一種生產棉花植株的組織培養方法

2023-12-12 08:48:27

專利名稱：一種生產棉花植株的組織培養方法
技術領域：
本發明涉及一種從植物的特異性組織體外產生大量能存活的棉花植株的組織培養方法。本發明提供了一種同步化體細胞胚發生的方法，開啟了通過現代農業生物技術和遺傳工程的方法，獲得農學上改進的均一棉花植株群體的新的可能性。該方法提供了利用組織培養技術成功改進棉花項目中的一個重要步驟。
背景技術：
棉花是一種重要的全球作物，其種植主要為獲得纖維。棉籽為家畜的重要食物來源。棉花影響全世界許多國家的經濟發展。因此，通過農業生物技術的現代方法改進棉花的項目引起了全世界興趣。這增加了發展組織培養以促進遺傳工程的現代技術應用於棉花植株的重要性。儘管棉花具有重要的經濟價值，由於缺乏重現性好、耗時少和效率高的方法高頻再生棉花的機體組織和植株，通過遺傳工程的棉花改進僅以相對緩慢的速度進行。
已很好地建立了通過組織培養技術再生植物。雖然植物細胞的全能性是眾所周知的現象，但各種植物或植物各部分需要專業研究，以創造這種高效高頻再生的條件。似乎多數人認為，成功誘導分化依賴於外植體的類型、外植體的生理條件和外植體在培養過程中的理化環境。因此，組織培養科學涉及優化來源植物的生理條件、外植體的類型、培養條件及植物生長調節劑或用於起始組織反應的其它培養基附加物。
在體外器官發生中或通過體細胞胚發生，已成功再生了各種各樣的植物品種。選擇的再生模式常基於植物品種遺傳轉化方法的相對情況、效率和適用性。不以分生組織為基礎的方法，即體細胞胚發生的方法通常是一種優選的模式，因為其排除了假陽性或嵌合轉化體的可能性。
通過體細胞胚發生從外植體再生包括幾個生長時期。最常見的是，在無菌條件下給予來自成熟植物部分或器官或萌發籽苗的外植體以化學成分明確的營養培養基。培養時，在人工控制的光線、溫度和光周期條件下，切除的植物部分將產生分化的細胞團塊，稱為愈傷組織。
在一系列合適的理化環境下，即營養物、光線、溫度、光周期以及通過加入合適組合的和合適濃度的植物生長調節劑，或通過突然去除這些因素，作為這種條件下培養的結果，據報導一些植物品種的愈傷組織產生了胚形成愈傷組織，這些愈傷組織反過來又通過體細胞胚發生的過程形成體細胞胚。
體細胞胚是體細胞發育出來的胚芽。每個體細胞胚都是能發育成完整植株的有序組織團塊。體細胞胚與種子發育的合子胚非常相似，除了它們的發育不包括減數細胞分裂(減數分裂)，並且尺寸常常更大。
一種或多種培養基成分濃度的變化可導致植物組織體外發育和分化的變化。有報導磷酸肌醇介導的信號途徑會影響植物的發育和胚發生。在特定時期使組織肌醇飢餓一定時間可使組織發育同步化，而不降低其生存能力。然而，在完成植物或體外胚發育的同步化過程中以前未有使用肌醇的報導，其是本發明的最重要方面。
迄今，已有幾篇關於棉花體細胞胚發生技術的報導已出版或授予了專利權。經過特定處理的外植體種體細胞胚發生頻率通常較低。此外，從每個外植體獲得的胚數不高。體外胚發生所需時間周期長和方法的基因型依賴性進一步增加了棉花體細胞胚發生的難度。
如果能開發一種用於棉花模式品種的方法以提供一套能改善體細胞胚發生頻率的配方設計和條件，並且如果該方法需要較少的時間將是有利的。同步化發育利於收穫更多數量的再生植株。同步化發育不僅生產大量的植株，而且同一生長期的所有植物群體均一。簡化步驟和配方設計能進一步增強該方法的適用性。使用液體培養基進一步利於遺傳轉化(轉基因植物發育)過程中的高效選擇，因為在液體培養中的選擇壓力(例如，對抗生素的抗性)能更均勻地穿透細胞。所有這些方面在本發明中已實現。棉花胚的同步化發育以前未曾提及並且是本發明的一個重要方面。
現有技術的描述有幾篇公布的報導研究了導致棉花胚發生和植物再生的組織培養條件。
Davidonis和Hamilton在Plant Sci.Letter(1983)3289-93和美國專利No.4,672,035(1987)中報導了2歲G.hirsutum愈傷組織中的體細胞胚發生。Shoemaker等人，1986年表徵了17個棉花栽培品種中的體細胞胚發生和植株再生(Plant Cell Rep.3178-181)。Trolinder和Goodin(1987)及Finer(1988)報導了棉花懸浮培養中的體細胞胚發生(Plant Cell Rep 6231-234；Plant Cell Rep.7399-402)。這些方法花了幾個月時間發育再生的植物。這些方法高度依賴於基因型(Trolinder和Xhixian，1989 Plant CellRep.8133-136)，因此，僅可應用於少數棉花栽培品種。由於培養時間長，這些方法發育的植物常報導為不育或具有細胞遺傳學異常(Trolinder andGoodin，1987 Plant Cell Rep.6231-234)。Rangan(1993)在美國專利no.5,244,802和Rangan and Rajasekaran(1997)在美國專利No.5,695,999中報導了幾種棉花變種中來自籽苗的外植體的胚發生。Gawel和Robacker(1990)在Plant Cell Tiss.Organ Cult.23201-204中比較了半固體和液體增殖培養基上棉花的體細胞胚發生。Kumar等人，1998年報導了利用改進的Trolinder和Goodin方法在Coker 310與印度棉花變種的F1雜種中的體細胞胚發生。Zhang等人，2000年在Plant Cell Tiss.Organ Cult.6089-94中描述了源於異常體細胞胚衍生的外植體的體細胞胚發生。
