柑橘潰瘍病感病基因CsLOB的製作方法

2024-04-01 06:15:05

柑橘潰瘍病感病基因CsLOB的製作方法
【專利摘要】一種柑橘潰瘍病感病基因CsLOB，在柑橘中的序列如SEQ?ID?NO.1所示，啟動子序列長度為500bp，ORF序列長度為711bp；CsLOB蛋白質序列如SEQ?ID?NO.2所示。CsLOB基因啟動子中存在可被柑橘潰瘍病菌PthA特異性結合的UPT?box，其序列如SEQ?ID?NO.3所示，長度為18bp。本發明獲得的CsLOB基因能被來自柑橘潰瘍病菌主效毒性蛋白PthA蛋白特異性識別並激活其轉錄，導致柑橘發生潰瘍病。基因沉默CsLOB基因和遺傳修飾UPT?box，可獲得具有持久抗性的柑橘新種質或新材料。
【專利說明】相橘潰痛病感病基因CsLOB
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因，尤其涉及一種柑橘潰瘍病感病基因CsLOB。
【背景技術】
[0002]柑橘潰瘍病在中國柑橘種植區普遍發生，以廣東、廣西、湖南和福建等地發生較重。發生嚴重時引起落葉、落果，植株生長不良，影響產量和品質。
[0003]柑橘潰瘍病菌能夠侵染寄主植物柑橘，在侵染點附近引起症狀，其機制是柑橘某些基因不正常地過量表達，從而使得柑橘潰瘍病菌成功地從植株獲得了所需的營養物質。在柑橘潰瘍病菌與寄主植物的識別過程中，柑橘潰瘍病菌通過III型分泌系統分泌多種III型效應蛋白到植物細胞中，其中PthA被認為是引起柑橘產生柑橘潰瘍病的主要毒性因子。PthA 屬於 TALE (Transcriptional Activator Like Effector)類蛋白，其結構上在氮端和碳端是保守的，碳端存在核定位信號和轉錄激活域，在中間存在重複區域，每個重複由34個胺基酸組成，每個重複的12，13位胺基酸決定了蛋白與DNA的結合特性。PthA蛋白在被分泌到柑橘細胞中以後，首先會被定位到細胞核，然後按照其重複區域的識別密碼找到相應的柑橘基因組DNA序列進行結合。其所結合的區域是感病基因的啟動子區域。隨後，通過PthA蛋白碳端的轉錄激活功能，柑橘基因組被結合DNA序列下遊的感病基因被激活，經過一系列的信號傳遞後，柑橘發生潰瘍病症狀。
[0004]植物中的感病基因是病害發生的關鍵基因，其在與病原細菌的效應蛋白直接接觸後會過量表達，隨後激活植物的整個感病通路，最終導致植物發生病害。在柑橘潰瘍病中，先前的研究並沒有找到任何 感病基因。柑橘潰瘍病感病基因的獲得，一方面，非常充分地解析了柑橘潰瘍病發生的致病機理，另一方面，更能讓我們通過日前已經初步成熟的基因組定點編輯技術手段(如TALEN和CRISPR-Cas等)對感病進行修飾，敲除其上遊與PthA毒性因子結合的DNA序列。因此，基於本發明，利用轉基因手段，可以在較短時間內獲得對柑橘潰瘍病菌具有抗性的柑橘新品種。

【發明內容】

[0005]本發明的目的，在為根除相橘潰瘍病提供理論基礎，為基於轉基因的基因定向尚支除技術提供一種柑橘潰瘍病感病基因CsLOB作為靶點基因。
[0006]為了達到上述目的，本發明採用了以下技術方案:
[0007]本發明涉及的是甜橙中的CsLOB基因，其啟動子能夠被柑橘潰瘍病菌主效毒性蛋白PthA識別。該基因被激活後過量表達，可直接導致柑橘發生潰瘍病。其在Citrussinensis Annotation Project 網站(http://citrus, hzau.edu.cn/orange/index, php)上的編號為Cs7g27640，其啟動子及開放閱讀框(ORF)序列如SEQ ID N0.1所示，序列總長度為1214bp。該序列前500bp部分為啟動子，其序列如SEQ ID N0.2所示。啟動子中能被PthA特定識別的序列如SEQ ID N0.3所示，序列長度為18_bp。所述的CsLOB基因產物CsLOB蛋白能夠在柑橘潰瘍病菌侵染時過量合成，導致柑橘發生潰瘍病。[0008]本發明的CsLOB基因及其啟動子被PthA識別的片段由以下方法獲得:
