骨折的治療的製作方法

2023-12-12 00:50:02

專利名稱：骨折的治療的製作方法
技術領域：
本發明涉及通過在存在HS-2的情況下的細胞培養所獲得的間充質幹細胞在治療骨折中的使用。
背景技術：
開發防止延緩的和不癒合的骨折的骨再生療法的動力是重要的治療問題，特別是考慮到每年會發生數百萬計骨折，其中至少10%不能自愈。在Brickman 等人，(1998), J. Biol. Chem. 273 (8)，4350-4359 中鑑別並描述了硫酸乙醯肝素2 (，或稱硫酸類肝素，HS-2)，並且它是從胚胎期10天(ElO)的鼠神經上皮中純化的。隨後，發現HS-2在離體培養中促進幹細胞生長，並同時保留了它們的多能性(W02006/085209A1 和 US2009/0148420A1)。·間充質幹細胞(MSC)是多能幹細胞，其能夠分化成結締組織和/或骨細胞，如軟骨細胞、成骨細胞、肌細胞和脂肪細胞。

發明內容
本發明人已發現與通過在對照條件下的培育所獲得的MSC相比，通過在存在HS-2的情況下的細胞培養所獲得的間充質幹細胞(HS-2MSC)在骨生長和再生方面是更優良的。因此，提供了 HS-2MSC在骨折修復中的使用。具體地，與通過在對照條件下的培育所獲得的MSC的使用相比，當使用HS-2MSC時骨折修復得到加強。這種加強包括相對於通過使用在對照條件下的培育所獲得的MSC進行治療所獲得的骨折修復速度，骨折修復速度的改善(或提高)。使用HS-2MSC的骨折治療導致了更快速的骨折修復，這可以包括更快速的骨生長，即新骨生長速度的提高，更快速的骨基質沉積，例如，礦化速率的提高，和/或在骨折修復中所實現的新骨體積的速率的提高。這些作用為減少治癒骨折所需的時間的減少作了準備。照此，在本發明的一些方面，提供了 HS-2MSC以用於與不使用MSC和/或使用在對照條件下培養的MSC的治療相比改善的骨折修復速度的方法中使用。本發明的實施方式具體地涉及通過MSC的使用來治療骨折的骨折修復領域。本發明的優勢包括由改善的骨折修復速度所證明的並且由通過特定類型的MSC (即HS-2MSC)的使用所提供的骨折修復的出乎預料的加強(enhancement)。在本發明的一個方面，提供了通過在存在HS-2的情況下的細胞培養所獲得的間充質幹細胞在製備用於治療骨折的藥物中的使用。在一些實施方式中，所述藥物用於在加強的間充質幹細胞介導的骨折修複方法中使用。加強的間充質幹細胞介導的骨折修復可以包括相對於通過使用通過在不存在HS-2的情況下的培養所獲得的間充質幹細胞的治療所獲得的骨折修復速度，骨折修復速度的改
盡
口 o在本發明的另一個方面，提供了通過在存在HS-2的情況下的培養所獲得的間充質幹細胞在治療骨折的方法中的使用。在本發明的其它方面，提供了包含通過在存在HS-2的情況下的培養所獲得的間充質幹細胞的藥物組合物，其中所述藥物組合物用於在治療骨折的方法中使用。在一些實施方式中，間充質幹細胞或藥物組合物用於在包括加強的間充質幹細胞介導的骨折修復的治療方法中使用。加強的間充質幹細胞介導的骨折修復可以包括相對於通過使用由在不存在HS-2的情況下的培養所獲得的間充質幹細胞的治療所獲得的骨折修復速度，骨折修復速度的改善。在本發明的另一個方面，提供了包含生物材料和由在存在HS-2的情況下的培養所獲得的間充質幹細胞的生物相容性植入物或假體。在一些實施方式中，所述植入物或假體塗覆了通過在存在HS-2的情況下的培養所獲得的間充質幹細胞。在一些實施方式中，所述植入物或假體浸潰了通過在存在HS-2的 情況下的培養所獲得的間充質幹細胞。在本發明的其它方面，提供了形成生物相容性植入物或假體的方法，所述方法包括用通過在存在HS-2的情況下的培養所獲得的間充質幹細胞塗覆或浸潰生物材料的步驟。在本發明的另一個方面，提供了治療受試者中骨折的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的通過在存在HS-2的情況下的培養所獲得的間充質幹細胞。在一些實施方式中，所述方法是加強的間充質幹細胞介導的骨折修複方法，所述方法包括相對於通過使用通過在不存在HS-2的情況下的培養所獲得的間充質幹細胞的治療所獲得的骨折修復速度，骨折修復速度的改善。在一些實施方式中，在施用間充質幹細胞之前，所述方法包括與HS-2接觸培養幹細胞以產生所述治療有效量的間充質幹細胞。在一些實施方式中，所述方法還包括將所述治療有效量的間充質幹細胞配製為藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包含通過在存在HS-2的情況下的培養所獲得的間充質幹細胞和可藥用載體、佐劑或稀釋劑，其中將所述藥物組合物施用給所述受試者。在一些實施方式中，所述方法包括將所述間充質幹細胞或藥物組合物施用至骨折周圍的組織。在一些實施方式中，所述間充質幹細胞或藥物組合物的施用包括將所述間充質幹細胞或藥物組合物注射至骨折周圍的組織。在本發明的其它方面，提供了治療受試者中骨折的方法，所述方法包括通過手術將生物相容性植入物或假體植入到受試者骨折位點處或骨折位點周圍的組織，所述植入物或假體包含生物材料和通過在存在HS-2的情況下的培養所獲得的間充質幹細胞。在一些實施方式中，所述植入物或假體塗覆了通過在存在HS-2的情況下的培養所獲得的間充質幹細胞。在一些實施方式中，所述植入物或假體浸潰了通過在存在HS-2的情況下的培養所獲得的間充質幹細胞。
具體實施例方式HS-2MSC本發明涉及使用HS-2MSC的骨折的治療性治療。在本說明書中，「HS-2MSC」是通過在存在HS-2的情況下的培養所獲得並且可獲得的間充質幹細胞。在W02006/085209A1 和 US 2009/0148420A1 中描述了用於獲得 HS-2MSC 的方法。這些文檔中每一個的全部內容作為參考併入本文。如其中所述，與通過在不存在HS-2的情況下的細胞培養所獲得(例如，如通過在對照條件下的培養所獲得)的間充質幹細胞相比，通過在存在HS-2的情況下的細胞培養所獲得的間充質幹細胞已表現出具有優良的(較好的，superior)幹細胞性能。在一些實施方式中，通過在存在HS-2的情況下培養細胞獲得HS-2MSC的步驟構成了本發明的部分。在一些優選的實施方式中，HS-2MSC是人骨髓細胞系hMSC_HS2，它是根據布達佩斯條約的條款由 Agency for Science, Technology and ResearchA*Star c/o VNSC Laboratory, Institute of Medical Biology, 8ABiomedicalDrive, #0606Immunos, Singapore, SG 138648 於 2009 年 12 月 28 日以保藏編號(登錄號) PTA-10552保存在美國典型培養物保藏中心(或美國模式培養物保藏所，ATCC)的。在本發明的一些實施方式中，用於治療骨折的HS-2MSC可以不包含HS-2，或僅包含微量的HS-2。HS-2MSC是一類獨特的MSC，其特徵在於由在存在HS-2的情況下培養細胞所引起的結構和功能特性的獨特組合。