用於柑桔潰瘍病菌檢測的lamp引物組的製作方法

2024-04-01 08:41:05

專利名稱：用於柑桔潰瘍病菌檢測的lamp引物組的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物保護領域，提供了利用常溫擴增技術對柑桔潰瘍病菌的檢測，適用於ロ岸檢驗檢疫等機構應用。
背景技術：
ttfto^^ifelSiXanthomonas axonopodis pv. citri 、 Hasse ノ Vauterin et al.)是柑桔生產上的重要病害，被多個國家列入重大檢疫性病害。柑桔潰瘍病菌在我國華南沿海、華中和西南的14個省(市)均有發生，對柑桔生產和貿易造成了重大影響。在貴州省榕江縣，該病害是柑桔上的主要病害之一，全縣發生面積2035 hm2，佔全縣總面積的94%。 很多果園由於受到該病危害變成廢園，每年因該病危害造成的產量損失達9萬噸，經濟損失18000萬元。近年來，位居世界柑桔產量第一和第三德巴西和美國也正面臨柑桔潰瘍病、 柑桔黃龍病的威脅，其柑桔產業大幅度萎縮。柑桔潰瘍病傳統的檢測技術和方法主要包括常規檢測方法、酶聯免疫吸附檢測和普通PCR方法，但這些檢測方法均有其不足之處。常規檢測法能夠檢測活的病菌，但需要進行病原物的分離培養、純化和一系列的生理生化反應及致病性測定，費時費力，難以滿足植物檢疫「快速、準確」的基本要求；酶聯免疫檢測中，雖然多克隆抗血清採用近緣細菌菌懸液交叉吸收，提高了特異性，但對於表面汙染雜菌和雜質較多的柑桔樣品，酶聯免疫檢測的靈敏度達不到要求，PCR方法雖然特異性高，檢測周期短，但其昂貴的儀器設備和較高的假陽性率，也限制了其推廣。本發明應用LAMP引物將恆溫擴增技術應用於柑桔潰瘍病菌的快速檢測，特異性、 靈敏度比普通變溫PCR方法更高，同時可以免除高昂的儀器投入，便於基層推廣使用。

發明內容
本發明的第一目的是提供ー種用於柑桔潰瘍病菌檢測的LAMP引物組，第二目的是提供了ー種利用該引物組檢測柑桔潰瘍病菌的檢測方法。ー種用於柑桔潰瘍病菌檢測的LAMP引物組包括一對外引物，其DNA序列為SEQ ID NOl :5』 -CACGCCATCTGCCAGTTC-3』
SEQ ID N02 ;5』 -GCGCAGAACGCTATCACTG-3， 和一對內引物，其DNA序列為
SEQ ID N03 5' -TAGCCGCCACGACTTGGTTGGGGAAATAGCGCTCGGTG-3』 SEQ ID N04 :5』-ATGCGGTCGTAGATATCCCGGAGCTCTACGACGGTCAACG-3』。2、ー種利用上述引物組檢測柑桔潰瘍病菌的方法，包括如下步驟
1)待測樣品中DNA模板的提取用市售的DNA提取試劑盒，按照說明書步驟提取待測樣品中DNA。2) LAMP 10 μ mol/mL SEQ ID N01、10 μ mol/mL SEQ ID N02 UOymol/ mL SEQ ID N03 禾ロ 10 μ mol/mL SEQ ID N04 各 1 μ L ;2*reaction mix 12. 5μ L ；Bst DNA 聚合酶1 μ L ；步驟1)中獲得的DNA模板2 μ L ；滅菌去離子水5. 5 μし3) LAMP擴增條件將配製好反應體系的PCR管於68°C水浴鍋中恆溫反應60min ； 然後80°C，5min終止反應。4)檢測結果電泳步驟3)中的LAMP擴增產物，若產生特異梯狀條帶，則待測樣品中含有柑桔潰瘍病菌；若為產生特異梯狀條帶，則待測樣品中不含有柑桔潰瘍病菌。與現有技術相比，本發明的進步在於檢測時間短，效率高；檢測儀器簡單，只需要簡單的水浴鍋，無需昂貴的PCR儀，降低了設備投入，適合口岸檢驗檢疫機構和基層實驗室推廣。