[0009]利用轉錄組分析技術，用含用PthA的柑橘潰瘍病菌株注射接種柑橘葉片，一定時間後取適量柑橘葉片，提取柑橘總RNA分析獲取表達上調的基因。總共得到了 108個表達上調基因，在Citrus sinensis Annotation Project網站的柑橘基因組資料庫裡獲得了這108個基因的啟動子序列，然後利用Target Finder和Talgetter兩個在線比對網站進行查詢。通過輸入PthA的重複區域序列和所有上調基因的啟動子序列，若干個候選基因被獲得，其中CsLOB基因得分遠高於其他基因，因此其被推測為是最有可能被PthA激活的基因。將CsLOB基因上遊500bp的序列構建到具有⑶S報導基因的載體上，利用農桿菌瞬時表達方法，檢測得到CsLOB基因啟動子可以被PthA轉錄激活。選定CsLOB基因上遊的另一端序列作為靶序列，設計人造TAL蛋白並在柑橘葉片中進行表達，可以使得柑橘產生潰瘍病，上述兩實驗確認了 CsLOB基因是可被PthA轉錄激活的感病基因。
[0010]與現有技術相比，本發明具有如下有益效果:本發明獲得了柑橘中與柑橘潰瘍病菌互作的感病基因並且得到了與水稻植物中能夠被柑橘潰瘍病菌PthA蛋白識別的DNA序列。該感病基因的獲得，為運用分子遺傳學方法改良柑橘品種提供了資源，具有極大的應用價值。
[0011]本發明中所涉及的柑橘潰瘍病感病基因CsLOB系首次報導為可導致柑橘潰瘍病的感病基因，其啟動子被PthA蛋白特異性識別的序列也為首次報導。CsL0B(Cs7g27640)基因的序列可在Citrus sinensis Annotation Project 網站(http://citrus, hzau.edu.cn/orange/index, php)上查詢得到。涉及PthA(⑶181333.1)的序列可以在NCBI資料庫中查詢(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)。
[0012]利用GUS報告基 因驗證蛋白對啟動子區域的結合及激活功能，是常規的實驗技術手段，該方法已經在(《Antony, G, et al., Rice xal3Recessive Resistance to BacterialBlight Is Defeated by Induction of the Disease Susceptibility Gene 0s_llN3.Plant Cell,2010.22(11):p.3864-3876》)中公開。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是柑橘CsLOB基因啟動子被PthA蛋白結合的DNA序列位置圖(紅色部分序列)；
[0014]圖2是柑橘潰瘍病菌PthA蛋白可與CsLOB基因啟動子特定序列互作並激活CsLOB基因表達；
[0015]圖3是CsLOB基因過量表達導致柑橘發生潰瘍病。
【具體實施方式】
[0016]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照製造廠商所建議的條件。
[0017]實施例1
[0018]CsLOB基因啟動子的克隆
[0019]本實施例克隆柑橘中CsLOB基因上遊500bp的DNA片段以及柑橘潰瘍病菌中的PthA基因，通過農桿菌瞬時表達技術，驗證與柑橘潰瘍病菌PthA蛋白的互作。以柑橘基因組 DNA 為模板，設計引物 pCsLOB-F(SEQ ID N0.4):5』 -AAAGGTACCATGACGGTGGGAGCCGGGGTG-3』 和 pCsLOB-R(SEQ ID N0.5):5』 -TCTAGAGCCTGGTGATACTTCCTTGCCAGAA-3』，進行 PCR擴增，PCR 擴增條件為:95°C /5min+ (94°C /45sec+55°C /30sec+72°C /lmin30sec) X 38 循環+72 °C /IOmin0 PCR產物經Sail和EcoRI酶切後，連接到pCAMBIA1381載體中，獲得pCAMBIA1381-pCsL0B，藉助農桿菌H1105的作用，與表達PthA的PHB載體構建在菸草上同時進行瞬時表達，轉化菸草經過2-3天的溫室培養(25°C，光照/黑暗，16h/12h)後，測定⑶S報導基因活性發現PthA可以顯著地激活CsLOB基因啟動子的表達，確定CsLOB基因啟動子與PthA的互作(參見圖2)。