具體地，與在不存在HS-2的情況下培養的幹細胞相比，來自HS-2培養的MSC在相同的時間段或對於相同數目的群體倍增(PD)顯示出顯著的幹細胞性能的保持。這些幹細胞性能可以包括更長的端粒長度、如⑶49a、⑶73、⑶105、⑶90和STR0-1的分子標誌物的連續高水平表達和幹細胞多能特性的維持，例如，分化和形成新組織的能力，和最大程度減少或避免宿主免疫應答的連續能力。得自HS-2中的培養的MSC具有不同於對照培養(物)的獨特遺傳特徵(遺傳信號，genetic signature)並且可以通過基因表達和奇異值分解分析客觀地進行測試。與在對照培養(無HS-2)中培養相同時間長度的幹細胞相比，HS-2中培養的MSC表現出「年輕」得多的遺傳特徵，即，在HS-2中培養的MSC的基因表達譜反映了在對照培養中生長較短(更短的)時間段的細胞的基因表達譜。這與當在HS-2中培養時幹細胞多能性的維持以及在不存在HS-2的情況下培養的MSC中的多能性以及其它幹細胞特性的損失一致。因此，在HS-2中培養的MSC代表了在結構上不同於在不存在HS-2的情況下培養的MSC的一組獨特的MSC。如上所述，HS-2已顯示顯著提高了多能MSC亞群的增殖，該多能MSC具有顯著更長的端粒和以MSC為特徵的細胞表面抗原的更大程度表達。在結構上，與在對照條件中培養的MSC相比，HS-2MSC具有顯著更長的端粒和獨特的基因表達特徵(如通過幹細胞陣列數據的奇異值分解(SVD)所測量的一參見W02006/085209A1和 US 2009/0148420A1)。在存在HS-2的情況下擴增15次群體倍增(PD)的MSC的平均端粒長度比在對照培養基中擴增15次ro的MSC的顯著更長。在長期培養擴增後(45天)，HS-2MSC具有與來自較早代的對照細胞類似的基因表達特徵，這表明HS-2維持了培養擴增的MSC的「乾性」。MSC在HS-2中擴增38和45天後，表面標誌物抗原STR0-1、CD49a和CD105的表達提聞，而⑶73的表達不受影響。基因表達特徵分析(SVD分析)還表明HS-2對MSC的結構影響不是供體特異性的並且通過SVD所產生的基因表達特徵可以用於可靠地比較來自不同供體的細胞。在功能上，HS-2MSC比在對照培養中擴增的MSC更具多能性，並且具有更長的體內壽命期，並且無可檢測的末端酶活性。還已發現HS-2MSC維持了它們的CFU-F (集落形成單位-成纖維細胞)比例，儘管與對照培養相比在相同的培養期內經歷了額外的群體倍增並藉此獲得了多至8倍的可用CFU-F增加。據發現在存在HS-2的情況下培養13或21次H)的MSC具有7%的CFU-F頻率，其 中對MSC的後期培養(carry-on culture)的克隆測定與先前所報導的通過STR0-1分選後MSC富集所獲得的頻率相當，其中這種分選導致CFU-F頻率低於1%，而STRO-Is群體獲得了
9%的頻率。HS-2MSC可以表達CD49a、CD73、CD105、CD90、STR0_l中的一種或多種，並且可以任選地不表達CD45。優選地，HS-2MSC是STRO-Γ氣已發現HS-2MSC表現出穩定的染色體組型。根據上述內容，很顯然通過由在存在HS-2的情況下的細胞培養獲得MSC，所獲得的細胞(HS-2MSC)具有獨特的結構和功能特徵並且代表了確定的一類MSC。本發明涉及HS-2MSC的具體使用，即在骨折治療中的使用。可以通過參考在存在HS-2的情況下的細胞培養持續時間或在存在HS-2的情況下的培養期間MSC的擴增程度或速率來進一步限定HS-2MSC。細胞培養的持續時間可以由細胞培養時間(例如，最少天數)或者由細胞在培養期間所經歷的群體倍增(PD)次數來表示。因此，在一些實施方式中，通過在存在HS-2的情況下將細胞培養至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少12天、至少14天、至少16天、至少18天、至少20天、至少22天、至少24天、至少26天、至少28天、至少30天、至少32天、至少34天、至少36天、至少38天、至少40天、至少42天、至少44天、至少46天、至少48天、至少50天、至少60天、至少70天、至少80天、至少90天或至少100天中的一種來獲得HS-2MSC。在一些實施方式中，通過在存在HS-2的情況下培養小於100天、90天、80天、70天、60天或50天中的一種來獲得HS-2MSC。在存在HS-2的情況下的培養可以最多為7、9、11、13、15、
20、25、30、35、40、45、50或更多天中的任一種。在一些實施方式中，通過在存在HS-2的情況下將細胞培養通過至少5次PD、至少6次H)、至少7次H)、至少8次H)、至少9次H)、至少10次H)、至少12次H)、至少14次H)、至少16次PD、至少18次PD、至少20次PD、至少22次PD、至少24次PD、至少26次H)、至少28次PD、至少30次PD、至少32次PD、至少34次PD、至少36次PD、至少38次PD、至少40次PD、至少42次PD、至少44次PD、至少46次PD、至少48次PD、至少50次PD、至少60次PD、至少70次PD、至少80次H)、至少90次H)或至少100次H)來獲得HS-2MSC。在一些實施方式中，通過在存在HS-2的情況下培養小於100次Η)、90次Η)、80次PD、70次H)、60次ro、50次ro、4o次ro、30次ro或20次ro中的一種來獲得hs-2msc。在一些實施方式中，培養或組合物中至少3%的細胞是集落形成單位(CFU)，更優選地，至少4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%中的一種。這可以在培養結束時或者在選自以上列表的天數或群體倍增次數之後進行測定。CFU百分比提供了細胞培養中幹細胞比例的量度。MSC的擴增是指通過細胞分裂所實現的培養中MSC群體的增加。可以通過培養中幹細胞群體的加倍來量化(測量)擴增，並且可以將群體倍增速率用作幹細胞擴增速率的量度。在一些實施方式中，通過在存在HS-2的情況下的細胞培養從而使得群體倍增速率在約0. 5次PD/天至約I. 2次PD/天、約0. 6至約0. 9次PD/天或約0. 6至0. 8次PD/天中的一種的範圍內來獲得HS-2MSC。在將HS-2加入至培養基後的I至10天之間，群體倍增速率可以在約0. 6至約0. 8次PD/天之間。在一些實施方式中，通過在存在HS-2的情況下將細胞培養足夠的時間以將單個MSC擴增至多於1\103個幹細胞的群體來獲得肥-21^(。培養開始可以含有多於一個MSC。在該情況下，總擴增的MSC群體等於多個MSC以多於I X IO3倍的擴增。更優選地，擴增程度可以是以下之一 5X IO3UX 10\5X IO4UX IO5,5X IO5UX IO6,5X IO6UX IO7,5X IO7,IX 108、5X 108、1X IO9或5X 109。擴增MSC的培養時間可以在5至50天之間，更優選地在 10至45天之間，並且更優選地小於45天、40天、35天、30天、25天、20天或15天中的一種。