人3型腺病毒六鄰體的可修飾位點及其應用的製作方法
2024-04-07 11:35:05
專利名稱：人3型腺病毒六鄰體的可修飾位點及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域，具體是關於人3型腺病毒的可修飾位點及其應用。
背景技術：
人腺病毒(Adenovirus)是1953年從急性呼吸道疾病病人身上分離、鑑定出來的， 是一類主要感染人呼吸道和消化道的病原體。截目前為止，人類已經發現了 6個種屬52種 不同血清型的腺病毒，腺病毒流行範圍廣，傳播速度快，近年來在多個國家和地區爆發和流 行，給人們的公共衛生安全帶來了極大的威脅。流行病學調查表明，在我國，引起嚴重呼吸 道感染的腺病毒亞型主要是3型、4型、7型，較為少見的是11型。腺病毒的DNA為雙股線狀，全長30-381Λ。可以在編碼早期蛋白的El、E3區插入 外源基因進行表達，以腺病毒為載體進行基因治療的重組疫苗的研究已經廣泛進行。以人 5型腺病毒為載體的研究進行較為深入。六鄰體(Hexon)蛋白是形成腺病毒二十面體顆粒的幾種蛋白質中最大也是結 構最豐富的蛋白，其分子量約為12X104Da。不同型別腺病毒的六鄰體蛋白的胺基酸序 列有很高的同源性(78-95% )，其變化主要集中在暴露於病毒衣殼表面的9個高變區 (Hypervariable Regions, HVRs) 0在不影響病毒的複製、感染性及穩定性的前提下，可以 將外源短肽直接替換或插入到六鄰體的某些高變區中，使外源短肽「展示」於腺病毒顆粒表 面，產生具有新的抗原特異性的嵌合型病毒粒子。在腺病毒衣殼上，共有240個六鄰體顆粒 以每面12個的形式均勻分布於其上，同時，每個六鄰體顆粒又由三個六鄰體多肽鏈相互作 用形成同源三聚體，這就意味著嵌合型腺病毒衣殼表面將具有720個外源短肽拷貝；同時， 六鄰體蛋白本身分子量大，具有極強的免疫原性，此特性能大大提高嵌合於其中的外源短 肽的免疫原性。另一方面，對不同HVR區同時進行改造，能夠形成一個HVRs區修飾的、表達 外源多肽的高效、多價的重組腺病毒「展示」平臺。此技術的建立將極大的促進基因工程疫 苗的發展。腺病毒作為疫苗和基因藥物載體應用的研究較多，但針對腺病毒本身和將明確 的外源抗原表位展示於腺病毒表面後的重組病毒作為疫苗的研究尚不多見。Janet C.等 的研究結果表明，在LoopI (包含HVR1-6)和LoopII (包含HVR7-9)中替換8個胺基酸是 可 白勺(Janet C.，et al.，Expression of a foreign epitope on thesurface of the adenovirus hexon. J Gen Vriol，1994. 75 :p. 133-139.外源表位在腺病毒六鄰體表面的 表達，普通病毒學雜誌。)。Hongju W.等利用His6對人5型腺病毒的HVR2，3，5，6和7進 行了替換石if究(Hongju W. , et al. , Identification of sitesin adenovirus hexon for foreign peptide incorporation. J Virol, 2005. 79(6) :p. 3382-3390.腺病毒六鄰體上可 整合外源多肽位點的鑑定，病毒學雜誌。)，但此研究的主要目的是腺病毒的HVR區是否可 以被修飾，而不是如何修飾，因而此研究未對HVR中某些胺基酸的可替換與否進行研究，並 且，人5型腺病毒在基因分型中屬於C組(HAdV-C)，而人3型腺病毒則屬於B組(HAdV-B)， 兩者的HVR區序列及長度均差異較大。而且由於人群中普遍存在針對人5型腺病毒的中和抗體等原因，使以其為載體進行表達式重組疫苗和治療藥物等的應用受到很大的限制。