[0020]實施例2
[0021]CsLOB基因被特異性激活後對柑橘的致病性
[0022]本實施例通過人工合成tal基因的方法激活CsLOB基因表達。選定CsLOB啟動子的一段序列(SEQ ID N0.6)作為靶點設計併合成dtal基因(參見圖1中藍色部分序列)。以柑橘潰瘍病菌PthA基因序列為模板，設計引物dTAL-F(SEQID N0.7):5，-GGCGGTCGACCGGCGCTGGAGAGCAT-3，和 dTAL_R(SEQ ID N0.8):5』-AATGCATGCAAAGACGCCTGGTCCG-3』進行PCR反應，擴增條件為:95°C /5min+ (94°C /45sec+53°C /45sec+72°C /20sec) X 32 循環 +72°C /IOmin0 回收 PCR 產物，經過 Sail 和 SphI 限制性酶切後同dtal基因片段一同連接到pUFR034載體上，得到載體pUFR034_dTAL。使用電轉化方法將pUFR034-dTAL載體轉入到不含有任何tal的柑橘潰瘍病菌中。注射接種柑橘，與不含dtal基因的柑橘潰瘍病菌相比，含有dtal基因的柑橘潰瘍病菌可以導致柑橘葉片明顯地發生柑橘潰瘍病(參見圖3)。說明該基因可以直接導致柑橘發生柑橘潰瘍病，這為防治柑橘潰瘍病提供了極大的應用前景。
[0023]參考文獻:
[0024]關於農桿菌瞬時表達驗證蛋白與植物基因啟動子互作的方法:Antony，G.，etal.,Rice xal3 Recessive Resistance to Bacterial Blight Is Defeated by Inductionof the Disease Susceptibility Gene Os-11N3.Plant Cell,2010.22 (11):p.3864-3876.[0025]關於人工合成tal基因激活植物基因表達的方法:Li，T.，et al.，Designer TALeffectors induce disease susceptibility and resistance to Xanthomonas oryzaepv.0ryzae in rice.Molecular plant,2013.6(3):p.781-789.[0026]關於基因重組分子操作:SambrookJ, Russell Dff, Molelcular cloning,ALaboratory Manual(3rd ed), 2001, Spring Harbor Laboratory Press。
[0027]序列表
[0028]〈110〉上海交通大學
[0029]柑橘潰瘍病感病基因CsLOB
[0030]8
[0031]PatentIn version3.5
[0032]〈210〉I
[0033]1214
[0034]DNA
【權利要求】
1.一種柑橘潰瘍病感病基因CsLOB，其序列如SEQ ID N0.1所示，啟動子長度為500bp，啟動子及開放閱讀框序列總長度為1214bp，該基因能被柑橘潰瘍病菌毒性蛋白PthA特異性識別。
2.如權利要求1所述的柑橘潰瘍病感病基因CsLOB，其特徵在於:所述的CsLOB基因在柑橘中編碼237個胺基酸，胺基酸序列如SEQ N0.2所示。
3.權利要求1所述柑橘潰瘍病感病基因CsLOB啟動子，其特徵在於:含有能被PthA特異性識別的UPT-box序列，其序列如SEQ N0.3所示，序列長度為18bp。
4.如權利要求3所述的柑橘潰瘍病感病基因CsLOB啟動子，其特徵在於:人工合成的類似PthA蛋白dTALE可結合UPT-box以外的CsLOB基因啟動子序列，使CsLOB蛋白表達並導致柑橘 產生潰瘍病。
【文檔編號】C07K14/415GK103882031SQ201410002978
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年1月3日 優先權日:2014年1月3日
【發明者】陳功友, 李爭, 鄒麗芳 申請人:上海交通大學