在一些實施方式中，通過在存在HS-2的情況下將細胞培養足夠的時間以將MSC培養從至少約2000個細胞/cm2培養空間(例如，培養皿或塑料製品的培養空間)的初始培養尺寸擴增至含有增加至少I X IO3倍的MSC (即至少約2 X IO6個MSC)的擴增培養尺寸來獲得HS-2MSC。初始培養尺寸可以是以下之一至少約3000個細胞/cm2、約3500個細胞/cm2、至少約4000個細胞/cm2、約4500個細胞/cm2、5000個細胞/cm2，並且擴增培養尺寸可以是以下之一至少約3 X IO6個細胞/cm2、約3. 5 X IO6個細胞/cm2、至少約4X IO6個細胞/cm2、約4. 5X106個細胞/cm2、5X106個細胞/cm2。初始培養可以具有小於以下之一 6000、5000、4000,3000或2000個細胞/cm2。擴增培養可以具有大於以下之一 5X 103、I X 104、5X 104、lX105、5X105、lX106、5X106、lX107、5X107、lX108、5X108、lX109*5X109fMSC。在初始培養尺寸和擴增培養尺寸之間擴增的培養時間優選地在約10至50天之間，更優選地在約15至30天之間。它可以小於以下之一 50、45、40、35、30、25、20或15天。可以應用如上所述的方法以將MSC培養擴增至I X IO4、I X 105、I X IO6、I X 107、I X 108、IXlO9個細胞或更大的擴增培養尺寸。在一些實施方式中，通過在存在HS-2的情況下將細胞培養足夠的時間以將MSC的培養從MSC的初始個數擴增至MSC的擴增個數來獲得HS-2MSC，其中所述擴增個數為初始個數的至少100倍，優選地至少1000倍，並且其中將培養在初始個數和擴增個數之間擴增的時間為小於30天，更優選地為小於以下之一 :28、26、24、22、20、18、16、15、14、13、12、11、
10、9、8、7、6 或 5 天。在存在HS-2的情況下的細胞培養方法可以包括僅處於線性(對數)生長期的細胞的培養，僅處於匯合後生長的細胞的培養，或者可以包括在線性期和匯合後期延續的生長。在存在HS-2的情況下的細胞培養方法還可以包括細胞傳代。在存在HS-2的情況下的細胞培養優選地在生理學溫度下進行。在一些實施方式中，用於細胞培養的細胞可以包括能夠導致產生MSC的細胞，例如，多潛能(pluripotent)或多能(multipotent)幹細胞,如胚胎幹細胞或誘導的多潛能幹細胞。在其它實施方式中，用於細胞培養的細胞可以包括間充質幹細胞。培養還可以包含其它細胞，例如，所收集的幹細胞來源的組織中與幹細胞有關的非幹細胞和/或支持細胞，例如，飼養細胞。用於起始幹細胞培養的細胞將優選地含有高比例的各自的幹細胞，例如，至少60%的幹細胞，更優選地，至少70%的幹細胞、80%的幹細胞、90%的幹細胞、95%的幹細胞、96%的幹細胞、97%的幹細胞、98%的幹細胞、99%的幹細胞或者100%的幹細胞中的一種。可以在開始細胞培養之前富集(例如，通過富集如STRO-I或STR0-1亮的標誌物)細胞，例如，從先前的細胞培養或從活的動物或人中收集的細胞。可以通過細胞分選(例如，FACS)來實施標誌物富集。本文所述的HS-2MSC和為了獲得HS-2MSC在存在HS-2的情況下培養的細胞可以是來自任何動物類型的細胞。優選地，它們是哺乳動物。在一些實施方式中，它們是人。在其它實施方式中，它們來自於非人哺乳動物。所述非人哺乳動物可以是家養寵物，或者是以商業目的飼養的動物，例如，比賽用馬或家畜，如豬、羊或牛。非人哺乳動物包括兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它齧齒動物(包括齧齒目(Ro d e n t i a )中的任何動物)、貓、狗、豬、羊、山羊、牛(包括母牛，例如，乳牛或牛目(Bos)中的任何動物)、馬(包括馬目(Equidae)中的任何動物)、驢和非人靈長類。為了獲得HS-2MSC在存在HS-2的情況下培養的細胞開始不必須是MSC。它們可以是在培養期間誘導分化為MSC的多能或多潛能幹細胞。如上所述的培養方法優選地在體外進行。術語「體外」旨在涵蓋使用培養中的細胞的實驗，而術語「體內」旨在涵蓋使用完整多細胞生物的實驗。在一些實施方式中，提供了包含通過任何所述方法產生的HS-2MSC的藥物組合物。所述藥物組合物在醫療方法中是有用的。適合的藥物組合物還可以包含可藥用載體、佐劑或稀釋劑。所述藥物組合物可以包括支架或基質材料，其具有植入或吸附至所述材料的細胞。這種組合物可以提供可植入裝置或假體的基礎，所述可植入裝置或假體可以通過手術植入到需要治療的患者中。在本說明書中，在存在HS-2的情況下的細胞培養是指在其中所培養的細胞能夠接觸到HS-2的條件下的細胞培養。在優選的實施方式中，這包括在含有HS-2的培養基中培養細胞。所述培養基可以是流體，例如液體或凝膠，並且除正常營養物、生長因子和基質 材料外還可以含有HS-2。HS-2優選地將以非微量存在。例如，培養基中HS-2的濃度可以在約I. Ong/ml培養基至約1000ng/ml培養基之間的範圍內。更優選地，培養基中HS-2的濃度可以在約5ng/ml培養基至200ng/ml培養基之間，或者在約20ng/ml培養基至170ng/ml培養基之間。從在存在HS-2的情況下的培養中所獲得的細胞的性能可以與從在對照條件下的培養中所獲得的相同類型的細胞相比。「對照條件」或者「對照培養」是指在其中所培養的細胞不接觸HS-2 (優選地，非微量的HS-2)的條件下的細胞培養。照此，對照條件可以包括在含有正常營養物、生長因子和基質材料但不含HS-2的培養基中的培養。用於MSC培養的對照培養基的實例包括無血清培養基，如MeseilCult -ACF培養基(STEMCELLTechnologies, Vancouver, Canada)或基礎培養基,如用於人間充質幹細胞的MesenCult MSC基礎培養基(STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada)。用於細胞培養的示例性維持培養基可以包含DMEM、1000mg/l葡萄糖，其中補充了10%胎牛血清(FBS)並具有O. 1%的青黴素/鏈黴素和2mML-穀氨醯胺，其在加溼的5%C02培育箱中在37°C下培育。可以以三天的間隔更換培養基並且細胞每4-5天(約80%匯合)進行繼代培養(subculture )。量近本發明涉及HS-2MSC治療骨折的治療性使用(人和獸醫)。據本發明所報導，HS-2MSC增強了骨中傷口的癒合。HS-2MSC刺激創傷後的骨再生並且有助於骨中傷口癒合的改善。HS-2MSC提供了骨折修復速度的提高(改善)，從而使得能夠縮短創傷恢復的時間。骨折是一種醫學病況。在本發明申請中，「骨折」包括其中骨開裂、斷裂或碎裂的骨損傷或創傷。斷裂是指骨中的不連續。骨折可以由物理衝擊或機械應力或者由如骨質疏鬆症或骨關節炎的醫學病況所造成。