一種成纖維細胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構建方法
2024-04-06 06:03:05 1
專利名稱：一種成纖維細胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構建方法
技術領域：
本發明屬於基因技術領域，尤其涉及一種成纖維細胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構建方法。
背景技術：
肺纖維化是一種危害人民健康的嚴重疾病，死亡率高，目前尚無有效的治療方法。目前研究表明，肺纖維化發生中，上皮_間質轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)是其重要的病理生理過程，而成纖維細胞生長因子II型受體(fibroblast growthfactor receptor 2,FGFR2) IIIb剪切體，即角質細胞生長因子受體(Keratinocyte GrowthFactor Receptor, KGFR)，其表型的丟失是EMT發生的關鍵。目前，還缺乏成纖維細胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構建方法，為肺纖維化提供基因治療的方法。
發明內容
本發明實施例的目的在於提供一種成纖維細胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構建方法，旨在解決目前還缺乏成纖維細胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構建方法，不能為肺纖維化提供基因治療的方法的問題。本發明實施例是這樣實現的，一種成纖維細胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構建方法，其特徵在於，該構建方法包括以下步驟FGFR2 IIIc表達載體的獲得與測序鑑定；FGFR2 IIIb 3-11外顯子片段的獲得；FGFR2 IIIb腺病毒表達載體的構建；FGFR2 IIIb腺病毒的包裝。進一步，所述FGFR2 IIIc 的插入位點為 5』XbaI/3』Hind III ;採用 Xba/Hind III從pRK5中切下FGFR2I He,同樣酶切位點插入pBluescriptll-SK質粒；採用通用引物T3、T7對FGFR2 IIIc進行了測序分析，通過與Pubmed公布的基因序列進行比對，證明目的基因片段確為FGFR2 IIIc0進一步，所述FGFR2 IIIb 3_11外顯子片段的獲得方法依據Pubmed公布的基因序列,通過對FGFR2 IIIb及IIIc mRNA表達序列的分析，可以得知Pst I與Nhe I兩個唯一的酶切位點分別位於FGFR2的外顯子3與11上，SK載體上的Pst I已在FGFR2 IIIc片段插入時消失；取小鼠肺提取總RNA,採用引物 Pl (forward) 5』 -ttg tac tgc age tag gacgg-3』與引物 P2 (Reverse) 5，-aac tea tac tcg gag acc cc_3，進行 RT-PCR擴增出 FGFR2 exon3至exonll之間的片段。通過膠回收法，提取目的片段；採用TA-Clone法擴增目的片段，擴增結果通過酶切法鑑定；在TA-Clone的PUC19載體上有一個EcoR V酶切位點， 而在FGFR2外顯子3到11片段上，僅在外顯子9上有一個EcoRV酶切位點，因此，擴增產物如有2條帶即為FGFR2IIIc部分，如只有一條帶，即為FGFR2IIIb ；用Pst I與Nhe I從PUC19上切取FGFR2 IIIb外顯子3到11片段，並取代SK載體上的FGFR2 IIIc上的外顯子3到11片段，從而得到完整的FGFR2 IIIb表達載體；該FGFR2 IIIb表達載體同樣採用通用引物T3、T7對外顯子3_11部分進行了測序分析，並與前述FGFR2 IIIc測序結果進行了比對分析，證實了我們所得載體確為FGFR2IIIb表達載體。進一步，載體內FGFR外顯子3至外顯子11的序列測序結果如下
權利要求
1.一種成纖維細胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構建方法，其特徵在於，該構建方法包括以下步驟 FGFR2 IIIc表達載體的獲得與測序鑑定； FGFR2 IIIb 3-11外顯子片段的獲得； FGFR2 IIIb腺病毒表達載體的構建； FGFR2 IIIb腺病毒的包裝。
2.如權利要求1所述的成纖維細胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構建方法，其特徵在於，所述FGFR2 IIIc的插入位點為5』XbaI/3』Hind III ;採用Xba/Hind III從pRK5中切下FGFR2 IIIc，同樣酶切位點插入pBluescriptll-SK質粒；採用通用引物T3、T7對FGFR2 IIIc進行了測序分析，通過與Pubmed公布的基因序列進行比對，證明目的基因片段確為 FGFR2 IIIc0