已將其中的幾種方法或其改進用於Agrobacterium介導的棉花轉化(Umbeck et al.，1987 Bio/Technology 5263-266；Firoozabady et al.，1987Plant Mol.Biol.10105-116)或粒子轟擊介導的棉花轉化(Finer andMcMullen，1990 Plant Cell Rep.8586-589)。已將某些細菌基因，如那些編碼除草劑抗性的基因(Bayley et al.，1992 Theo.Appl.Genet.83645-649)以及蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)內毒素基因(Perlak et al.，1990Bio/Technology 8939-943)在轉基因植物中成功表達。Strickland(1998)在美國專利No.5,846,797中報導了轉化的外植體在不含生長調節劑的培養基上再生。一旦有可用的高效再生方法，特別是體細胞胚發生，就可將其便利地用於棉花的轉化或遺傳工程。
將以前的各種技術之間的比較提供如下表1表1 誘導體細胞胚發生的現有棉花再生技術的綜述
表1中的報導4聲稱開發植物為不育的，而本申請描述的方法給出了可育的健康植物。相對於從田間生長的植株收集的籽苗外植體隨機選擇庫，本方法給出了高頻率的體細胞胚發生。這是在早期報導基礎上的重要進步，其中外植體取自已經篩選而用於體細胞胚發生的樣品(表1的報導11和12)。此外，至今未有公開報導描述棉花體細胞胚發生的同步化。此外，沒有報導描述任何其它植物將肌醇飢餓法用作工具以在體細胞胚發育中誘導同步化。對於棉花來說，體細胞胚同步化發育在現有技術中是不可能的，而其是本發明的一個非常重要的成就。
本發明的成功依賴於用於在外植體誘導愈傷組織的植物生長調節劑的濃度和組合，以及使用本發明的包括短期肌醇飢餓階段的方法培養愈傷組織的方式。一旦誘導出愈傷組織，該方法任何後續步驟中就不需要任何外源的植物生長調節劑或其它培養基添加劑(例如，報導4和6中額外的KNO3以及報導11和12中的活性炭)。體細胞胚在簡化液體萌發培養基中發芽和生根，該培養基位於以非膠凝劑為基礎的便宜且簡單的載體(例如，蛭石)上。在這方面，本發明描述了適於商品化的簡單且更便宜的方法。
本發明首次描述了肌醇影響體外生長的植物細胞的發育和分化。該方法詳細描述了為了使體細胞胚同步化發育而在特定時間和時間段使用不含肌醇的培養基。當選擇的胚發生細胞團塊經受8-12天肌醇飢餓後，將培養物放回含有肌醇的基礎培養基，此時發現幾乎所有胚處於球形期。進一步生長10天後，絕大部分胚(92％)處於心形期。在隨後的傳代培養中約82％的胚處於魚雷期。當胚發生團塊經受8-12天2個周期的肌醇飢餓，在球形期後未觀察到所述的發育同步化。此外，短期的肌醇飢餓不僅使胚發育同步化，而且最終回收的胚數令人驚訝地增加至4-5倍的高值。
關於棉花的本領域早期專利為美國專利No.4,672,035；美國專利No5,244,802；美國專利No.5,695,999；EP 344302和美國專利No.5,846,797，其中發明者公開了通過體細胞胚發生從棉花愈傷組織再生植株的方法；美國專利No.5,846,797；美國專利No.5,004,863；美國專利No.5,159,135及EP 344302，其中發明者公開了一種轉化棉花的方法，包括基於體細胞胚發生的再生方法，以及WO A1 9215675，其中發明者公開了一種轟擊介導的棉花胚軸轉化方法，由此處發育轉基因植物。
本發明中描述的方法非常簡單，適於商品化；並且快速、具有重現性以及便於在植物遺傳工程中應用。與本領域其它現有技術不同，本方法不會導致形態學和細胞遺傳學異常的植物形成，不同於Stelly等人，1989，並且不會在轉化試驗中產生假陽性轉化體，不同於Sunilkumar andRathore，2001。
發明目的本發明的一個重要目的是提供一種方法，其用於在發育學上同步化棉花體細胞胚發生，並支持從特定植物組織再生大量植株。
本發明的另一個目的是提供一種通過體細胞胚發生再生棉花的改進方法，在該方法中再生的植物生長、成熟並形成可育的植物。
