檢測波長為670 nm。圖3毛細管電泳螢光檢測M2與FLAG1-FAM的相互作用。其中，a是FLAG1-FAM的電泳譜圖；b是M2與FLAG1-FAM混合物(M2: FLAG1-FAM=1: 2)的電泳譜圖。激發光源λ ex=490nm,檢測波長為520 nm。圖4毛細管電泳檢測M2與不同濃度的FLAGrCy5相互作用。FLAG1-CySz^C: a,1:1; b, 2:1; c，4:1; d, 8:1; e, FLAG「Cy5. ([M2] =1.35 μ Μ)激發光源 λ ex=530 nm，檢測波長為670 nm。圖5毛細管電泳檢測FLAG3多肽取代M2-(FLAG1-CyS)!複合物的FLAG1-CyS15其中，a是M2- (FLAGrCy5) ι複合物的電泳譜圖；b是過量FLAG3與M2- (FLAGrCy5) ι複合物混合後的電泳譜圖。
具體實施例方式現在結合附圖對本發明作進一步詳細的說明。如圖1所示，一種毛細管電泳檢測抗體與多肽相互作用的方法，其特徵在於首先將抗體與不同比例的多肽混合，然後進行毛細管電泳檢測，同時檢測抗體多肽複合物和螢光多肽的出峰時間及螢光強度，對抗體多肽複合物的電泳峰進行積分，根據公式可計算抗體與多肽的解離常數KD。該方法還可以檢測兩種外源多肽與抗體相互作用的競爭過程。實驗證明，該方法操作簡單，檢測靈敏度高，所需時間短。該方法是對傳統抗體多肽相互作用檢測技術進行改進，結合多波長螢光檢測靈敏度高等優點，建立的一種新的高靈敏抗體多肽相互作用檢測技術。
本發明一種毛細管電泳檢測抗體與多肽相互作用的方法的操作流程如下
I 抗 FLAG M2 單克隆抗體(ANT1-FLAG M2 Monoclonal Antibody，簡稱 M2)購自Sigma公司(貨號為F 3165)。首先將M2抗體與不同比例的FLAG多肽混合。2電泳緩衝液本方法中所用的電泳緩衝液為25 mM硼酸緩衝液(pH9. 3)。3毛細管本方法中所用的毛細管為未塗層毛細管(內徑75 μ m,長度60 cm,有效長度35 cm)ο4電泳檢測進樣電壓12 KV，進樣10 S，然後停止加壓。分離電壓18 KV，分離10 min，可同時檢測多個通道的螢光強度，收集、分析得到相應的檢測結果。5根據電泳峰判斷M2多肽複合物的濃度，根據公式(I) (2)，得到M2與多肽的解
離常數。
權利要求
1.一種毛細管電泳檢測抗體與多肽相互作用的方法，其特徵在於首先將抗體與不同比例的經螢光標記的多肽混合，然後分別進行毛細管電泳檢測，同時檢測抗體多肽複合物和螢光多肽的出峰時間及螢光強度，對抗體多肽複合物的電泳峰進行積分，根據公式可計算抗體與多肽的解離常數KD。
2.如權利要求1所述的一種毛細管電泳檢測抗體與多肽相互作用的方法，其特徵在於所述多肽為兩種，不同的多肽分別用不同的螢光分子標記，先將其中一種經標記的多肽與抗體混合，進行毛細管電泳檢測；然後再加入下一種經標記的多肽，進行毛細管電泳檢測，分別記錄不同時間進行的檢測結果，根據電泳峰的位置分析兩種多肽與抗體之間的競爭過程。
3.如權利要求1所述的一種毛細管電泳檢測抗體與多肽相互作用的方法，其特徵在於所述的毛細管電泳檢測中，電泳緩衝液為25 mM硼酸緩衝液，pH9. 3。
4.如權利要求3所述的一種毛細管電泳檢測抗體與多肽相互作用的方法，其特徵在於所述硼酸緩衝液經O. 22 μ m濾膜過濾。
5.如權利要求1所述的一種毛細管電泳檢測抗體與多肽相互作用的方法，其特徵在於所述的抗體為抗FLAG M2單克隆抗體；所述的多肽為FLAG標籤多肽，並用螢光染料分子T 己 O
全文摘要
本發明涉及一種毛細管電泳檢測抗體與多肽相互作用的方法，屬於生物分析領域。首先將抗體與不同比例的多肽混合，然後進行毛細管電泳檢測，同時檢測抗體多肽複合物和螢光多肽的出峰時間及螢光強度，對抗體多肽複合物的電泳峰進行積分，將積分面積換算為複合物濃度，根據公式可計算抗體與多肽的解離常數KD。該方法還可以檢測兩種外源多肽與抗體相互作用的競爭過程。實驗證明，該方法操作簡單，檢測靈敏度高，所需時間短。該方法是對傳統抗體多肽相互作用檢測技術進行改進，結合螢光檢測靈敏度高等優點，建立的一種新的高靈敏抗體多肽相互作用檢測技術。
文檔編號G01N27/447GK102998357SQ201210390038
公開日2013年3月27日 申請日期2012年10月15日 優先權日2012年10月15日
發明者王建浩, 王車禮, 邱琳, 蔣鵬舉, 夏江 申請人:常州大學