骨折的整形外科分類包括閉合或開放以及單純或多段骨折。在閉合性骨折中，皮膚保持完整，而在開放性骨折中，骨可以通過傷口位點暴露，這使得感染的風險更高。單純骨折沿一條線發生，往往將骨分為兩段。多段骨折將骨分成多塊。 其它骨折類型包括壓縮骨折、嵌插骨折、扭轉骨折、完全和不完全骨折、橫骨折、線形骨折和斜形骨折以及粉碎性骨折。在大部分受試者中，自然發生骨癒合(骨折癒合)並且是在創傷後開始的。出血通常導致凝塊並吸引白血球和成纖維細胞，然而產生膠原纖維。隨後，骨基質(羥基磷灰石鈣)沉積(礦化作用)，從而將膠原基質轉化為骨。未成熟的再生骨通常比成熟骨脆弱，並且未成熟骨隨時間經歷重建過程以產生成熟的「多層」骨。骨完全癒合的過程通過需要相當長的時間，通常為數月。其中發生骨折並且可能受益於使用HS-2MSC的治療的骨包括所有骨類型，具體地，所有哺乳動物的骨，其包括(但不限於)長骨(例如，股骨、肱骨、指骨)、短骨(例如，腕骨、跗骨)、扁骨(例如，頭蓋骨、肋骨、肩胛骨、胸骨、骨盆帶)、不規則骨(例如，椎骨)、籽骨(例如，膝蓋骨)。骨折還包括病理性疏鬆，如骨質疏鬆症受試者所表現出的。提供了 HS-2MSC以及包含HS-2MSC的藥物組合物和藥物在哺乳動物受試者的骨折治療方法中的使用。治療可以包括骨中的傷口癒合。治療可以包括骨的修復、再生和生長。HS-2MSC通過促進新骨生長促進了骨折修復。HS-2MSC起作用以改善骨折修復的速度，從而使得能夠發生更快速的骨癒合，導致創傷恢復的時間得到改善。治療可以導致骨強度得到改善。治療還可以包括骨質疏鬆症或骨關節炎的治療。優選地，將HS-2MSC施用到骨折周圍的組織。這可以包括直接施用到其中已發生骨折的骨組織。可以施用到骨或骨折周圍的結締組織或施用到靠近骨並向骨供血的脈管系統(例如，血管)。可以直接施用到創傷位點，並且可以施用到由傷口初始癒合所形成的骨痂組織。藥物和藥物組合物可以配製根據本發明的藥物和藥物組合物以用於通過多種途徑施用。可以將HS-2MSC配製成用於注射的流體或液體形式，或者配製為適合於應用至骨或骨折周圍的其它組織的凝膠的一部分。優選地，以「治療有效量」施用，與相應未治療的骨折或者與使用從對照條件下的培養所獲得的MSC治療的骨折相比，這足以改善骨折的癒合。所施用的實際量以及施用速率和時間過程將取決於骨折的性質和嚴重程度。治療處方(例如，劑量決策等)在全科醫生及其他醫生的職責範圍內，並且通常將考慮骨折的性質、個體患者情況、遞送位點、施用方法以及醫師已知的其它因素。可以根據處方執業醫生的指導施用單次或多次HS-2MSC劑量。純粹通過舉例說明，可以以約75 X IO6至約100 X IO6個細胞的劑量遞送HS-2MSC，例如，至少50 X IO6個細胞，至少60 X IO6個細胞和至少70 X IO6個細胞中的一種。上述技術和規程的實例可見於雷明頓藥物科學(Remington' s Pharmaceutical Sciences),第20版，2000，pub.Lippincott，Williams & Wilkins。HS-2MSC可以與其它治療一起用於治療骨折，所述其它治療如鎮痛或抗炎藥物的施用、骨固定和正骨(例如，在管型石膏夾中固定受傷的肢)、外科手術(例如，接合骨或移動骨以糾正移位、彎曲或脫臼)。如果需要手術，可以在手術程序期間將HS-2MSC直接施用到(例如，應用於)骨折處。本發明的藥物組合物和藥物可以採取塗覆和/或浸潰有HS-2MSC的生物材料的形式。植入物或假體可以由所述生物材料形成。這些植入物或假體可以通過手術植入以輔助
骨生長、再生、重構和/或重建。HS-2MSC可以應用於植入物或假體以加快所需位置處的新骨形成。所述生物材料可以塗覆或浸潰HS-2MSC。浸潰可以包括將HS-2MSC與生物材料接觸從而允許將它們吸收和/或吸收到所述生物材料上和/或吸收到所述生物材料中。塗覆可以包括將HS-2MSC吸附到生物材料的表面上。生物材料的塗覆或浸潰可以包括將HS-2MSC接種到生物材料上或生物材料中。當施用到或植入到受試者中時，生物材料應允許所塗覆或浸潰的HS-2MSC從所述生物材料中釋放。可以通過改變生物材料的結構(例如，孔隙度)來改變生物材料的釋放動力學。除了用HS-2MSC塗覆或浸潰生物材料外，還可以將一種或多種生物活性分子浸潰或塗覆到生物材料上。例如，至少一種選自HS-2、BMP-2、BMP-4、OP-U FGF-U FGF-2、TGF-P I、TGF-^ 2, TGF-P 3、VEGF、膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白、玻連蛋白。除了上述生物活性分子或者作為上述生物活性分子的替代，可以將一種或多種二膦酸酯與HS-2MSC —起浸潰或塗覆到生物材料上。有用的二膦酸酯的實例可以包括選自羥乙二磷酸酯；氯屈膦酸酯；胺丁羥磷酸酯；帕米膦酸酯；利塞膦酸酯；唑來膦酸酯中的至少一種。任選地，不將HS-2浸潰或塗覆到生物材料上。塗覆或浸潰了 HS-2MSC的生物材料可以在醫學或獸醫中均是有用的。將理解本發明可以改善患者的生活質量或潛在地延長動物的壽命，例如，用於配種的重要比賽用馬。生物材料提供了支架或基質載體。生物材料可以適合於組織中的植入或者可以適合於施用(例如，作為溶液中的微膠囊)。植入物或假體應是生物相容性的，例如，無毒並且低免疫原性的(最優選地，無免疫原性的)。生物材料可以是生物可降解的，從而隨著傷口癒合的發生，生物材料降解，從而最終僅在受試者中原位留下再生骨。作為另外一種選擇，可以使用非生物可降解的生物材料(例如)以在較大的斷裂處引導骨再生和/或用作骨癒合期間的結構支撐，並且在傷口成功癒合後，手術除去生物材料是可選的要求。
生物材料可以是軟的和/或柔性的，例如，水凝膠、纖維蛋白網或網狀物或者膠原海綿。「水凝膠」是在有機聚合物(可以是天然的或合成的)凝固或固化以產生捕獲水或其它溶液分子從而形成凝膠的立體開放柵格結構時所形成的物質。可以通過聚集、凝聚、疏水性相互作用或交聯發生固化。作為另外一種選擇，生物材料可以是相對剛性的結構，例如，通過如塑料或生物惰性金屬(如鈦)的固體材料形成。生物材料可以具有多孔基質結構，其可以通過交聯聚合物提供。優選地，該基質對骨生長所需的營養物和生長因子是可透過的。基質結構可以通過使用適合的交聯劑(例如，鈣鹽、聚丙烯酸、肝素)使纖維交聯來形成，例如，纖維蛋白或膠原，或者海藻酸鈉、殼聚糖或其它多糖的液膜。可替代地(作為另外一種選擇)，可以形成作為凝膠的支架，其通過膠原或海藻酸鹽製備並使用本領域技術人 員所知的已建立的方法交聯。用於基質形成的適合的聚合物材料包括(但不限於)生物可降解/生物可吸收的聚合物，其可以選自瓊脂糖、膠原、纖維蛋白、殼聚糖、聚己酸內酯、聚(DL-丙交酯-共聚-己內酯)、聚(L-丙交酯-共聚-己內酯-共聚-乙交酯)、聚乙交酯、聚交酯、聚羥基脂肪酸酯、它們的共聚物，或者非生物可降解的聚合物，其可以選自醋酸纖維素；丁酸纖維素、海藻酸鹽、聚碸、聚氨脂、聚丙烯腈、磺化聚碸、聚醯胺、聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯、它們的共聚物。