本發明的另一個目的是提供一種簡單且具有重現性的體細胞胚發生方法，至少涉及外部補充的植物生長調節劑和任何其它額外培養基添加劑。
發明概述本發明首次提供了一種通過發育學上同步化體細胞胚發生再生棉花植株的高效方法。本發明的方法簡單、快速、具有重現性並且便於在植物遺傳工程中應用。新穎性的最重要方面是通過肌醇飢餓的步驟實現了同步化體細胞胚發生。該重要方面在申請者已知的任何現有技術中未被提及或甚至未被暗示。
本發明的方法使用了不同於早期報導中所用的生長調節劑組合(2，4二氯苯氧基乙酸和苯甲基腺嘌呤)從籽苗外植體誘導愈傷組織。本發明的方法實現了愈傷組織介導的體細胞胚發生，其花費的時間更短，且產生更多數量的正常可育植物。
因此，根據本發明，提供了一種通過從下胚軸段或中胚軸段或子葉片同步化體細胞胚發生而再生大量能存活和可育棉花植株的方法，所述的方法包括-
(i)以消毒劑處理棉花種子，以去除任何有害的汙染物。
(ii)將來自步驟(i)的處理過的種子培養於第一培養基中，以便發芽，該培養基由下述物質組成(a)任何傳統培養基使用的鹽，(b)任何傳統培養基使用的維生素，(c)肌醇，以及(d)碳源pH範圍為5.2-6.0，用高壓鍋滅菌培養基，將培養物於23-33℃溫度光照(以30-60μmol/m2/s的強度)或黑暗中培育6-12天。
(iii)培養來自步驟(ii)中獲得的籽苗的外植體。
(iv)在第二固體培養基中培養從步驟(iii)獲得的外植體以誘導愈傷組織，該固體培養基由下述物質組成(a)任何傳統培養基使用的鹽，(b)任何傳統培養基使用的維生素，(c)肌醇，(d)碳源，(e)2，4D和BA組合的植物生長調節劑，以及(f)膠凝劑在pH範圍為5.4-6.2，用高壓鍋滅菌該培養基，將培養物培育於23-33℃、至少90μmol/m2/s強度的光照、16h光周期條件下；(v)繼續培養3-5周時間直到從傷口邊緣形成愈傷組織。
(Vi)將來自步驟2產生的愈傷組織以600-1000mg愈傷組織/50ml培養基的填充密度轉移至第三液體培養基中，所述的培養基包括(a)任何傳統培養基使用的鹽，(b)任何傳統培養基使用的維生素，(c)肌醇，以及(d)碳源pH範圍為5.2-6.0，用高壓鍋滅菌培養基，將培養物於23-33℃、20-40μmol/m2/s強度的光照、16h光周期下培育12-32天，足以形成胚發生團塊。
(vii)通過不同網孔大小的金屬篩篩濾細胞懸浮液，選擇篩目尺寸40上收集的細胞/團塊，然後進一步將選擇的團塊傳代培養於如步驟(vi)中的液體基礎培養基中。
(viii)將胚發生的細胞/團塊短時間(8-12天)傳代培養於步驟(vi)的但不含有肌醇的液體基礎培養基中，即第四培養基中。
(ix)進一步將胚發生的細胞/團塊以8-12天的規則間隔傳代培養於步驟(vi)的液體基礎培養基中。
(x)將步驟(viii)和(ix)中的培養物以與步驟(vi)中的溫度、光照、光周期相同的條件培育。
(xi)在旋轉搖床上以110-130rpm搖動步驟(vi)、(viii)和(ix)的培養物。
(xii)將雙極的成熟體細胞胚轉移至第五胚萌發培養基上，該培養基包括(a)任何傳統培養基使用的鹽，(b)任何傳統培養基使用的維生素，(c)減少至四分之一正常濃度的肌醇，以及(d)碳源pH範圍為5.2-6.0，用高壓鍋滅菌培養基，將培養物培育於23-33℃、至少60μmol/m2/s強度的光照、16h光周期的條件，直到長出幼苗。
本發明中，術語外植體指子葉片或下胚軸或中胚軸段。
在本發明的優選實施方案中，所述的第一至第五培養基包括MS培養基的鹽、Gamborg B5培養基的維生素以及碳源。
第一和第五培養基包括MS培養基的鹽和Gamborg B5培養基的維生素的標準濃度的一半，而第二、三、四培養基包括這些成分標準濃度。MS培養基的最優選的鹽及其標準濃度包括下述的表2中顯示的成分表2Murashige和Skoog(1962)培養基的鹽-成分濃度(mg/L)NH4NO31650KNO31900CaCl2.2H2O 440
MgSO4.7H2O370KH2PO4170KI 0.83H3BO36.2MnSO4.4H2O22.3ZnSO4.7H2O8.6Na2MoO4.2H2O 0.25CuSO4.5H2O0.025CoCl2.6H2O0.025Na2.EDTA 37.3FeSO4.7H2O27.8Gamborg B5培養基的優選維生素包括表3中所示的下述成分表3成分 濃度(mg/L)煙酸 1.0鹽酸吡哆醇1.0鹽酸硫胺 10第一培養基中的優選碳源選自蔗糖和葡萄糖，這種碳源使用濃度範圍為1-3％wt./vol.。
第二、三、四培養基中的優選碳源基本為葡萄糖，這種碳源使用濃度範圍為1.5-45.％wt./vol.。
第五培養基中的優選碳源基本為蔗糖，這種碳源使用濃度範圍為1-3％wt./vol.。第二培養基中的優選膠凝劑選自瓊脂(使用濃度範圍為0.6-0.8％wt./vol.)和phytagel(使用濃度範圍為0.15-0.29％wt./vol.)。第一、二、三和五培養基中的優選有機物基本為肌醇，在第一至三培養基中以100mg/L使用，在第五中以25mg/L使用。
