促進木瓜蛋白酶活性的方法與流程
2024-04-04 19:36:05 2
本發明涉及蛋白酶，具體涉及一種促進木瓜蛋白酶活性的方法。
背景技術：
木瓜蛋白酶是一種熱穩定性好、天然衛生安全的蛋白質水解酶，別名番木瓜酶或木瓜酶，分子量為23406，由一種單肽鏈組成，具有低特異性的特點，Cys25、His159和Asp158這三個胺基酸殘基存在於木瓜蛋白酶的活性中心部位。可從番木瓜的根、莖、葉和果實內提取出木瓜蛋白酶。根據《GB 2760-2011食品安全國家標準食品添加劑使用標準》的規定，木瓜蛋白酶可用作食品工業的加工助劑，即酶製劑。
木瓜蛋白酶的提取方法有烘乾法、單寧沉澱法、超濾法、絮凝法、鹽析法、超聲波法等，但大多數的提取方法存在降低酶活性，得到產品的純度低，汙染環境等諸多問題。雖然木瓜蛋白酶使用時具有pH範圍廣，熱穩定性好等優點，但卻受到提取工藝的限制。
染料木素是自然界中最常見的一種黃酮類化合物，本身具有抗氧化、抗腫瘤作用、對血管的防護作用、提高免疫力和抗菌消炎等作用。8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羥基–3–(4–羥基苯基)–4H–苯並吡喃–4–酮是染料木素與1-(2,4-二甲基苯基)哌嗪經化學合成得到的一種染料木素衍生物，是對染料木素的改性。8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羥基–3–(4–羥基苯基)–4H–苯並吡喃–4–酮分子式為C28H28N2O5，分子量472.52，其結構式如下：
目前，國內外未見8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羥基–3–(4–羥基苯基)–4H–苯並吡喃–4–酮在促進木瓜蛋白酶活性方面的應用報導。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種採用8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羥基–3–(4–羥基苯基)–4H–苯並吡喃–4–酮作為酶促進劑，促進木瓜蛋白酶活性的方法，不僅縮短豌豆蛋白的酶解時間，提高酶解效率，而且得到的豌豆蛋白多肽粉，清除自由基效率更高。
本發明所述的促進木瓜蛋白酶活性的方法，是將木瓜蛋白酶促進劑8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羥基–3–(4–羥基苯基)–4H–苯並吡喃–4–酮與木瓜蛋白酶一起添加到豌豆蛋白粉中，對豌豆蛋白粉進行酶解製備豌豆蛋白多肽粉。
其中：
木瓜蛋白酶促進劑的添加量為木瓜蛋白酶質量的2～4％，木瓜蛋白酶的添加量為豌豆蛋白粉質量的10～12％。
酶解的pH為6.3～6.5，酶解溫度為60～65℃，酶解時間為2～2.5h。
酶解之後進行滅酶，滅酶溫度為95～100℃，滅酶時間為5～10min。
具體步驟如下：
將豌豆蛋白粉溶解於磷酸緩衝溶液中，加入木瓜蛋白酶和木瓜蛋白酶促進劑，經酶解、滅酶、冷卻過濾後得到豌豆多肽液，豌豆多肽液再經冷凍乾燥得到豌豆蛋白多肽粉。
將豌豆蛋白多肽粉以15～17.2mg/mL的濃度添加到普通飲料中，製成抗氧化、抗衰老的功能性飲料。
木瓜蛋白酶促進劑8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羥基–3–(4–羥基苯基)–4H–苯並吡喃–4–酮，為染料木素與1-(2,4-二甲基苯基)哌嗪的化學合成物，具體製備過程如下：
