石油汙染土壤生物修復過程中微生物多樣性的pcr-dgge分析方法
2024-04-05 19:58:05 1
專利名稱：石油汙染土壤生物修復過程中微生物多樣性的pcr-dgge分析方法
技術領域：
本發明屬於土壤微生物群落多樣性分析技術領域，具體針對石油汙染土壤生物修復過程中微生物多樣性的PCR-DGGE分析方法，即通過對微生物群落多樣性的PCR-DGGE實驗條件進行改進和優化得到最佳的試劑用量及實驗條件。本發明主要應用於石油汙染土壤生物修復過程中分子生態學研究，也可為其他環境樣品的分子生態學研究提供參考。
背景技術：
石油作為重要的工業能源，對經濟的發展起著重大的決定作用，但同時在石油的生產、運輸、儲存、使用過程中又對自然環境特別是土壤和地下水造成了重大汙染，對人類健康造成很大的威脅，使未來的經濟發展面臨著巨大的挑戰。目前，為了減小石油汙染引起的當地生態風險和改善被汙染的環境，國際公認的最有效的處理方法——生物修復技術得到了極大的關注。在生物修復的生態系統中，微生物在與受汙染的環境發生作用的過程中， 不同種類的微生物執行著不同的功能，共同承擔著汙染物的分解和氧化，它們之間存在著內在的相互依存、相互作用的微生態關係。同時微生態系統與周圍的環境有著密切的聯繫， 微生物種群之間的相互關係以及環境因子決定了微生態系統的結構和功能。由多種微生物組成的微生物生態系統的結構和功能直接關係到生物修復的處理效能，處理效果的好壞及運行中出現的問題都與微生態系統的結構密切相關。因此，微生物生態學的研究是生物修復的理論基礎，目前已經成為環境生物修復技術理論研究的新方向。由於聚合酶連式反應-變性梯度凝膠電泳(Polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,簡禾爾 PCR-DGGE)技術能夠在分子生物學水平對微生物進行快速精確的分析，可以用來監測微生物多樣性、群落的動態變化和富集、篩選過程中菌株的分析與跟蹤等，在各種環境微生物生態學的研究中也得到廣泛地應用，如海洋、湖泊、土壤、活性汙泥、生物膜等，它已經成國內外研究微生物生態的重要技術。雖然嚴格地參照操作說明書和相關參考文獻能獲得比較理想的實驗結果，但是， 由於可供研究的樣品種類繁多，並且PCR-DGGE技術針對不同的樣品均需通過實際試驗來確定相關重要試劑用量以及把握一些實驗細節，且多數文獻沒有具體說明重點試劑用量， 因此有必要對典型的樣品給出已經摸索出的最佳條件，以期為後續研究提供技術指導，避免繁瑣的大量實驗條件嘗試。
發明內容
本發明的目的是提供改進的優化的石油汙染土壤的PCR-DGGE技術研究條件和關鍵試劑的用量。本發明是通過如下方案實現的將取自勝利油田某油井旁的石油汙染土壤樣品進行風乾、除雜、細化、添加高效石油降解菌劑和營養物，保持一定的土壤溼度、溫度、PH值，進行石油汙染土壤生物修復小試。小試實驗進行7周，每周定期取樣，測定其土壤石油含量，計算石油降解率。針對修復前期(15天)、中期(30天)、後期(45天)的土壤進行PCR-DGGE試驗， 考察土壤中微生物的群落結構和動態變化，以及系統中的微生物多樣性。對前期的土壤樣品，進行PCR-DGGE試驗條件改進和優化，並採用優化的條件處理中期和後期樣品。有益效果本發明所涉及的石油汙染土壤中石油含量為160_200g/(kg幹土)，含鹽量為 9-20g/(kg幹土)，修復採用的菌劑能在6% -10%鹽濃度環境下良好生長，保證了石油汙染土壤生物修復的順利進行；應用於分析該土壤樣品的PCR-DGGE改進方法及優化條件和試劑用量為1)稱取0. 4g石油汙染土壤採用改進的生物-化學裂解法即可直接提取其足量的基因組DNA，其中在只加入DNA抽提液後增加渦旋振蕩步驟可得到更佳的效果，提取的 DNA沉澱採用IOOyL TE緩衝液溶解即可。土壤樣品使用越多獲得的DNA產量越多，相應消耗試劑量越多，成本越高，操作越耗時；幻採用離心柱式膠回收試劑盒純化DNA產品，回收的DNA沉澱採用50 μ LTE緩衝液溶解；3)該純化後的DNA產品可直接用於PCR反應，引物採用16S rRNA基因V3區的通用引物GC341f/534r，DNA模板用量最佳為1 μ L，即得到單一整齊亮度高的PCR產物；參考PCR程序為起始95°C預變性10min，94°C變性30s，53°C引物復性30s，72°C引物延伸30s，30個循環，72°C終延伸IOmin ；4)得到的PCR產物純度高，產量充足，無需純化，採用3 5μ L即可直接用於DGGE實驗並獲得清晰整齊的指紋圖譜；5) DGGE實驗制膠時，宜用9 μ L TEMED, 40 μ L 10% APS投加到18mL的變性丙烯醯胺膠溶液中， 該用量恰好能灌滿膠板；6)灌膠後，在頂端用保鮮膜覆蓋以隔離空氣，並防止TEMED、APS的揮發影響膠凝固；隔夜放置(約10h)，使其完全凝固，能獲得比短時間(1 2h)更為優良的變性膠；7)設置電壓120V，電泳溫度60°C，電泳時間5h，即可獲得良好的DGGE圖譜，較長 (約12h以上)的電泳時間對電泳效果改善不明顯，甚至會使得DNA樣品完全解鏈而跑出膠外；8)銀染時，固定時間為15min，染色時間15min，顯色1 2min，每次間隔均用去離子水快速清洗兩遍，終止液可以不予使用；9)少量合理的試劑用量可以大大地節約實驗成本和時間，並能得到理想的實驗效果。