在第二培養基中使用的植物生長調節劑選自作為植物生長素的2，4D和作為細胞分裂素的BA。
在另一優選實施方案中，本發明的方法包括(i)通過常規方法滅菌棉花植物種子，以去除汙染物，如細菌/真菌；(ii)將滅菌的種子培養於表4中所示的培養基中，以便發芽；(iii)從步驟(ii)中獲得的籽苗切下外植體；(iv)將步驟(iii)中獲得的外植體培養於表5中所示的培養基中，pH範圍為5.4-6.2，用高壓鍋滅菌培養基；(v)將外植體於23-33℃的溫度、至少90μmol/m2/s強度的光照中以16h光周期培養3-5周時間，直到形成足夠的愈傷組織；(vi)將愈傷組織轉移至表6中所示的具有下述組合物的胚發生誘導培養基中，pH範圍為5.2-6.0，用高壓鍋滅菌培養基；(vii)在23-33℃、20-40μmol/m2/s強度的光照、16h光周期下培養2-5周時間直到形成胚發生的團塊；(viii)篩選胚發生的團塊並轉移至不含肌醇的具有表7中所示的組合物的培養基中，pH範圍為5.2-6.0，用高壓鍋滅菌培養基，並於23-33℃的溫度在20-40μmol/m2/s強度的光照中以16h光周期短時間培養8-12天；(ix)將滲透壓休克的培養物轉移至步驟(vi)的液體基礎培養基中，繼續在此培養基上培養，體細胞胚在此同步化；(x)將成熟的雙極體細胞胚轉移至表8中所示的胚萌發培養基中，pH範圍為5.2-6.0，用高壓鍋滅菌培養基；(xi)包含於23-33℃、至少60μmol/m2/s強度的光照、16h光周期下培養，直到幼苗足以發育，使取出後能適應環境；(xii)使再生的植株適應盆栽混合物環境，該盆栽混合物包括2∶1∶1∶1的比例的栽培土壤∶沙子∶蛭石∶pectmoss；表4種子萌發培養基-a.較多的鹽成分 濃度(mg/L)NH4NO3825KNO3950
CaCl2.2H2O220MgSO4.7H2O185KH2PO485b.較少的鹽成分濃度(mg/L)KI 0.425H3BO33.6MnSO4.4H2O11.15ZnSO4.7H2O4.3Na2MoO4.2H2O 0.125CuSO4.5H2O0.0125CoCl2.6H2O0.0125Na2.EDTA 18.65FeSO4.7H2O13.9c.有機物肌醇 100d.維生素成分 濃度(mg/L)煙酸 0.5鹽酸吡哆醇0.5鹽酸硫胺 5e.碳源蔗糖或葡萄糖 20g/lpH範圍為5.2-6.0，用高壓鍋滅菌培養基表5愈傷組織誘導培養基a.較多的鹽成分 濃度(mg/L)NH4NO31650
KNO31900CaCl2.2H2O 440MgSO4.7H2O 370KH2PO4170b較少的鹽成分濃度(mg/L)KI 0.83H3BO36.2MnSO4.4H2O 22.3ZnSO4.7H2O 8.6Na2MoO4.2H2O 0.25CuSO4.5H2O 0.025CoCl2.6H2O 0.025Na2.EDTA 37.3FeSO4.7H2O 27.8c.有機物肌醇100d.維生素成分濃度(mg/L)煙酸1.0鹽酸吡哆醇 1.0鹽酸硫胺10e.碳源葡萄糖 30g/lf.膠凝劑瓊脂8g/l或Phytagel 2.2g/lg.植物生長調節劑植物生長素0.44至4.4μM細胞分裂素0.22μM至2.2μM
表6胚發生誘導培養基a.較多的鹽成分 濃度(mg/L)NH4NO31650KNO31900CaCl2.2H2O440MgSO4.7H2O370KH2PO4170b.較少的鹽成分 濃度(mg/L)KI 0.83H3BO36.2MnSO4.4H2O22.3ZnSO4.7H2O8.6Na2MoO4.2H2O 0.25CuSO4.5H2O0.025CoCl2.6H2O0.025Na2.EDTA 37.3FeSO4.7H2O27.8c.有機物肌醇 100d.維生素成分 濃度(mg/L)煙酸 1.0鹽酸吡哆醇1.0鹽酸硫胺 10e.碳源葡萄糖30g/l
表7缺乏肌醇的培養基a.較多的鹽成分濃度(mg/L)NH4NO31650KNO31900CaCl2.2H2O 440MgSO4.7H2O 370KH2PO4170b.較少的鹽成分濃度(mg/L)KI 0.83H3BO36.2MnSO4.4H2O 22.3ZnSO4.7H2O 8.6Na2MoO4.2H2O 0.25CuSO4.5H2O 0.025CoCl2.6H2O 0.025Na2.EDTA 37.3FeSO4.7H2O 27.8c.維生素成分濃度(mg/L)煙酸1.0鹽酸吡多辛 1.0鹽酸硫胺10d.碳源葡萄糖 30g/l表8胚萌發培養基