由於其生物相容性和支持細胞附著和功能的有利性質，膠原是基質構建的優良材料(美國專利 No. 5019087 ；Tanaka, S. ; Takigawa, T. ; Ichihara, S. & Nakamura, T.Mechanical properties of the bioabsorbable polyglycolicacid-collagen nerveguide tube Polymer Engineering & Science 2006，46，1461-1467)。臨床可用的膠原海綿是基質的一個實例並且在本領域中是熟知的(例如，來自Integra Life Sciences的膠原海綿)。纖維蛋白支架(例如，纖維蛋白膠)提供了替代性基質材料。作為傷口密封齊U、遞送生長因子的儲器以及作為放置和固定生物植入物的輔助物，纖維蛋白膠得到了廣泛的臨床應用(Rajesh Vasita, Dhirendra S Katti. Growth factor deliverysystems for tissue engineering:a materials perspective.Expert Reviews inMedical Devices. 2006; 3 (I) : 29-47 ；Wong C，Inman. E，Spaethe R. Helgerson S. Thromb.Haemost. 2003. 89(3):573-582 ;Pandit AS，Wilson DJj Feldman DS.Fibrin scaffoldas an effective vehicle for the delivery of acidic growth factor (FGF-I).J.Biomaterials Applications. 2000;14(3) :229-242 ；DeBlois Cote MF.DoillonCJ. Heparin-fibroblast growth factor fibrin complex: in vitro and in vivoapplications to collagen based materials. Biomaterials· 1994;15(9):665-672)。Luong-Van 等人(In vitro biocompatibility and bioactivity ofmicroencapsulated heparan sulphate Biomaterials 28 (2007) 2127-2136)說明了來自聚己內酯微膠囊的HS的延長定位遞送，該文獻作為參考併入本文。生物材料的另一個實例是摻入羥基磷灰石或透明質酸的聚合物。生物材料可以補充其它細胞。例如，可以用成纖維細胞來源的飼養細胞「接種」生物材料(或共同合成該生物材料)，所述飼養細胞對於支持HS-2MSC的生長和維持可以是有用的。待治療的受試者可以是任何動物或人。所述受試者優選地為哺乳動物。在一些實施方式中，所述受試者是人。在其它實施方式中，所述受試者是動物，更優選地，是非人哺乳動物。所述非人哺乳動物可以是家養寵物，或者是以商業目的飼養的動物，例如，比賽用馬或家畜，如豬、羊或牛。照此，本發明可以具有獸醫應用。非人哺乳動物包括兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它哨齒動物(包括哨齒目(Rodentia)中的任何動物)、貓、狗、豬、羊、山羊、牛(包括母牛或牛目(Bos)中的任何動物)、馬(包括馬目(Equidae)中的任何動物)、驢和非人靈長類。所述受試者可以是雄性或雌性。所述受試者可以是患者。硫酸乙醯肝素和HS-2硫酸乙醯肝素蛋白聚糖(HSPG)代表蛋白聚糖的高度多樣化亞組，並且它們是由共價連接至蛋白質主鏈的硫酸乙醯肝素糖胺聚糖側鏈組成的。核心蛋白質可以以三種形式存 在稱為基底膜蛋白聚糖的分泌形式、稱為磷脂醯肌醇蛋白聚糖的錨定在質膜上的形式以及稱為多配體(蛋白)聚糖的跨膜形式。它們是哺乳動物細胞表面和大多數細胞外基質的普遍組成。「硫酸乙醯肝素」(「硫酸類肝素」或「HS」)最初在高爾基體中合成為由D-葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙醯-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)的串聯重複所組成的多糖。隨後，可以通過一系列步驟對初生多糖進行修飾GlcNAc的N-脫乙醯化/N-硫酸化,GlcA向艾杜糖醒酸(IdoA)的C5差向異構化，IdoA和GlcA在C2處的O-硫酸化，N-硫酸氨基葡萄糖(GlcNS)在C6處的O-硫酸化和GlcNS在C3處的偶然O-硫酸化。HS的N-脫乙醯化/N-硫酸化、2_0_、6-0-和3-0-硫酸化分別是通過HS N-脫乙醯基酶/N-磺基轉移酶(HSNDST)、HS 2-0-磺基轉移酶(HS2ST)、HS 6-0-磺基轉移酶(HS6ST)和HS 3_0_磺基轉移酶的特異性作用所介導的。在每個修飾步驟中，僅修飾了一部分潛在的底物，從而導致產生了相當大的序列多樣性。HS的這種結構複雜性使得難以確定它的序列並且難以了解HS結構與功能之間的關係。硫酸乙醯肝素側鏈是由通過(1->4 )糖苷鍵連接的交替排列的D-葡萄糖醛酸或者L-艾杜糖醛酸和D-氨基葡萄糖所組成的。氨基葡萄糖通常是N-乙醯化的或N-硫酸化的，並且糖醛酸和氨基葡萄糖均可以另外被O-硫酸化。特定HSPG對特定結合配體的特異性是由連接到氨基葡萄糖和糖醛酸上的羧基、乙醯基和硫酸酯基的特定類型所產生的。與肝素相比，硫酸乙醯肝素含有較少的N-和O-硫酸酯基和較多的N-乙醯基。硫酸乙醯肝素側鏈通過四糖鍵(_葡萄糖醛酸基-β - (1->3)-半乳糖基-β - (1->3)-半乳糖基-β - (1->4)-木糖基-β -1-0-(絲氨酸))區連接到核心蛋白的絲氨酸殘基。硫酸乙醯肝素鏈和核心蛋白均可以進行最終可以影響它們生物活性的一系列修飾。已認為HS的複雜性超過了核酸的複雜性(Lindahl等人，1998，J. Biol.Chem. 273, 24979 ；Sugahara 和 Kitagawa, 2000, Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 518)。HS 種類的變化是由被含有N-乙醯化氨基葡萄糖的二糖的未硫酸化區所分開的糖殘基的非隨機、高度硫酸化序列的合成所引起的。N-乙醯氨基葡萄糖向N-硫酸氨基葡萄糖的最初轉化產生了對其它修飾的關注，包括葡萄糖醛酸向艾杜糖醛酸的差向異構化和氨基葡萄糖或艾杜糖醛酸上O-硫酸化的複雜類型。另外，在未修飾、低硫酸化的N-乙醯化序列中，己糖醛酸酯殘基仍保持為葡萄糖醛酸酯，而在高度硫酸化的N-硫酸化區域中，以C-5差向異構體艾杜糖醛酸酯為主。這限制了任意給定鏈中可能的潛在二糖變體的數目，但是未限制每種變體的豐度。