一株對楊樹灰斑病菌有抑制作用的鏈黴菌的製作方法
2024-04-01 08:06:05
一株對楊樹灰斑病菌有抑制作用的鏈黴菌的製作方法
【專利摘要】一株對楊樹灰斑病菌有抑制作用的鏈黴菌，本發明涉及一株鏈黴菌。本發明提供一株鏈黴菌，對楊樹灰斑病菌有抑制作用，為楊樹灰斑病的生物防治提供了有效途徑。本發明對楊樹灰斑病菌有抑制作用的鏈黴菌為鏈黴菌Syjd3，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期為2014年6月17日，保藏編號為CGMCC?No.9355。本發明鏈黴菌Syjd3對楊樹灰斑病菌有抑制作用，該菌對楊樹葉枯病菌、茄病鐮刀菌、小麥根腐病菌、玉米彎孢病菌和水稻惡苗病菌也有一定抑制作用。
【專利說明】一株對楊樹灰斑病菌有抑制作用的鏈黴菌
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及一株鏈黴菌。
【背景技術】
[0002]楊樹灰斑病是由楊樹灰斑病菌(Sporocadus populinus (Bres.)Orsenigo, Rodondi&B.Sutton = CoryneumpopulinumBres.)引起的一種危害楊樹葉片葉部病害之一，發生面積大，危害嚴重，主要發生在幼樹、幼苗的葉片和樹梢上，使葉片提早脫落，幹部潰瘍，嫩梢枯頂，生長量減低，嚴重時可造成植株死亡，移栽成活率降低，對楊樹育苗和造林威脅很大。
[0003]植物病害是威脅農業生產的重要因素之一，目前使用化學農藥是控制植物病害的主要方法，但化學農藥的長期使用不僅汙染環境，破壞生態平衡，而且殘留對人、畜都有危害，並且使病原菌產生了抗藥性，因此植物病害的生物防治研究越來越受到重視。植物內生放線菌是生活在植物健康組織內部的微生物，與植物宿主及和它共生的其他微生物間有密切的關係，是生物防治的一個新菌種。近年來植物內生菌已引起了植物保護學家、微生物學家、生態學家等的廣泛關注，逐步成為國內外研究的熱點，國內外研究均表明內生菌對防治植物病害具有潛在的應用和開發價值，因此尋找防治楊樹灰斑病菌拮抗菌是重要的防治途徑之一。
【發明內容】
[0004]本發明提供一株鏈黴菌(Streptomyces),對楊樹灰斑病菌有抑制作用，為楊樹灰斑病的生物防治提供了有效途徑。
[0005]本發明對楊樹灰斑病菌有抑制作用的鏈黴菌為鏈黴菌(Streptomyces sp.)Syjd3，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期為2014年6月17日，保藏編號為CGMCC N0.9355。
[0006]本發明鏈黴菌Syjd3在高氏一號培養基上劃線插片培養，28°C培養7_14d後，分別用光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察插片上的氣生菌絲、基生菌絲及孢子的形態特徵。菌絲體初期白色，後變為淺黃褐色。菌落表邊乾燥、粉狀、正反面顏色一致。氣生菌絲豐富，多分枝。基內菌絲有分支、無橫隔、無斷裂。孢子絲柔曲型偶爾螺旋性，孢子杆狀，表面光滑。
[0007]本發明鏈黴菌Syjd3在高氏一號培養基上氣生菌絲生長旺盛，粉狀，淺黃褐色，無可溶性色素。在澱粉瓊脂培養基上氣生菌絲暗黃褐色，氣生菌絲旺盛，無可溶性色素。燕麥粉瓊脂培養基上氣生菌絲暗灰色，旺盛，基內菌絲灰色，無可溶性色。
[0008]所述澱粉瓊脂培養基由1g可溶性澱粉、Ig硫酸鎂、Ig硝酸鉀、0.3g磷酸氫二鉀、2g酵母浸粉、0.5g氯化鈉、15g瓊脂和100mL蒸餾水組成，pH為7.2-7.6，121 °C，滅菌20分鐘。
[0009]所述燕麥粉瓊脂培養基由20g燕麥粉、0.0Olg七水硫酸鐵、0.0Olg氯化錳、0.0Olg硫酸鋅、18g瓊脂和100mL蒸餾水組成，pH為7.2-7.6，121。。，滅菌20分鐘。
[0010]參照《鏈黴菌鑑定手冊》對鏈黴菌Syjd3分別進行明膠液化、牛奶凝固與腖化、澱粉水解、纖維素上生長、H2S產生及碳源利用。鏈黴菌Syjd3能使明膠液化、牛奶凝固、腖化慢、澱粉水解強。在纖維素上不生長。產生H2S。利用葡萄糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-果糖，不利用D-木糖、蔗糖、棉子糖、D-甘露醇、肌醇。
[0011]本發明鏈黴菌Syjd3通過16SrDNA序列比對分析，與Streptomyces cavourensisKC178676.1的相似度為99%。通過結合菌體形態特徵、生長條件、生理生化鑑定結果確定鏈黴菌Syjd3屬於鏈黴菌屬(Streptomyces)。
[0012]本發明鏈黴菌Syjd3對楊樹灰斑病菌有抑制作用，該菌對楊樹葉枯病菌、茄病鐮刀菌、小麥根腐病菌、玉米彎孢病菌和水稻惡苗病菌也有一定抑制作用。
[0013]本發明鏈黴菌(Streptomyces sp.) Syjd3,屬於鏈黴菌屬(Streptomyces),保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期為2014年6月17日，保藏編號為CGMCCN0.9355。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為本發明鏈黴菌Syjd3畫線培養的菌落形態照片；圖2為本發明鏈黴菌Syjd3與楊樹灰斑病菌的對峙篩選圖；圖3為本發明鏈黴菌Syjd3和相近菌株進行同源性比對構建的系統發育樹。