a.較多的鹽成分濃度(mg/L)NH4NO3825KNO3950CaCl2.2H2O 220MgSO4.7H2O 185KH2PO485b.較少的鹽成分濃度(mg/L)KI 0.425H3BO33.6MnSO4.4H2O 11.15ZnSO4.7H2O 0.43Na2MoO4.2H2O 0.125CuSO4.5H2O 0.0125CoCl2.6H2O 0.0125Na2.EDTA 18.65FeSO4.7H2O 13.9c.有機物肌醇25d.維生素成分濃度(mg/L)煙酸0.5鹽酸吡哆醇 0.5鹽酸硫胺5e.碳源蔗糖20g/l根據本發明的實施方案，基礎的胚發生團塊能經受進一步的多輪肌醇飢餓和隨後的同步化胚發生及植株再生。
發明詳述在本發明的方法中，體外培養前將種子表面滅菌以使其不帶有細菌/真菌汙染物。表面滅菌包括以包含任何一種消毒劑，如次氯酸鈉、次氯酸鈣、氯化汞、乙醇、溴化十六烷基三甲銨等的溶液處理種子。種子的表面滅菌可通過下述方法完成，即連續攪拌下以0.05-0.5％w/v氯化汞水溶液處理種子3-11分鐘，然後以滅菌蒸餾水充分洗滌(4-8次)，再將種子浸入精餾酒精(50-100％v/v)中10-20sec，然後在酒精燈火焰中灼燒5-10sec。
表面滅菌的種子可置於濾紙船上發芽，濾紙船以種子萌發培養基浸潤，該培養基包含濃度稀釋至一半的Murashige和Skoog鹽、濃度稀釋至一半的Gamborg B5培養基、100mg/L肌醇以及任何碳源，如葡萄糖或蔗糖1-3％wt./vol.，再將培養基的pH至5.2-6.0，並用高壓鍋於121℃，16psi滅菌16min而使其無菌。
為了發芽，可將種子於23-33℃下光照(以30-60μmol/m2/s的強度)或黑暗中培育，直到種子發芽並形成成熟的籽苗。
優選地，於無菌環境，即本領域已知的層流中，以鋒利的消毒解剖刀和刀片切下發芽後6-12d大的籽苗而獲得外植體(子葉片、下胚軸段或中胚軸段)。
將切下的外植體置於培養基中，該培養基包含表2所示濃度的Murashige和Skoog鹽、表3所示濃度的Gamborg B5維生素、100mg/L肌醇、優選為1.5-4.5％wt./vol.葡萄糖的碳源、優選為0.6-0.8％wt./vol。瓊脂或0.15-0.29％wt./vol.phytagel的凝膠劑以及植物生長調節劑0.44-4.44μM的2，4D和0.22-2.22μM的BA。將培養基pH調節至5.4-6.2，然後於121℃、16psi滅菌16min。將用於誘導愈傷組織的培養基成分列於表5中。將培養物於23-33℃、至少90μmol/m2/s的白色螢光中以16h光周期培育3-5周時間。此時，從外植體切割邊緣形成足夠的愈傷組織。愈傷組織外表可為淺黃色至褐色，脆性質地。
可將從外植體的切割邊緣長出的愈傷組織以600-1000mg愈傷組織/50ml培養基的填充密度轉移至250ml瓶的液體基礎培養基中，該培養基成分如表6所示。培養基不包括任何生長調節劑或膠凝劑，將其pH調節至5.2-6.0，然後於121℃、16psi滅菌16min。可將愈傷組織的細胞於該培養基中在旋轉搖床上以110-130轉/分鐘搖動，搖床設置為23-33℃、20-40μmol/m2/s光強度、16hrs光周期。可將細胞於該培養基和該培育條件中培養12-32天時間，直到在細胞懸浮培養中形成胚發生的團塊。
可篩選搖動的液體基礎培養基中發育的細胞懸浮液以選擇培養物中的胚發生細胞團快/群體。可穿過10、40和100篩目尺寸的金屬篩的組合進行選擇。篩目尺寸10的金屬篩收集較大的組織塊，100目的金屬篩收集小的細胞懸浮物。在篩目尺寸40的金屬篩上收集可轉變為胚發生的含有較小團塊的細胞部分。將選擇的細胞部分轉移至新鮮的液體基礎培養基中，間隔8-12天規則地傳代培養，或可將其轉移至缺乏肌醇的培養基中8-12天時間，該培養基為液體基礎培養基減去肌醇，成分列於表7中，然後將肌醇放回新鮮液體基礎培養基，再以8-12天的間隔規則地傳代培養。在這兩種情況中，體細胞胚都能發育但具有不同的發育命運。在前者中，在每個8-12天的周期中可以獲得相似頻率的各個發育期的胚，在後者中，胚發育得以同步化，幾乎所有的胚都保持在同一發育時期。本發明策略是選擇第二種方法培養胚發生的團塊。
此外，將成熟的雙極魚雷期胚取出懸浮液用於發芽後，基部的胚發生團塊用於進一步的的循環，即肌醇缺失、發育同步化以及隨後收穫成熟胚用於發芽。
可將胚發生的團塊和同步化的胚培養於110-130次擺動/分鐘的旋轉搖床上的搖動培養基中，溫度為23-33℃，光的強度為20-40μmol/m2/s，光周期為16hrs.。
可將成熟的雙極體細胞胚取出液體培養基，轉移至固體支持物上，該支持物優選以胚萌發培養基飽和的蛭石，該培養基成分列於表8中。將培養基pH調節至5.2-6.0，然後於121℃、16psi滅菌16min。可將培養物於23-33℃、至少為60μmol/m2/s的光照中以16h的光周期培育。可向發芽胚中加入新鮮的液體培養基，每周一次。將胚生長於胚萌發培養基中一定時間，使其足以形成具有發育良好的根的4-5葉期(leaf stage)幼苗。此時，可取出幼苗轉移至以2∶1∶1∶1比例的栽培土壤∶沙子∶蛭石∶泥煤苔的盆栽混合物中。使用透明聚乙烯袋覆蓋植物，內表面灑水，給予新發育的幼苗良好的溼潤條件。在這些條件以及23-33℃的溫度、強度至少為90μmol/m2/s的螢光和16h的光周期下將幼苗培養一段時間，使其足以適應環境後，如果需要，可將植物轉移至田間。