發明內容
本發明的目的是通過對人3型腺病毒六鄰體高變區胺基酸位點的研究，提供人3 型腺病毒六鄰體高變區中可修飾的胺基酸位點，以及該可修飾胺基酸位點在外源蛋白展 示、免疫原製備、藥物製備、檢測試劑製備中的應用。本發明的具體方案如下本發明首先提供了人3型腺病毒六鄰體的可修飾位點，該可修飾位點位於六鄰體 的高變區，具有SEQ ID NO :1-4所示序列中的至少一個胺基酸位點。這些胺基酸位點是分別位於人3型腺病毒六鄰體的高變區1、2、5、7上，具體來說， SEQ ID NO 1所示序列位於高變區1上，SEQ ID NO 2所示序列位於高變區2上，SEQ ID NO :3所示序列位於高變區5上，SEQ ID NO :4所示序列位於高變區7上。SEQ ID NO 1-4 所示序列中的任一個或多個胺基酸位點可以對其進行缺失或替換，而不影響腺病毒包裝活 性。本發明還提供了上述人3型腺病毒六鄰體的可修飾位點在外源蛋白展示、免疫原 製備、藥物製備和檢測試劑製備中的應用。優選的，上述應用可以採用如下方式進行六鄰體蛋白單體、六鄰體蛋白三聚體、 不含遺傳物質的腺病毒殼體及腺病毒載體在外源蛋白展示、免疫原製備、藥物製備、檢測試 劑製備中的應用，上述六鄰體蛋白單體、六鄰體蛋白三聚體、不含遺傳物質的腺病毒殼體及 腺病毒載體均含有至少一種經修飾過的人3型腺病毒六鄰體的可修飾位點，即上述六鄰體 蛋白單體、六鄰體蛋白三聚體、不含遺傳物質的腺病毒殼體及腺病毒載體中的六鄰體高變 區上如SEQ ID NO :1-4所示序列的中至少一個胺基酸位點被修飾，可以利用這樣的六鄰體 蛋白單體、六鄰體蛋白三聚體、不含遺傳物質的腺病毒殼體及腺病毒載體來進行外源蛋白 展示、製備免疫原、製備藥物和製備檢測試劑。其次，本發明還提供了一種腺病毒六鄰體蛋白，該腺病毒六鄰體蛋白含有至少一 種經修飾過的上述人3型腺病毒六鄰體的可修飾位點。即，在該腺病毒六鄰體蛋白的高變 區中，本發明所公開的SEQ ID NO :1-4所示序列中至少有一個胺基酸缺失，或被替換為其他 片段或插入其他片段。本發明還提供了一種不合遺傳物質的腺病毒殼體，所述腺病毒殼體含有上述腺病 毒六鄰體蛋白。本發明還提供了一種腺病毒載體，所述腺病毒載體含有上述腺病毒六鄰體蛋白。本發明還提供了 一種重組腺病毒，所述重組腺病毒含有上述腺病毒六鄰體蛋白。本發明還提供了 一種疫苗株，該疫苗株含有上述腺病毒載體。本發明提供了人3型腺病毒六鄰體的可修飾位點，並提供了利用該位點可以用來 進行外源蛋白展示、製備免疫原、藥物、檢測試劑等方面。為利用人3型腺病毒六鄰體高變 區修飾外源多肽的技術平臺作為疫苗或抗原研究開發的病毒展示技術平臺奠定了基礎。
圖1為實施例1中構建的穿梭質粒PBR322L/R-HVR的電泳圖 2 為實施例 1 中 L-HVR-R (EcoR I/Sal I)與 PBRADV3 Δ E3EGFP-MH5 (Avrll/Pac I)重組後得到的正確克隆質粒的電泳圖；圖3為實施例1中的細胞病變的照片；圖4為實施例2中構建的穿梭質粒PBR322L/R-HVR的電泳圖；圖 5 為實施例 2 中 L-HVR-R(EcoR I/Sal I)與 PBRADV3 Δ E3EGFP-MH5 (Avrll/Pac I)重組後得到的正確克隆質粒的電泳圖；圖6為轉染重組腺病毒基因組後的照片；圖7為實施例3中構建的穿梭質粒PBR322L/R-HVR的電泳圖；圖 8 為實施例 3 中 L-HVR-R(EcoRI/&il I)與 PBRADV3 Δ E3EGFP-MH5 (Avrll/Pac I)重組後得到的正確克隆質粒的電泳圖；圖9為實施例3中的細胞病變的照片。