圖1為LAMP弓丨物組恆溫擴增結果圖中1-柑桔饋場炳菌(Ζ <3Ζ0/ 0/70 ·5· pv. citri ( Hasse ) Vauterin et al.)； 2-黃單胞菌(Janthornonas sp.) ；3-短小桿菌{Curtobacterium sp.) ；4-柑桔饋蕩病菌 X. axonopodis pv. citri ( Hasse ) Vauterin et al. );5_銷胺酉!·單胞菌 カブ/ goffloaas sp.) ；6-短波單胞桿菌(Brevundimonas sp.) ；7-嗜冷桿菌(/^FcArohcier sp. );8_7欠稻細條斑病菌oryzae pv. 0ryzicola)-』9-^j]\\f^Wj^^{flavibactermicliiganensis subsp.michiganensis) ； 10-柑;1 マ貫場ラ丙 M C^ aroflo^ot/Zs pv. citri ( Hasse ) Vauterin et al. ) ；11-白米軟腐;) 菌 iBrwinia carotovora var . Carotovora );12_ 蘇z 金芽孢杆 M (.Bacillus thuringiensis) ；13-枯草芽孢桿菌(β. subtil is) ； 14-陰性對照；M-DL2000 DNA分子量標記。
具體實施例方式1、引物的設計與合成
參照GeneBank中柑桔潰瘍病菌全基因序列，挑選特異性高的序列(序列號 AE008923. 1)，採用 LAMP 引物設計軟體 Primer Explorer V4. 0 設計 LAMP 引物，利用 LAMP Real Time Turbidimeter LA-320儀對反應進程中的濁度進行實時監控，對不同引物組擴增的起始時間、進入最大擴增速率的時間、最大擴增速率及達到平臺期所需時間等參數進行分析，篩選出擴增速率最高、特異性好的一組LAMP引物。引物由上海生エ公司合成，其序列分別為
外引物 1 SEQ ID NOl :CACGCCATCTGCCAGTTC ； 外引物 2 SEQ ID N02 :GCGCAGAACGCTATCACTG ； 內引物 1 SEQ ID N03 :TAGCCGCCACGACTTGGTTGGGGAAATAGCGCTCGGTG ； 內引物 2 SEQ ID N04 :ATGCGGTCGTAGATATCCCGGAGCTCTACGACGGTCAACG。2、樣品DNA模板的提取
用 Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit 試劑盒提取供試材料的 DNA，具體操作步驟參照試劑盒說明書。其中供試材料包括1-柑桔潰瘍病菌axonopodis pv. ci tri ( Hasse) Vauterin et al. J ；2~ 負單胞菌{Xanthornonas sp.) ；3-組小杆囷{Curtobacterium sp.) ； 4-柑桔 貫揚ヲ丙菌(Ζ axonopodis pv. ci tri ( Hasse; Vauterin et al. ) ；5-鞘胺醇單胞菌、Sphingomonas sp.) ；6-短波單胞桿菌(Brevundimonas sp.) ；7-嗜冷桿菌 (.Psychrobacter sp. ) ;8_ 水稻細條斑病菌 O orj^ae pv. Crj^icoム)；9_ 番茄潰瘍病菌 、しlavibacter michiganensis subsx).michiganensis) ； 10- hi^tn'M^MM axonopoais ρ v. citri ( Hasse) Vauterin et al. ) ;11_ 白米軟腐ヲ丙菌 iBrwinia carotovora var. Caro to vora ) ； 1蘇雲金芽孢杆囷· {Bacillus thuringiensis ) ； 13_ ネ古草芽抱桿菌{B. subtilis)。以無菌水作為陰性對照。其中1號為陽性對照，4，10號樣品為從柑桔園採集並分離得到的菌株(1，4，10號樣品均經過普通PCR和螢光定量PCR檢測為柑橘潰瘍病菌)，其餘菌株均可在國內市場購得。
3、LAMP 擴增
反應體系及條件毎次反應的總體積為25 μ L，具體體系如下。 2氺reaction mix12. 5μ L
lOymol/mL SEQ IDNOl1 μ L
lOymol/mL SEQ IDN021 μ L
lOymol/mL SEQ IDN031 μ L
lOymol/mL SEQ IDN041 μ L
Bst DNA聚合酶1 μ L
滅菌水5· 5 μ L
DNA模板2 μし2*reaction mix % Bst DNA ^^61 Loopamp DNA Amplification Kit
試劑盒產品。依次將上述試劑加入0. 2mL的PCR管中，配成LAMP擴增液。然後將配製好反應體系的PCR管置於68°C水浴鍋恆溫反應60min ；然後80°C，5min終止反應。4、結果判斷
電泳LAMP擴增產物，結果參見圖1。其中1、4、10號樣品為柑桔潰瘍病菌，均能出現梯狀特異性條帶，結果表明本發明引物對柑桔潰瘍病菌的特異性強，對其他同屬等細菌都沒有特異性條帶出現。
權利要求
1.ー種用於柑桔潰瘍病菌檢測的LAMP引物組，其特徵在於該引物組包括一對外引物，其DNA序列為=SEQ ID NOUSEQ ID N02和一對內引物，其DNA序列為=SEQ ID N03、SEQ ID N04。
2.ー種利用權利要求1所述引物組檢測柑桔潰瘍病菌的方法，包括如下步驟1)待測樣品中DNA模板的提取用市售的DNA提取試劑盒，按照說明書步驟提取待測樣品中DNA;2)LAMP 擴增體系ΙΟμπιοΙ/mL SEQ ID N01、10 μ mol/mL SEQ ID N02 U0ymol/mL SEQ ID N03 禾ロ ΙΟμπιοΙ/mL SEQ ID N04 各 1 μ L ;2*reaction mix 12. 5μ L ；Bst DNA 聚合酶1 μ L ；步驟1)中獲得的DNA模板2 μ L ；滅菌去離子水5. 5 μ L ；3)LAMP擴增條件將配製好反應體系的PCR管於68°C水浴鍋中恆溫反應60min 』然後 80°C，5min終止反應；4)檢測結果電泳步驟3)中的LAMP擴增產物，若產生特異梯狀條帶，則待測樣品中含有柑桔潰瘍病菌；若為產生特異梯狀條帶，則待測樣品中不含有柑桔潰瘍病菌。
全文摘要
本發明公開了一套用於柑桔潰瘍病菌LAMP檢測的引物組，所述引物組由一對外引物和一對內引物組成。以本發明所設計的引物採用LAMP方法檢測柑桔潰瘍病，具有良好的特異性、靈敏度，能快速、方便、高效的檢測柑桔潰瘍病菌，能滿足柑桔潰瘍病菌快速準確檢測的需要。
文檔編號C12R1/64GK102534016SQ201210018338
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月20日 優先權日2012年1月20日
發明者吳瑜佳, 孔德英, 孫濤, 滕少娜, 趙文軍, 鄧朝暉, 陸麗華 申請人:重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心