現在將參考下述非限制性的實施例對本發明進行更具體的描述。
實施例1外植體誘導體細胞胚發生的培養基依賴性效應將棉籽(Ghirsutum L.Coker 312)以0.1％w/v氯化汞處理7分鐘，以滅菌蒸餾水洗滌6次，然後將種子浸入精餾酒精中10秒，再以火焰燻燒。滅菌的種子置於濾紙船上發芽，該濾紙船以種子萌發培養基浸潤，該培養基包含濃度稀釋至一半的Murashige和Skoog鹽、濃度稀釋至一半的Gamborg B5維生素、100mg/L肌醇以及2％w/v蔗糖(高壓鍋滅菌前調節培養基的pH至5.6)。為了發芽，將種子於28±2℃、白色螢光(30μmol/m2/s)下以16h的光周期培育。繼續培養，直到種子發芽產生胚根和胚芽，具有伸展良好的子葉。
將9天大的籽苗用於提供作為外植體的下胚軸段和子葉片。用鋒利、消毒的解剖刀切下外植體。將外植體置於愈傷組織誘導培養基CIM1上，該培養基包含Murashige和Skoog鹽、Gamborg B5維生素、100mg/l肌醇、3％w/v葡萄糖、750mg/l MgCl2和0.22％w/v phytagel，補充了2.2μM2，4-D和0.88μM BA(高壓鍋滅菌調節培養基的pH至5.8)。
將外植體於該培養基上28±2℃、90μmol/m2/s強度的光照中以16h的光周期培育3-4周。將從外植體的切割邊緣長出的愈傷組織切下，以800mg愈傷組織/50ml培養基的填充密度接種於250ml Ehrlenmeyer瓶的液體基礎培養基中，該培養基包含Murashige和Skoog鹽、Gamborg B5維生素、100mg/l肌醇、3％w/v葡萄糖，pH5.6。將培養基以高壓鍋於121℃、16psi滅菌16min。將培養物於旋轉搖床上以120rpm搖動，溫度為28±2℃、光的強度為30μmol/m2/s、光周期為16h。
用於誘導愈傷組織的外植體還可在培養基CIM2、CIM3和CIM4上培養，這些培養基包含Murashige和Skoog鹽、Gamborg B5維生素、100mg/l肌醇、3％w/v葡萄糖、750mg/l MgCl2和0.22％w/v phytagel，補充了不同的生長調節劑組合，如0.45μM 2，4-D加上2.32μM Kin.(CIM2中)；10.7μM NAA加上4.64μM Kin.(CIM3中)；2.68μM NAA加上2.4μM 2iP(CIM4中)。將培養物培育於相同的溫度和光照條件中。將愈傷組織轉移至液體基礎培養基中並以類似的方式培養。
培養物在液體培養基中生長20-22天後，產生的懸浮物過不同篩孔尺寸(10、40和100目，SIGMA化學公司，St.Louis)的金屬篩進行篩選。棄去篩目尺寸10上收集的較大團塊和篩目尺寸100上收集的小懸浮物。將篩目尺寸40上收集的較小細胞/團塊傳代培養於新鮮的液體基礎培養基中並記錄體細胞胚的存在。在胚發生團塊存在的基礎上，計算誘導體細胞胚發生(SE)的頻率，並相應地記錄各種培養基組合中的每個外植體獲得的體細胞胚數。獲得的結果總結於表9中。
表9在選擇的培養基組合物下不同外植體類型的胚發生效應
*顯示胚發生的愈傷組織誘導的外植體百分比體細胞胚發生(SE)誘導和成熟胚形成的臨界差，對於子葉外植體分別為17.69和3.43(n＝5，重複2次)，對於下胚軸外植體分別為13.14和2.16(n＝6，重複3次)。
從結果看來，很明顯，生長調節劑組合和濃度方面的變化導致體細胞胚發生誘導頻率和每個外植體獲得的成熟體細胞胚數方面的不同效應。因此，可將該發現用於開發棉花植物再生的最佳條件。
實施例2重複實施例1的方法，除了將種子於黑暗中發芽和生長9天，直到黑暗中發育出胚根和胚芽，並具有伸展良好的子葉。基本上獲得了相同的結果。
實施例3重複實施例1的方法，除了種子萌發培養基包含2％w/v葡萄糖作為碳源。獲得了相同的結果。
實施例4重複實施例2的方法，除了種子萌發培養基包含2％葡萄糖以取代蔗糖。獲得了相似的結果。
實施例5以棉花變種Coker 310重複實施例1和2的方法。獲得了相似的結果。
實施例6在一定程度上重複實施例1的方法，直到在懸浮物中獲得胚發生團塊，該懸浮物來源於在2，4-D和BA的組合上產生的愈傷組織。將胚發生團塊傳代培養於缺乏肌醇的液體基礎培養基(BM)中。將傳代培養於包含肌醇的液體基礎培養基中的胚發生團塊作為對照。將團塊以約800mg細胞/50ml培養基的填充密度接種，並在旋轉搖床上以實施例1中的光照、溫度和光周期條件培育。在缺乏肌醇的培養基中進行1-2次的10天傳代培養後，將培養物返回到包含肌醇的基礎液體培養基中。記錄兩種條件下每單位重量中不同發育時期胚的頻率和數量。將獲得的數據顯示於表10中。