應用領域本發明所得到的PCR-DGGE實驗改進方法和優化條件主要應用於石油汙染土壤的生態學研究，對其他的如農業土壤、活性汙泥、生物膜、石化廢水等環境樣品亦有可靠的借鑑作用。
圖1 本發明中土壤樣品中基因組總DNA的粗提圖；圖2 本發明中土壤樣品中基因組總DNA的純化圖；圖3 本發明中土壤樣品16S rDNA V3區PCR擴增圖；圖4 本發明中土壤樣品土樣V3區PCR產物的DGGE電泳圖譜。
具體實施例方式
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下面結合附圖和實施例對本發明進行詳細說明。1.石油汙染土壤樣品及其預處理對修復前期(15天)的土壤進行PCR-DGGE分析，考察土壤中微生物的群落結構和動態變化，以及系統中的微生物多樣性。用於石油汙染土壤生物修復小試試驗的土壤取自勝利油田某油井旁，經除雜、風乾、散碎、過200目篩、混勻後，取等量分裝於10個小花盆中，並投加重離子誘變後篩選馴化的菌種。其中石油汙染土樣的基本理化性質如表1所示，土壤含油量高達194. 5g/(kg幹土 )遠超出臨界值500mg/kg，含鹽量高達8. 26g/ (kg幹土 )，氮含量不足僅為25. 52mg/ (kg 幹土)。由於C N P = 15. 27 0.025 0. 34 = 611 1 12，但是正常的微生物生長需要的C N P = 100 5 10 1，故修復過程中外加投入10. IOg KNO3/(kg幹土) 補充氮源。修復實驗過程中每天早晚灑水並翻動土壤，保證土壤含水率為30%左右及良好的充氧。表1石油汙染土樣的基本理化性質
權利要求
1.採用的石油汙染土壤生物修復過程中微生物多樣性的PCR-DGGE分析方法，提取土壤樣品DNA的最佳土壤樣品量為0. 4g，得到的DNA沉澱採用100 μ LTE緩衝液溶解，純化後的DNA沉澱採用50 μ L TE緩衝液溶解。
2.根據權利要求1所述的DNA提取方法，其純化後的DNA產品取1μ L即可直接用於 PCR反應，參考PCR程序為起始94°C預變性5min，94°C變性45s，55°C引物復性45s, 72°C 引物延伸90s，25個循環，72°C終延伸IOmin。
3.根據權利要求2所述的PCR反應方法，取3 5μL PCR產物即可直接用於DGGE實驗。
4.DGGE制膠時，宜用9 μ LTEMED, 40 μ L 10% APS投加入18mL的變性丙烯醯胺膠溶液中；增大試劑用量會導致膠凝固時間快而使濃度梯度不均勻。
5.根據權利要求4所述的制膠方法，灌膠後，在頂端用保鮮膜覆蓋，隔夜放置(約 IOh)，能獲得比短時間(1 2h)更為優良的變性膠。
6.根據權利要求5所述的制膠方法，設置電壓120V，電泳溫度60°C，電泳時間5h，即可獲得良好的DGGE圖譜，較長(約12h以上)的電泳時間對電泳效果改善不明顯。
7.根據權利要求6所述的電泳方法，銀染時，固定時間為15min，染色時間15min，顯色 1 2min，每次間隔均用去離子水快速清洗兩遍，終止液可以不予使用。
8.根據權利要求1 7所述的實驗方法，發現少量合理的試劑用量可以大大地節約實驗成本和時間，並能得到理想的實驗效果。
全文摘要
本發明屬於土壤微生物群落多樣性分析技術領域，公開了PCR-DGGE法分析石油汙染土壤微生物群落多樣性的最佳條件和試劑用量。主要體現在①取0.4g土樣可提取足量的DNA；②取1μL純化DNA直接用於PCR反應；③取3～5μL PCR產物用於DGGE實驗；④制膠時宜用9μL TEMED，40μL 10％APS投加到18mL變性丙烯醯胺膠溶液中；⑤灌膠後在頂端用保鮮膜覆蓋，隔夜放置，能獲得優良的變性膠；⑥設置電壓120V，電泳溫度60℃，電泳時間5h，可獲得良好的DGGE圖譜；⑦銀染時終止液可不予使用。本發明主要應用於石油汙染土壤生物修復過程中分子生態學研究，也可為其他環境樣品的分子生態學研究提供參考。
文檔編號C12Q1/04GK102174648SQ20101060900
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月17日 優先權日2010年12月17日
發明者楊玉楠, 郭若勤 申請人:北京航空航天大學