大部分修飾發生在N-硫酸化區域中，或直接與它們相鄰，從而在成熟鏈中存在被低硫酸化域分開的高硫酸化區(Brickman 等人，(1998)，J. Biol. Chem. 273 (8)，4350-4359，該文獻以其全部內容作為參考併入本文)。假設高度可變的硫酸乙醯肝素鏈通過自分泌、鄰分泌和旁分泌反饋環的複雜組合在調節多種細胞外配基的作用中起關鍵作用，其包括生長和粘附因子的調控及其向細胞的呈遞，從而控制胞內信號並藉此控制幹細胞的分化。例如，儘管可能在遺傳學上說明了硫酸乙酸肝素糖胺聚糖(Alberts 等人，(1989) Garland Publishing, Inc, New York & London,第804和805頁)，但是從單一來源分離的硫酸乙醯肝素糖胺聚糖種類在生物活性上可能是不同的。如在Brickman等人，1998，Glycobiology 8，463中所示,根據促有絲分裂的狀態，得自神經上皮細胞的兩種單獨的硫酸乙醯肝素糖胺聚糖混合物可以特異地激活FGF-I或FGF-2中的一種。類似地，在W096/23003中說明了硫酸乙醯肝素(HS)與FGF-I或FGF-2中的一種相互作用的能力。根據本專利申請，在胚胎期約11至約13天從鼠細胞中獲得了能夠與FGF-I相互作用的各個HS，而在胚胎期約8至約10天獲得了能夠與FGF-2相互作用的HS。如上所述，HS的結構是高度複雜的並且在HS之間是可變的。的確，認為HS結構的變化在有助於每種HS在促進細胞生長和指導細胞分化中的不同活性中起到重要作用。認為這種結構複雜性超過了核酸的結構複雜性，並且儘管可以將HS結構的特徵描述為具有特異和獨特硫酸化類型的重複二糖單元的序列，但是目前尚沒有與對核酸測序可用的那些技術相當的標準測序技術以用於確定HS序列結構。在不存在用於確定明確HS序列結構的簡單方法的情況下，本領域的熟練技術人員通過多種分析技術明確地鑑別了並在結構上表徵了 HS分子。這些技術包括二糖分析、四糖分析、HPLC和分子量確定法中的一種或組合。這些分析技術是本領域技術人員所熟知和使用的。從HS產生二糖和四糖的兩種技術包括亞硝酸消化和裂合酶消化。純粹通過舉例說明，以下提供了實施這些消化技術的一種方法的說明，該說明未限制本發明的範圍。亞硝酸消化基於亞硝酸的硫酸乙醯肝素的解聚在完成時導致碳水化合物鏈最終降解為其各個二糖組分。 例如，可以通過分別在冰上將250 ill 0. 5皿的H2SOjPO. 5M的Ba (NO2) 2冷卻15分鐘來製備亞硝酸。冷卻後，將Ba(NO2)2與H2S04混合併在用於除去硫酸鋇沉澱的離心前渦流混合。將125 ill HNO2加入到懸浮於20 ill H2O中的GAG樣品中並且渦流混合，然後在不時混合的情況下在25°C培育15分鐘。培育後，將IM Na2CO3加入到樣品中使其pH值為
6。接著，將100 ill 0. 25M的NaBH4在0. IM NaOH中的溶液加入到樣品中並將混合物加熱至50°C，保持20分鐘。然後，將混合物冷卻至25°C並加入酸化的冰醋酸使樣品的pH值為3。然後，用IOM NaOH中和混合物並通過冷凍乾燥縮小體積。將最終樣品在Bio-Gel P-2柱上運行以分離二糖和四糖從而驗證降解程度。裂合酶消化肝素酶III在葡萄糖醛酸鍵處切割糖鏈。一系列肝素酶(I、II和III)分別通過在特定硫酸化識別位點使某些硫酸乙醯肝素序列解聚而顯示出相對特異的活性。肝素酶I沿HS鏈切割具有NS區的HS鏈。這導致硫酸化域的破壞。肝素酶III使具有NA域的HS解聚，從而導致碳水化合物鏈分解成各個硫酸化域。肝素酶II主要切割其中存在不同硫酸化類型的HS鏈的NA/NS 「肩」域。注乙醯肝素聚合物的重複二糖主鏈為連接到氨基糖氨基葡萄糖上的糖醛酸。「NS」表示氨基糖，其在氨基上帶有硫酸酯，從而能夠使C2、C6和C3處的其它基團硫酸化。「NA」表示氨基未被硫酸化並且仍保持乙醯化。例如，對於使用肝素酶III在NA區中的解聚，在含有20mM Tris-HCl、O. lmg/mlBSA和4mM CaCl2的緩衝液(pH 7. 5)中製備了酶和凍幹HS樣品。純粹通過舉例說明，可以將肝素酶III以5mU/l μ gHS加入並且在37°C培育16h，然後通過加熱至70°C，保持5分鐘使反應停止。二糖和四糖可以通過柱色譜洗脫。在本發明中用於獲得HS-2MSC的硫酸乙醯肝素是硫酸乙醯肝素2 (HS_2)。HS-2命名了 HSPG的糖鏈，並且已發現其對FGF-2具有親合力。HS-2具有約25kDa的分子量，並且因此假設每個二糖的平均分子量為400Da，那麼HS-2由約60個二糖組成。在Brickman等人(Glycobiology，第8卷，第5期，第463-471頁，1998)中說明了 HS-2的二糖組成， 該參考文獻以其全部內容作為參考併入本文。「硫酸乙醯肝素 2」 或 「HS-2」 表示 fcickman 等人((1998)，J. Biol.Chem. 273(8)，4350-4359)所描述的硫酸乙醯肝素並且它來源於(並且可得自)胚胎神經上皮，優選地哺乳動物的胚胎神經上皮，更優選地鼠胚胎神經上皮，並且它優選地能夠與FGF-2相互作用。因此，如(上述)Brickman所述，該硫酸乙醯肝素2可得自胚胎期10天的鼠細胞的乙醯肝素蛋白聚糖。在本發明申請的實驗部分中使用的HS-2來源於胚胎小鼠，並且已發現它對小鼠、人、大鼠、雞、異爪蛙和果蠅細胞特別有效。根據這些結果，在本發明中考慮了任何高等生物(例如，昆蟲或脊椎動物，如哺乳動物、鳥、爬行動物或魚)中的普遍機制。因此，在本發明中涵蓋了任何硫酸乙醯肝素2和能夠與FGF-2相互作用並且能夠促進或有利於幹細胞離體(體外)增殖和/或維持的任何相應的硫酸乙醯肝素蛋白聚糖，其包括該硫酸乙醯肝素蛋白聚糖和有待於從特定物種分離的硫酸乙醯肝素2。對所分離的硫酸乙醯肝素或硫酸乙醯肝素蛋白聚糖的功能性的分離和確定是本領域技術人員的知識範圍內所熟知的並且可以如(例如)Brickman 等人，(1998)，J. Biol. Chem. 273 (8)，4350-4359 中所述的實施。HS-2可以得自胚胎期第10天(ElO)的小鼠神經上皮。圖9中顯示了多種處理後HS-2的分子量，所述處理包括鏈黴蛋白酶處理以除去任何相關蛋白組分、弱鹼和肝素酶。可以通過分析對使用低pH值ΗΝ02、乙醯肝素酶(heparitinase)或乙醯肝素酶(heparanase)的處理敏感的化學鍵(linkage)的百分比來進一步表徵HS-2。在圖10中顯示了結果。圖11中顯示了亞硝酸消化後HS-2的二糖組成。圖12中顯示了亞硝酸消化後HS-2的四糖組成。圖13中顯示了用肝素裂合酶混合物處理後HS-2的二糖組成。圖14中顯示了圖13中所示的二糖的硫酸化特徵。在本發明申請的其它地方描述了用於確定對使用低PH值ΗΝ02、乙醯肝素酶(heparitinase)或乙醯肝素酶(heparanase)的敏感處理；亞硝酸消化和肝素裂合酶消化敏感的化學鍵的百分比的方法。在本說明書中，對HS-2的引用包括得自胚胎期10天(ElO)的哺乳動物(優選地，小鼠)神經上皮的HS。