表10使用肌醇飢餓法的體細胞胚發生的同步化
從結果可明顯看出，在無肌醇缺乏時，獲得了不同步的胚發生。因此，胚發生團塊在包含肌醇的基礎培養基中的連續傳代培養產生了幾乎相似頻率的處於各個發育時期的胚。然而，當將胚發生團塊傳代培養於不含肌醇的基礎培養基中一個10天的單循環，然後返回到包含肌醇的基礎培養基時，產生了體細胞胚的同步化發育(在基礎培養基上的一次傳代培養後，處於球形期的胚佔100％；在基礎培養基上的2次傳代培養後，處於心形期的胚佔91.66％；以及在3次傳代培養後，處於魚雷期的胚佔81.99％)。每個外植體產生的成熟胚的總數增高4-5倍。當傳代培養於不含肌醇的培養基中2個循環時，胚發生團塊在胚發育時期的均一性出現減小。因此，需要單循環的肌醇飢餓誘導高水平的胚發生同步化。
實施例7
如實施例1，將棉籽(G.hirsutum L.Coker)滅菌和發芽。將外植體浸入Agrobacterium(土壤桿菌屬)懸浮液中10-15分鐘，擦乾，然後接種於共培養培養基中，該培養基包括Murashige和Skoog鹽、Gamborg B5維生素、100mg/l肌醇、3％w/v葡萄糖、750mg/l MgCl2和0.22％w/v phytagel，補充了2.2μM 2，4-D和0.88μM BA(高壓鍋滅菌將培養基的pH調節至5.8)。將培養物於28±2℃、90μmol/m2/s的光照中以16h的光周期培育3天。3天後，將外植體以無菌水洗滌，再次擦乾，然後接種於培養基中，該培養基具有類似於共培養培養基的成分，除了補充了250mg/l沃格孟汀(augmentin)和50mg/l卡那黴素。按照實施例1和實施例6進一步培養外植體。在體細胞胚發生和轉化植物的再生方面獲得了相似的結果。
用於本試驗的Agrobacterium株是一種普通的試驗株LBA 4404，荷載二元載體pIG衍生物，其具有作為選擇標記物的nptII和作為報告基因的具有內含子的gusA。
從轉化的外植體獲得的再生來看，很明顯，當所有回收胚為GUS+ve並在組化試驗後顯示均一藍色時，在選擇試劑(在此試驗中為卡那黴素)存在下培養液體培養基中的推定轉化細胞更不易產生假陽性選擇體(selectant)。此外，以轉化的外植體獲得體細胞胚發生誘導頻率和每個外植體的成熟體細胞胚數，用與不用Agrobacterium tumefaciens(根瘤土壤桿菌)處理的結果相似。
實施例8重複實施例7的方法，除了將外植體在黑暗中共培養。基本上獲得了相似的結果。
權利要求
1.一種通過體細胞胚發生、採用短期肌醇飢餓後基本同步化胚發育而再生棉花的方法，所述的方法包括下述步驟(i)從萌發的棉花籽苗上切下外植體，該外植體選自子葉、下胚軸、中胚軸及其混合物；(ii)為了誘導愈傷組織，將所述外植體培養於第一固體培養基中，包含作為碳源的葡萄糖，補充了Gamborg B5維生素、2，4-D和BA以及肌醇的培養用培養基中，溫度為23-33℃，光強度為至少90μmol/m2/s，光周期為16h，時間為3-5周，以使從所述外植體形成去分化的愈傷組織；(iii)將愈傷組織從第一固體愈傷組織誘導培養基轉移至包括基礎培養基的液體培養基中，該基礎培養基包含作為碳源的葡萄糖，並補充了Gamborg B5維生素，然後將其產生的懸浮物在23-33℃、20-40μmol/m2/s降低的光強度、光周期為16h條件下培養足以形成胚發生團塊的一段時間；(iv)通過不同篩孔尺寸的金屬篩篩選所述細胞懸浮物，以選擇胚發生細胞和/或團塊，並將包含體細胞胚的所述胚發生愈傷組織傳代培養於所述的基礎培養基中；(v)將所述胚發生塊/團塊傳代培養於所述的缺乏肌醇的基礎培養基中一段足夠的時間以讓其經受肌醇缺乏，然後將該培養物返回到包含肌醇的培養基中，以使所述體細胞胚在發育上同步化；(vi)將雙極的體細胞胚轉移至支持物上的胚萌發培養基，然後讓所述胚於胚萌發培養基中生長發育至足夠能轉移至土壤的幼苗期；(vii)進一步將所述幼苗轉移至盆栽混合物中以適應環境，然後再轉移至田間。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述的外植體來源於棉花或任何其它植物籽苗。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述的外植體來源於棉花栽培品種Coker 312，並且所述的籽苗以下述方法發育(i)將棉花種子於0.1％HgCl2的滅菌液中滅菌5-10min，優選7min，(ii)以滅菌水洗滌種子4-6次，(iii)將所述種子於酒精燈火焰中燻燒5-10秒，(iv)將所述種子接種於種子萌發培養基上，(v)讓所述種子於種子培養基中在光照或黑暗中於23-33℃生長6-12天時間，優選9-10天，(vi)從所述籽苗切下所述外植體。