具體實施例方式為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這 些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍，下列實施例中未提及的具體實驗 方法，通常按照常規實驗方法進行。本發明的「修飾」是指可將其他外源片段與SEQ ID NO :1_4所示序列中的任一個 或多個胺基酸位點進行替換，或在SEQ ID NO :1-4所示序列中的任一個或多個胺基酸位點 處插入其他外源片段，或將SEQ ID NO :1-4所示序列中的任一個或多個胺基酸位點進行缺失。本發明的「位點，，泛指一個或多個胺基酸位點，即除了指代某一個胺基酸位點外， 還可以指代某一段胺基酸序列。本發明中實驗用到的PBRADV3AE3EGFP的製備方法詳見武漢大學博士學位論文 《人3型腺病毒感染性全基因組克隆及表達載體的構建》，張其威，2007年3月，編號10486。為了尋找人3型腺病毒六鄰體高變區中可修飾的胺基酸位點，該發明針對 PBRADV3 AE3EGFP六鄰體高變區進行了三次突變實驗。實施例1 :PBRADV3 Δ E3EGFP六鄰體高變區第一次突變實驗將野生型HADV7的六鄰體高變區HVR1、HVR2、HVR5、HVR7分別替換到病毒載體 PBRADV3 Δ E3EGFP上六鄰體高變區的相應位置(胺基酸序列中下劃線所示)，突變胺基酸序 列如表1中下劃線部分所示。表 權利要求
1.人3型腺病毒六鄰體的可修飾位點，其特徵在於，所述可修飾位點位於六鄰體的高 變區，具有SEQ ID NO :1-4所示序列中的至少一個胺基酸位點。
2.根據權利要求1所述的人3型腺病毒六鄰體的可修飾位點，其特徵在於，所述高變區 為人3型腺病毒六鄰體的高變區1、2、5、7中的至少一種。
3.權利要求1或2所述的人3型腺病毒六鄰體的可修飾位點在外源蛋白展示、免疫原 製備、藥物製備和檢測試劑製備中的應用。
4.六鄰體蛋白單體、六鄰體蛋白三聚體、不含遺傳物質的腺病毒殼體及腺病毒載體在 外源蛋白展示、免疫原製備、藥物製備、檢測試劑製備中的應用，其特徵在於，所述六鄰體蛋 白單體、六鄰體蛋白三聚體、不含遺傳物質的腺病毒殼體及腺病毒載體均含有至少一種經 修飾過的權利要求1或2所述的人3型腺病毒六鄰體的可修飾位點。
5.一種腺病毒六鄰體蛋白，其特徵在於，含有至少一種經修飾過的權利要求1或2所述 的人3型腺病毒六鄰體的可修飾位點。
6.一種不含遺傳物質的腺病毒殼體，其特徵在於，所述腺病毒殼體含有如權利要求5 所述的六鄰體蛋白。
7.一種腺病毒載體，其特徵在於，所述腺病毒載體含有如權利要求5所述的六鄰體蛋白。
8.一種疫苗株，包含權利要求7所述的腺病毒載體。
9.一種重組腺病毒，其特徵在於，所述重組腺病毒含有如權利要求5所述的六鄰體蛋白。
全文摘要
本發明提供了人3型腺病毒六鄰體高變區中可修飾的胺基酸位點，該可修飾位點位於六鄰體的高變區，具有SEQ ID NO1-4所示序列中的至少一個胺基酸位點。這些胺基酸位點是分別位於人3型腺病毒六鄰體的高變區1、2、5、7上。本發明還提供了該可修飾胺基酸位點在外源蛋白展示、免疫原製備、藥物製備、檢測試劑製備中的應用。本發明為利用人3型腺病毒六鄰體高變區修飾外源多肽的技術平臺作為疫苗或抗原研究開發的病毒展示技術平臺奠定了基礎。
文檔編號G01N33/68GK102060915SQ201010526638
公開日2011年5月18日 申請日期2010年10月29日 優先權日2010年10月29日
發明者周榮, 李海濤, 李瀟, 田新貴, 鍾南山, 高文娟 申請人:廣州呼吸疾病研究所