【具體實施方式】
[0015]本發明技術方案不局限於以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的任意組合。
[0016]【具體實施方式】一:本實施方式對楊樹灰斑病菌有抑制作用的鏈黴菌為鏈黴菌(Streptomyces sp.) Syjd3,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期為2014年6月17日，保藏編號為 CGMCC N0.9355。
[0017]本實施方式鏈黴菌Syjd3在高氏一號培養基上劃線插片培養，28°C培養7_14d後，分別用光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察插片上的氣生菌絲、基生菌絲及孢子的形態特徵(如圖1)。菌絲體初期白色，後變為淺黃褐色。菌落表邊乾燥、粉狀、正反面顏色一致。氣生菌絲豐富，多分枝。基內菌絲有分支、無橫隔、無斷裂。孢子絲柔曲型偶爾螺旋性，孢子杆狀，表面光滑。
[0018]本實施方式鏈黴菌Syjd3在高氏一號培養基上氣生菌絲生長旺盛，粉狀，淺黃褐色，無可溶性色素。在澱粉瓊脂培養基上氣生菌絲暗黃褐色，氣生菌絲旺盛，無可溶性色素。燕麥粉瓊脂培養基上氣生菌絲暗灰色，旺盛，基內菌絲灰色，無可溶性色。
[0019]參照《鏈黴菌鑑定手冊》對鏈黴菌Syjd3分別進行明膠液化、牛奶凝固與腖化、澱粉水解、纖維素上生長、H2S產生及碳源利用。鏈黴菌Syjd3能使明膠液化、牛奶凝固、腖化慢、澱粉水解強。在纖維素上不生長。產生H2S。利用葡萄糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-果糖，不利用D-木糖、蔗糖、棉子糖、D-甘露醇、肌醇。
[0020]【具體實施方式】二:本實施方式鏈黴菌(Streptomyces sp.) Syjd3從黑龍江省哈爾濱市第三苗圃的3年生銀中楊中分離得到。分離方法按以下步驟進行:
[0021](I)從黑龍江省哈爾濱市第三苗圃的3年生銀中楊上隨機挑選5株樹，每株隨機採集30片葉子，在超淨工作檯內用75%酒精將葉子進行表面消毒。
[0022](2)將消毒好的葉子10克用研缽研碎，後放入裝有玻璃珠和無菌水的三角瓶中，在150轉/分的搖床上搖30分鐘，靜止30秒後，依次稀釋10倍，製備10—1、10_2、10' 10_4稀釋液，吸取稀釋液0.2ml滴加到高氏一號培養基平板上，塗抹均勻，將培養皿放在28°C培養箱內倒置培養。
[0023]高氏一號培養基由20g 可溶性澱粉、lgKN03、0.5gNaCl、0.5gK2HP04、0.5gMgS04、0.01gFeSO4,20g 瓊脂和 100mL 水組成，pH 為 7.2-7.6。
[0024](3)採用平板對峙法篩選對楊樹灰斑病菌有抑制作用的菌株
[0025]將步驟(2)培養得到的菌株,用高氏一號培養基培養,將楊樹灰斑病菌在PDA培養基上培養10-15d後，將步驟(2)培養得到的菌株用打孔器取7mm直徑的菌塊，接種於楊樹灰斑病菌對稱兩側，兩者相距為7mm，培養10-12d後觀察測量抑菌圈直徑，選擇拮抗作用最佳的菌株(如圖2)，即為本實施方式的鏈黴菌Syjd3。
[0026]對分離篩選得到的鏈黴菌Syjd3進行分子鑑定，提取菌株的基因組DNA，應用常規PCR擴增該菌株的16SrDNA並測序,其序列如SEQ ID N0:1所示。鏈黴菌(Streptomycessp.) Syjd3的16SrDNA序列長度為1488bp，其序列提交至GenBank獲得的序列號為KJ918749，測序結果與GenBank中的16SrDNA序列進行同源性比對，構建的系統發育樹如圖3所示，以確定菌株的種屬關係。同源性分析結果表明，與Streptomyces cavourensis KC178676.1的相似度為99%。通過結合菌體形態特徵、生長條件、生理生化鑑定結果確定鏈黴菌Syjd3屬於鏈黴菌屬(Streptomyces)。
[0027]採用平板對峙法檢測鏈黴菌Syjd3對楊樹灰斑病菌的抑制作用，可形成明顯的抑菌帶，抑菌帶寬度為6.5mm，抑菌率達到95.83%。
[0028]採用平板對峙法檢測鏈黴菌Syjd3對其他植物病原菌的抑制作用，發現對楊樹葉枯病菌(Alternaria alternata)、爺病鐮刀菌(Fusarium solani)、小麥根腐病菌(Drechslera sorokiniana)、玉米彎抱病菌(Curvularia Iunata)、水稻惡苗病菌(Fusarium moniIiforme)也有一定的抑制作用，實驗結果如下。
[0029]
【權利要求】
1.一株對楊樹灰斑病菌有抑制作用的鏈黴菌，其特徵在於該菌株為鏈黴菌(Str eptomyces sp.) Syjd3,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏地址是北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期為2014年6月17日，保藏編號為CGMCCN0.9355。
【文檔編號】C12N1/20GK104130965SQ201410384340
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年8月6日 優先權日:2014年8月6日
【發明者】劉雪英, 馬玲, 劉雪峰 申請人:東北林業大學