4.如權利要求3所述的方法，其中種子萌發培養基為液體培養基，包括一半濃度的Murashige和Skoog鹽和Gamborg B5維生素。
5.如權利要求3所述的方法，其中種子萌發培養基中的碳源選自1-3％wt./vol.範圍內的蔗糖和葡萄糖。
6.如權利要求1所述的方法，其中所述的第一固體愈傷組織誘導培養基包括Murashige和Skoog培養基的下列成分成分 濃度(mg/L)a.Murashige和Skoog(1962)培養基的鹽NH4NO31650KNO31900CaCl2.2H2O 440MgSO4.7H2O 370KH2PO4170KI 0.83H3BO36.2MnSO4.4H2O 22.3ZnSO4.7H2O 8.6Na2MoO4.2H2O 0.25CuSO4.5H2O 0.025CoCl2.6H2O 0.025Na2.EDTA37.3FeSO4.7H2O 27.8b.有機物肌醇 100。
7.如權利要求1所述的方法，其中Gamborg B5維生素，無論在什麼情況下都包括成分濃度(mg/L)煙酸1.0鹽酸吡哆醇 1.0鹽酸硫胺10。
8.如權利要求1所述的方法，其中第一固體愈傷組織誘導培養基中作為外源提供的植物生長素的2，4-D選自0.44至4.4μM的範圍，優選1.76至2.64μM。
9.如權利要求1所述的方法，其中第一固體愈傷組織誘導培養基中作為外源提供的細胞分裂素的BA選自0.22μM至2.2μM的範圍，優選0.66μM至1.00μM。
10.如權利要求1所述的方法，其中所述的第一固體愈傷組織誘導培養基中的膠凝劑選自0.6-0.8％wt./vol.範圍、優選0.7％的瓊脂以及0.15-0.29％wt./vol.範圍、優選0.22％wt./vol.的phytagel。
11.如權利要求1所述的方法，其中所述的第一固體愈傷組織誘導培養基包含作為首要碳源的葡萄糖。
12.如權利要求1所述的方法，其中將所述的外植體培養於所述的愈傷組織誘導培養基中，溫度為23-33℃，優選27-29℃，光強度為至少90μmol/m2/s，光周期為16h，時間不超過3-5周，以使去分化的愈傷組織能從任何所述的外植體形成。
13.如權利要求1所述的方法，實質上包括下述步驟，即將愈傷組織從所述的第一固體愈傷組織誘導培養基轉移至Ehrlenmeyer瓶中的液體培養基，填充密度為600至1000mg愈傷組織/50ml培養基，優選800mg/50ml，然後於旋轉搖床上以110-130rpm搖動此步驟和隨後所有步驟中的培養物，直到將體細胞胚取出用於發芽。
14.如權利要求1和13所述的方法，其中所述的胚發生誘導培養基為基礎液體培養基，包括MS鹽、Gamborg B5維生素、肌醇和作為碳源的葡萄糖。
15.如權利要求1和13所述的方法，其中將液體培養基中的植物細胞懸浮物胚發生團塊及其產生的體細胞胚在23至33℃的溫度，優選27-29℃、光強度為20-40μmol/m2/s，典型地為27-33μmol/m2/s、光周期為16h的條件下培育。
16.如權利要求1所述的方法，其中所述的胚發生塊/團塊於肌醇缺乏的培養基中經受肌醇缺乏8-12天時間，優選為10天，所述肌醇缺乏培養基包括MS基本的鹽、Gamborg B5維生素、作為碳源的葡萄糖，但沒有肌醇，導致體細胞胚的發育同步化。
17.如權利要求1所述的方法，其中所述的第一固體愈傷組織誘導培養基的pH範圍為5.4-6.2，所述方法中的全部液體培養基的pH範圍為5.2-5.8，並於121℃，16psi高壓滅菌16分鐘而無菌。
18.如權利要求1所述的方法，其中盆栽混合物包括2∶1∶1∶1比例的栽培土壤∶沙子∶泥煤苔∶蛭石。
19.如權利要求1所述的方法，其中將體細胞胚發生的發育同步化用於優良棉花栽培品種的繁殖或轉基因棉花栽培品種的發育。
20.如權利要求1所述的方法，其中將所述的肌醇缺乏用於除棉花以外的植物品種，以增強組織培養中的胚發生。
21.如權利要求1所述的方法，其中所述的培養用培養基和基礎培養基包括Murashige和Skoog培養基。
22.如權利要求1所述的方法，其中所述的足以形成胚發生團塊的時間為12-32天。
23.如權利要求1所述的方法，其中所述的包含體細胞胚的胚發生愈傷組織傳代培養於所述基礎培養基以8-12天的間隔進行。
24.如前述任一項權利要求所述的方法，其中將所述的胚發生塊/團塊經受肌醇缺乏8-12天時間，優選為10天。
25.如權利要求1所述的方法，其中用於所述的胚萌發培養基的所述支持物包括蛭石。
全文摘要
本發明公開了一種通過發育同步化的體細胞胚發生在棉花中再生植株的方法。本發明簡單、快速、重現性好並且便於應用於植物遺傳工程中，通過肌醇飢餓步驟實現了同步化的體細胞胚發生。
文檔編號A01H4/00GK1886041SQ200380110957
公開日2006年12月27日 申請日期2003年12月31日 優先權日2003年12月31日
發明者拉克什·圖麗, 米西勒什·庫馬爾 申請人:科學與工業研究委員會