在50mL圓底燒瓶中加入染料木素1mmol，無水乙醇25mL和37％甲醛水溶液0.08mL，加熱至55～60℃，反應液澄清後，加入1-(2,4-二甲基苯基)哌嗪0.19mL，室溫攪拌48h，有固體析出，過濾，固體經重結晶分離純化，得到本發明的酶促進劑。
本發明中木瓜蛋白酶促進劑與木瓜蛋白酶的一個精氨酸殘基以一個氫鍵相互結合，並以四個π鍵分別與另外兩個精氨酸殘基結合，這種結合導致了木瓜蛋白酶構象的改變，從而提高了木瓜蛋白酶的活性。
與現有技術相比，本發明的有益效果如下：
(1)本發明的木瓜蛋白酶促進劑提高了木瓜蛋白酶的活性，其與木瓜蛋白酶一起添加到豌豆蛋白粉中，具有協同作用，縮短了酶解時間，提高了酶解效率。
(2)豌豆蛋白粉酶解後經冷凍乾燥得到豌豆蛋白多肽粉，清除自由基效率更高；相比於未添加木瓜蛋白酶促進劑的豌豆蛋白多肽粉，羥基自由基清除率提高了5.3～18％，能夠用於抗衰老、抗氧化的功能性食品的開發。
具體實施方式
以下結合實施例對本發明做進一步描述。
實施例1
將豌豆蛋白粉溶解於pH值為6.5的磷酸緩衝溶液中，形成豌豆蛋白粉質量濃度為7％的分散液，加入佔豌豆蛋白粉質量12％的木瓜蛋白酶，同時加入佔木瓜蛋白酶質量2％的木瓜蛋白酶促進劑8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羥基–3–(4–羥基苯基)–4H–苯並吡喃–4–酮，在pH值為6.5，溫度為65℃條件下水浴震蕩酶解2h，酶解結束後，酶解液在100℃維持5min滅酶，然後冷卻至室溫，過濾得到豌豆多肽液。用甲醛滴定法測量水解度，發現加木瓜蛋白酶促進劑後，豌豆蛋白的酶解度提高33％，酶解時間縮短了25％。
將豌豆多肽液經真空冷凍乾燥得豌豆多肽粉。將豌豆多肽粉以16mg/mL的濃度添加到普通飲料中，得到具有抗氧化、抗衰老作用的功能性飲料，其羥基自由基清除率達65％，與未使用木瓜蛋白酶促進劑相比，清除率提高了18％。
實施例2
將豌豆蛋白粉溶解於pH值為6.3的磷酸緩衝溶液中，形成豌豆蛋白粉質量濃度為7％的分散液，加入佔豌豆蛋白粉質量10％的木瓜蛋白酶，同時加入佔木瓜蛋白酶質量4％的木瓜蛋白酶促進劑8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羥基–3–(4–羥基苯基)–4H–苯並吡喃–4–酮，在pH值為6.3，溫度為60℃條件下水浴震蕩酶解2.5h，酶解結束後，酶解液在95℃維持10min滅酶，然後冷卻至室溫，過濾得到豌豆多肽液。用甲醛滴定法測量水解度，發現加木瓜蛋白酶促進劑後，豌豆蛋白的酶解度提高16％，酶解時間縮短了7％。
將豌豆多肽液經真空冷凍乾燥得豌豆多肽粉。將豌豆多肽粉以15mg/mL的濃度添加到普通飲料中，得到具有抗氧化、抗衰老作用的功能性飲料，其羥基自由基清除率達58％，與未使用木瓜蛋白酶促進劑相比，清除率提高了5.3％。
實施例3
將豌豆蛋白粉溶解於pH值為6.4的磷酸緩衝溶液中，形成豌豆蛋白粉質量濃度為7％的分散液，加入佔豌豆蛋白粉質量11％的木瓜蛋白酶，同時加入佔木瓜蛋白酶質量3％的木瓜蛋白酶促進劑8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羥基–3–(4–羥基苯基)–4H–苯並吡喃–4–酮，在pH值為6.4，溫度為63℃條件下水浴震蕩酶解2.3h，酶解結束後，酶解液在95℃維持10min滅酶，然後冷卻至室溫，過濾得到豌豆多肽液。用甲醛滴定法測量水解度，發現加木瓜蛋白酶促進劑後，豌豆蛋白的酶解度提高25％，酶解時間縮短了15％。
將豌豆多肽液經真空冷凍乾燥得豌豆多肽粉。將豌豆多肽粉以17.2mg/mL的濃度添加到普通飲料中，得到具有抗氧化、抗衰老作用的功能性飲料，其羥基自由基清除率達61％，與未使用木瓜蛋白酶促進劑相比，清除率提高了11％。