一種慢病毒重組穿梭載體的構建的製作方法
2024-04-07 11:28:05
一種慢病毒重組穿梭載體的構建的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種慢病毒重組穿梭載體的構建方法。根據Gene?Bank中mRNA序列，尋找特徵靶序列。pLKO.1scramble?shRNA載體線性化及回收：將pLKO.1scramble?shRNA用AgeI和EcoR?I雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳鑑定後，回收，測定線性化載體濃度。載體與siRNA模板鏈連接、連接產物的轉化、陽性重組克隆的篩選並送測序。成功構建了靶向慢性病毒的shRNA幹擾載體，並篩選出最佳抑制效率的幹擾載體，為進一步研究JAK/STAT-OPN信號通路參與調控血管再狹窄過程中細胞增殖遷移的分子機制以及為血管再狹窄的分子靶向治療奠定了基礎。
【專利說明】一種慢病毒重組穿梭載體的構建
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程領域，尤其一種慢病毒重組穿梭載體的構建。
【背景技術】
[0002]信號轉導是細胞生命活動的一種最基本和最重要的方式，細胞因子受體介導的JAK-STAT-OPN(janus kinase/signal transducer and activator of transcription)信號傳導途徑是目前心血管分子生物學研究領域的熱點，它把細胞膜上感受的信號直接傳遞到核內一啟動基因轉錄，環節少而簡潔；近來研究表明，JAK-STAT途徑是人體內生理和病理反應的共同通路之一，與多種疾病發病及防治密切相關，廣泛參與細胞應激、生長、增殖、分化和凋亡等多種生物學效應，是多種細胞因子和生長因子信號轉導的重要途徑。國內目前有文獻對正常及低氧等損害情況下血管平滑肌細胞(VSMC)及微血管內皮細胞中全部JAK和OPN的基因和蛋白表達和變化情況進行了初步的研究。顯然深入研究JAK-OPN及其它信號轉導系統對探討疾病發病機制和防治具有重要意義。
[0003]近年來，RNA幹擾(RNA interference, RNAi)這一新興的生物工程技術在疾病的發生、發展及治療研究領域發揮越來越重要的作用，為人們針對某種基因突變或過表達所引起的疾病治療提供了新的策略。本研究通過構建慢性病毒重組穿梭載體，並篩選出最佳抑制效率的幹擾載體，為進一步研究JAK-STAT-0PN信號通路參與調控血管再狹窄過程中細胞增殖遷移的分子機制及為血管再狹窄的分子靶向治療奠定了基礎。
【發明內容】
[0004]本發明提供一種慢病毒重組穿梭載體的構建方法。
[0005]慢病毒重組穿梭載體的構建，其步驟為: [0006]I)根據Gene Bank中mRNA序列，參考shRNA設計原貝丨」，選擇cDNA序列上的四個部位作為目標序列，同時將選中的shRNA中的鹼基序列隨機打亂設計為陰性對照，對照序列經BLAST檢測證實與mRNA及其他基因編碼序列無同源性；
[0007]2)設計shRNA模板、正義鏈模板、反義鏈模板三條序列，並將設計好的序列送上海生工生物技術有限公司合成；
[0008]3) pLK0.1scramble shRNA 載體線性化及回收:將 pLK0.1scramble shRNA 用 AgeI和EcoR I雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳鑑定後，回收，測定線性化載體濃度；
[0009]4)載體與SiRNA模板鏈連接、連接產物的轉化、陽性重組克隆的篩選並送測序；
[0010]5)進行幹擾效率檢測，發現PLK0.1-0PN2幹擾效率效果最好，將幹擾效率最高的穿梭質粒PLK0.1-0PN2與psPAX2和pMD2.G質粒一起共轉293T細胞，轉染後48小時後出毒效率最聞。
[0011]本發明的優點:
[0012]I)根據 GeneBank 目的基因 mRNA 的已知序列，在 http: //www.ambion.com/techlib/misc/siRNA finder, html, 戈胃&牛寺IiE白勺革巴歹[J。[0013]2)針對目的基因我們設計三對shRNA序列，構建了三個重組慢病毒表達載體，並將這些重組載體包裝病毒後感染大鼠血管平滑肌細胞，採用Western blot法驗證重組慢病毒對靶基因的抑制效率。實驗結果顯示PLK0.1-0PN2幹擾效率效果最好。
[0014]3)我們選擇幹擾效率高的PLK0.1-0PN2進行後續研究，為進一步研究JAK-STAT3信號通路在血管平滑肌細胞增殖、凋亡等作用奠定了基礎，為抑制血管平滑肌細胞增殖的基因治療提供了新的思路。
【具體實施方式】
[0015]下面結合具體具體實施實例，對本發明進一步說明，但發明的保護範圍並不限於此。
[0016]雄性SD大鼠，體重150_250g，由南京醫科大學實驗動物中心提供。U6啟動子質粒(如PavU6+27)由北京本元正陽基因技術公司構建，克隆用大腸桿菌DH5 α株(Gibco/BRL公司)，限制性內切酶Age1、EcoRI，T4DNA連接酶，RT-PCR試劑盒均為大連Ta Kara生物公司產品；RNA提取試劑Tripure、DEPC購自美國Roche公司；DMEM培養基、胰蛋白酶、Trizol試劑(Gibcobrl公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，噻唑藍(MTT)、二甲基亞碸(DMSO) ,AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(Roche公司)；Omniscript RT Kit (Qiagen公司)，反轉錄隨機引物(Toyobo公司)，SYBR Premix Ex Taq(大連Takara公司)。試驗中所用的核酸標準分子量Marker以及蛋白預染Marker均為美國Fermentas MBI公司產品。去內毒素質粒大量提取試劑盒為德國Qiagen公司產品。質粒轉染試劑LipofectamineTM 2000購置美國invitrogen公司。兔抗鼠STAT3單克隆抗體以及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG購自美國Santa Cruz公司。用於Western blot檢測的增強化學發光試劑ECL為美國CellSignal 公司產品。PV DF 轉印膜購自美國 Schleicher&Schuell Bioscience 公司。
[0017]1、幹擾序列，設計及合成
[0018]根據 GeneBank 目的基因 mRNA 的已知序列，在 http: //www.ambion.com/techlib/misc/siRNA finder, html,尋找符合特徵的祀序列。
【權利要求】
1.一種重組病毒質粒載體，其特徵是該載體含有大鼠的OPN的基因幹擾片段。
2.按照權利要求1所述的載體，其特徵是該載體為大腸桿菌表達載體。
3.按照權利要求2所述的載體，其特徵是該載體為PLK0.1-0PN-2。
4.按照權利要求3所述的載體，其特徵是該載體的al序列為:
5.按照權利要求4所述的載體以及psPAX2和pMD2.G質粒一起共轉293T細胞，轉染後48小時後收集病毒。
6.按照權利要求5所述 的 病毒轉染到大鼠體內後，降低OPN蛋白表達。
【文檔編號】C12N15/113GK103882058SQ201210563553
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月24日 優先權日:2012年12月24日
【發明者】劉代新, 彭高松 申請人:蘇州中同生物科技有限公司