對HS-2的引用還可以包括具有與Brickman等人在Glycobiology,第8卷，第5期，第463-471頁，1998中所述的HS-2基本相似的結構和/或功能的HS。與Brickman等人的HS-2基本相似的HS可以包括HS，其具有(0分子量,其比圖9中對於相應處理所示的分子量大或小不超過10%,更優選地，不超過5% ;和/或(ii)對低pH值亞硝酸、乙醯肝素酶(heparitinase)或乙醯肝素酶(heparanase)處理敏感的化學鍵的百分比，其比圖10中對於相應處理所示的百分比大或小不超過10%，更優選地，不超過5% ;和/或(iii)亞硝酸消化二糖組成，其中存在對應於圖11中所示那些的每種二糖並且每種二糖的百分比組成比圖11中所示的百分比組成大或小不超過20%，更優選地，不超過15%、10%、5%、3%、2% 或 1% ;和 / 或(iv)亞硝酸消化四糖組成，其中存在對應於圖12中所示那些的每種四糖並且每 種四糖的百分比組成比圖12中所示的百分比組成大或小不超過20%，更優選地，不超過15%、10%、5%、3%、2% 或 1% ;和 / 或(V)肝素裂合酶二糖組成，其中存在對應於圖13中所示那些的每種二糖並且每種二糖的百分比組成比圖13中所示的百分比組成大或小不超過20%，更優選地，不超過15%、10% 或 5% O幹細朐術語「幹細胞」一般是指分裂時面臨兩種發育選擇的細胞子細胞可以與原始細胞相同(自我更§ )或者它們可以是更特化的細胞類型的祖代(分化)。因此，幹細胞能夠採取一種或其它途徑(存在其中可以形成每種細胞類型之一的其它途徑)。因此，幹細胞是非終末分化的並且能夠產生其它類型細胞的細胞。可以從囊胚泡的內細胞團(ICM)中分離胚胎幹細胞(ESC)，囊胚泡是植入發生時胚胎發育的一個階段。多潛能幹細胞是真正的幹細胞，其具有在體內產生任何分化細胞的潛能。然而，它們不能有助於產生來源於滋養層的胚外膜。已發現了幾種類型的多潛能幹細胞。多能幹細胞是真正的幹細胞，但是只可以分化為有限的類型。例如，骨髓含有導致產生所有血液細胞但是不能產生其它類型細胞的多能幹細胞。多能幹細胞存在於成年動物中。據認為體內每種器官均含有它們，從而在這些器官中它們可以替代死細胞或受損細胞。鑑定幹細胞的方法在本領域中是已知的並且包括標準測定方法的使用，如克隆測定、流式細胞術、長期培養和分子生物學技術，例如，PCR、RT-PCR和DNA印記。成熟幹細胞包括多種類型，其包括形成神經元、皮膚和血液的幹細胞，它們是骨髓移植中的活性成分。後面的這些幹細胞類型(成熟幹細胞)也是臍帶來源的幹細胞的主要代表。成熟幹細胞可以在實驗室中和在體內成熟為功能性、更特化的細胞類型，儘管細胞類型的確切數目受所選擇的幹細胞類型所限制。誘導的多潛能幹細胞，通常縮寫為iPS細胞或iPSC，是通過插入某些基因人工來源於非多潛能細胞(通常為成熟體細胞)的一類多潛能幹細胞。在Takahashi, K. &Yamanaka(2006), Yamanaka S 等人(2007), Wernig M 等人(2007), Maherali N 等人(2007), Yu J 等人(2007)和Takahashi等人(2007)中對iPS細胞進行了綜述和討論，所有這些文獻作為參考併入本文。通常通過將某些幹細胞相關基因轉染到非多潛能細胞(如成熟成纖維細胞)中獲得了 iPS細胞。通常通過病毒載體實現轉染，例如，通過反轉錄病毒重編程。轉染的基因包括主轉錄調節子0ct-3/4 (Pouf51)和Sox2，儘管已表明其它基因提高了誘導效率。3_4周後，少量轉染的細胞開始在形態和生物化學方面變得與多潛能幹細胞類似，並且通常通過形態選擇、倍增時間或通過報導基因和抗生素感染進行分離。可以通過使用一種或多種轉錄因子的轉染從體細胞(如成纖維細胞)誘導IPSC。在一些情況下，使用0ct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4轉化細胞。可以另外用包括轉錄因子和/或標誌物基因的其它基因轉染細胞。可以使用如Cre/loxP重組系統的轉座子系統來引入基因，或者可以使用非整合載體來引入基因以產生無外源重編程基因的iPSC。可以使用病毒載體(如反轉錄病毒)實現轉染。所述病毒可以是兼向性病毒。一旦細胞被轉染，則它們可以在轉移到ESC培養基前在飼養細胞上生長。
iPS細胞可以來源於任何適合的細胞類型，其包括肺、包皮成纖維細胞、皮膚成纖維細胞、角化細胞、血液祖細胞、骨髓細胞、肝細胞、胃上皮細胞、胰腺細胞、神經幹細胞、B淋巴細胞、ES來源的體細胞和胚胎成纖維細胞。在一些情況下，所述細胞不是人真皮成纖維細胞。IPSC可以表現出與ESC類似的基因表達模式和表型。誘導的多潛能幹細胞的來源現在，已提供了用於分離多潛能幹細胞但不導致胚胎破壞的幾種方法，例如，通過轉化(誘導)成熟體細胞或生殖細胞。這些方法包括I、通過核移植重編程。該技術包括將核從體細胞轉移到卵母細胞或接合子中。在一些情況下，這可以導致產生動物-人雜交細胞。例如，可以通過人體細胞與動物卵母細胞或接合子的融合或者人卵母細胞或接合子與動物體細胞的融合來產生細胞。2、通過與胚胎幹細胞融合重編程。該技術包括體細胞與胚胎幹細胞的融合。該技術還可以導致產生動物-人雜交細胞，如以上I中所述。3、通過培養自發重編程。該技術包括在長期培養後從非多潛能細胞產生多潛能細胞。例如，已通過原生殖細胞(PGC)的長期培養產生了多潛能胚胎生殖(EG)細胞(Matsui 等人，Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murineprimordial germ cells in culture. Cell 70，841-847，1992,其作為參考併入本文)。還已報導了在骨髓來源細胞的延長培養後多潛能幹細胞的發育(Jiang等人，Pluripotency ofmesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature 418，41-49，2002,其作為參考併入本文)。他們將這些細胞表示為多能成熟祖細胞(MAPC)。Shinohara等人還表明在來自幼鼠精巢的種系幹細胞(GS)的培養過程中可以產生多潛能幹細胞，他們將這些細胞稱為多能種系幹細胞(mGS) (Kanatsu-Shinohara 等人，Generation of pluripotent stemcells from neonatal mouse testis. Cell 119，1001-1012，2004)。4、通過限定因子重編程。例如，通過向小鼠胚胎或成熟成纖維細胞通過反轉錄病毒介導引入轉錄因子(如0ct-3/4、Sox2、c-Myc和KLF4)產生了 iPS細胞，例如，如上所述。Kaji 等人(Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision ofreprogramming factors. Nature. 2009年3月I日在線發表)還說明了單個多能表達載體的非病毒轉染，其包含可以使小鼠和人成纖維細胞重編程的與2A肽連接的C-MyC、Klf4、0Ct4和Sox2編碼序列。