3.如權利要求1所述的成纖維細胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構建方法，其特徵在於，所述FGFR2 IIIb 3-11外顯子片段的獲得方法 依據Pubmed公布的基因序列，通過對FGFR2 IIIb及IIIc mRNA表達序列的分析，可以得知Pst I與Nhe I兩個唯一的酶切位點分別位於FGFR2的外顯子3與11上，SK載體上的Pst I已在FGFR2 IIIc片段插入時消失； 取小鼠肺提取總 RNA,採用引物 Pl (forward) 5』-ttg tac tgc age tag gacgg-3』與引物 P2 (Reverse) 5，-aac tea tac tcg gag acc cc_3，進行 RT-PCR 擴增出 FGFR2 exon3 至exonll之間的片段。通過膠回收法，提取目的片段； 採用TA-Clone法擴增目的片段，擴增結果通過酶切法鑑定；在TA-Clone的PUC19載體上有一個EcoR V酶切位點，而在FGFR2外顯子3到11片段上，僅在外顯子9上有一個EcoRV酶切位點，因此，擴增產物如有2條帶即為FGFR2IIIC部分，如只有一條帶，即為FGFR2IIIb ； 用Pst I與Nhe I從PUC19上切取FGFR2 IIIb外顯子3到11片段，並取代SK載體上的FGFR2 IIIc上的外顯子3到11片段，從而得到完整的FGFR2 IIIb表達載體； 該FGFR2 IIIb表達載體同樣採用通用引物T3、T7對外顯子3-11部分進行了測序分析，並與前述FGFR2 IIIc測序結果進行了比對分析，證實了我們所得載體確為FGFR2IIIb表達載體。
4.如權利要求3所述的成纖維細胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構建方法，其特徵在於，載體內FGFR外顯子3至外顯子11的序列測序結果如下
5.如權利要求1所述的成纖維細胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構建方法，其特徵在於，為使FGFR2 IIIb能成功進入生物體內進行表達，必須構建FGFR2 IIIb腺病毒表達載體；應用Xba/Hind III酶切位點從pSK-FGFR2 IIIb上切下FGFR2 IIIb片段，並轉入AdTrack-CMV載體中，構建成含FGFR2_IIIb的腺病毒載體； pAdTrack-FGFR2_IIIb 載體構建完成後，米用引物 Pl (forward) 5』 -ttg tactgc agetag gac gg_3，與引物 P2 (Reverse) 5，-aac tea tac tcg gag acc cc_3，進行了 PCR 及酶切鑑定； pAdEasy-1被存儲在BJ5183細菌中，參照分子克隆手冊製備AdEasy感受態細胞；將AdTrack-FGFR2-1IIb質粒經Pme I酶切線形化後，轉染AdEasy感受態細胞，線形化的AdTrack-FGFR2-1IIb 與 AdEasy-1 進行同源重組形成 AdEasy-FGFR2_IIIb ； 提取AdEasy-FGFR2-1IIb質粒進行直接電泳和PCR鑑定，PCR鑑定時的正向引物位於第8外顯子上，結果表明pAdEasy-FGFR2-1IIb載體構建正確。
6.如權利要求1所述的成纖維細胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構建方法，其特徵在於，FGFR2 IIIb腺病毒的包裝方法為將pAdEasy-FGFR2-1IIb感染293細胞，21天後收穫了原代的FGFR2-1IIb腺病毒(KGFR/AAV)。
7.如權利要求1所述的成纖維細胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構建方法，其特徵在於，FGFR2 IIIb (KGFR)/AAV擴增後首先進行了滴度測定與A549細胞感染率的檢測，並從mRNA水平、蛋白水平對KGFR/AAV病毒的KGFR表達進行鑑定，鑑定方法為 步驟1，FGFR2 IIIb/AAV的滴度測定，採用96孔板螢光計數法檢測了 Ad-KGFR病毒原液的滴度為3 X 106PFU/mL ; 採用流式細胞儀陽性螢光細胞計數法檢測了 Ad-KGFR病毒對A549細胞與小鼠胚胎成纖維細胞感染的陽性率；感染72小時後，Ad-KGFR病毒原液對A549細胞的感染的陽性率為.95. 5%，對小鼠胚胎成纖維細胞感染的陽性率為92. 8%。
步驟2，FGFR2 IIIb腺病毒在A549細胞中的表達，將收穫的KGFR/AAV感染A549細胞，兩天即可見陽性感染細胞；步驟3，KGFR-AAV病毒顆粒的電鏡觀察，透射電鏡觀察可見直徑約90微米的病毒顆粒; 步驟4，KGFR腺病毒表達KGFR的雙螢光鑑定，將KGFR腺病毒轉染小鼠成纖維細胞，陽性感染細胞有綠色螢光表達，在此基礎上，採用KGFR抗體作為一抗、羅丹明標記的IgG作為二抗，證明了小鼠成纖維細胞上KGFR的存在，未轉染細胞為陰性； 步驟5，KGFR腺病毒表達KGFR的mRNA水平與蛋白水平鑑定，KGFR腺病毒轉染A549細胞72小時後，提取細胞mRNA與蛋白質，採用RT-PCR與Western Blot的方法，對KGFR腺病毒表達載體轉染A549細胞後的表達功能進行了鑑定；採用KGFR腺病毒轉染小鼠成纖維細胞72小時後，提取細胞mRNA，進行了 RT-PCR鑑定。
全文摘要
本發明一種成纖維細胞生長因子II型受體IIIb剪切體的構建方法，包括以下步驟FGFR2 IIIc表達載體的獲得與測序鑑定；FGFR2 IIIb 3-11外顯子片段的獲得；FGFR2 IIIb腺病毒表達載體的構建；FGFR2 IIIb腺病毒的包裝。利用本發明構建的成纖維細胞生長因子II型受體IIIb剪切體，採用昆明白小鼠進行實驗表明，博萊黴素60mg/kg體重氣管內灌注在第3-4周能引起較明顯的肺纖維化發生；採用前述構建的KGFR腺病毒表達載體，通過96孔板螢光計數法檢測Ad-KGFR病毒原液的滴度為3 106PFU/mL。以該滴度的KGFR腺病毒300ml與博萊黴素(60mg/kg體重)共同氣管內灌注，分別於1，2，3，4周後HE染色觀察肺纖維化發生情況。結果表明，KGFR的表達增強後，博萊黴素作用後不同時間肺纖維化的發生有較明顯的減輕。
文檔編號C12N15/861GK103060375SQ20121042533
公開日2013年4月24日 申請日期2012年10月31日 優先權日2012年10月31日
發明者王建民, 陳菁, 劉斌劍, 陳魁君, 許川, 陳志強, 李冠樺, 苟元彬 申請人:王建民