通過該非病毒載體產生的iPS細胞顯示出多潛能標誌物的穩健表達，這表明了通過體外分化測定在功能上確認的重編程狀態和成熟嵌合小鼠的形成。它們成功地從胚胎成纖維細胞建立了穩健表達多潛能標誌物的重編程人細胞系。Shinya Yamanaka 在 Strategies and New Developments in the Generationof Patient-Specific Pluripotent Stem Cells (Cell Stem Cell I,2007 年 7月，a2007Elsevier Inc)中說明並討論了方法1_4,該參考文獻作為參考併入本文。5、從單個卵裂球或活檢的卵裂球獲得hESC系。參見Klimanskaya I, Chung Y，Becker S，Lu SJj Lanza R. Human embryonic stem cell lines derived from singleblastomeres. Nature 2006;444:512 ；Lei 等人，Xeno-free derivation and cultureof human embryonic stem cells:current status, problems and challenges.Cell Research(2007) 17:682-688 ；Chung Y，Klimanskaya I,BeckerS 等人，Embryonicand extraembryonic stem cell lines derived from single mouse blastomeres.Nature. 2006;439:216-219 ；Klimanskaya I，Chung Y，Becker S 等人，Human embryonicstem cell lines derived from single blastomeres. Nature. 2006;444:481-485 ；Chung Y，Klimanskaya I，Becker S 等人，Human embryonic stem cell lines generated withoutembryo destruction. Cell Stem Cell. 2008; 2:113-117 和 Dusko Ilic 等人(Derivationof human embryonic stem cell lines from biopsied blastomeres on human feederswith a minimal exposure to xenomaterials. Stem Cells And Development-paper inpre-publication)，所有參考文獻作為參考併入本文。6、從停止分裂並且不能體外發育成桑椹胚和囊胚泡的停育胚胎獲得hESC系。參見 Zhang X，Stojkovic P, Przyborski S 等人，Derivation of human embryonic stemcells from developing and arrested embryos. Stem Cells 2006;24:2669-2676 和 Lei等人，Xeno-free derivation and culture of human embryonic stem cells: currentstatus, problems and challenges. Cell Research (2007) 17:682-688，以上兩篇參考文獻作為參考併入本文。7、單性生殖(或單性生殖)。該技術包括非受精卵的化學或電學剌激以導致它發育成可以從中獲得胚胎幹細胞的卵裂球。例如，參見Lin等人，Multilineagepotential of homozygous stem cells derived from metaphase II oocytes.StemCells. 2003:21 (2) :152-61,他們使用非受精的中期II期卵母細胞的化學激活來產生幹細胞。8、胎兒來源的幹細胞。就潛能性而言，這些細胞處於胚胎和成熟幹細胞之間，並且可以用於獲得多潛能或多能細胞。Chris H. Jo等人(Fetal mesenchymal stem cellsderived from human umbilical cord sustain primitive characteristics duringextensive expansion. Cell Tissue Res (2008) 334:423-433，其作為參考併入本文)已成功獲得了表達具有多潛能性的標誌物(包括Nanog、Oct-4、Sox_2、Rex-U SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60和Tra-l_81，通過β _半乳糖苷酶染色以及末端酶活力的一致表達顯示了衰老的基本證據)的人臍帶來源的胎兒間充質幹細胞(UC fMSC)o Winston Costa Pereira等人(Reproducible methodology for the isolation of mesenchymal stem cellsfrom human umbilical cord and its potential for cardiomyocyte generation JTissue Eng Regen Med 2008; 2:394-399，其作為參考併入本文)從人臍帶的華頓氏膠質中分離了純間充質幹細胞群體。還在Troyer & Weiss (Concise Review:ffharton ' sJelIy-Derived Cells Are a primitive Stromal Cell Population. Stem Cells2008:26:591-599)中綜述了來源於華頓氏膠質的間充質幹細胞。Kim等人(Ex vivocharacteristics of human amniotic membrane-derived stem cells.Cloning StemCells 2007ffinter;9(4) :581-94，其作為參考併入本文)成功地從人羊膜中分離了人羊膜來源的間充質細胞。臍帶是通常丟棄的組織並且來源於該組織的幹細胞往往不會引起道德和倫理爭議。誘導的多潛能幹細胞具有以下優勢可以通過不導致胚胎破壞的方法獲得它們，更具體地，可以通過不導致人或哺乳動物胚胎破壞的方法獲得它們。照此，可以通過使用並非專門通過必須包括破壞而從中獲得那些細胞的人或動物胚胎的方法所製備的細胞來實施或實踐本發明的方面。具體地，該可選的限制應考慮歐洲專利局擴大覆審委員會2008年11月25日的決定G0002/06。間充質幹細胞間充質幹細胞以多能性著稱並且表現出分化成不同細胞/組織系(包括軟骨、骨、脂肪組織、腱和韌帶)的潛能。這些多能間充質祖細胞被稱為基質或間充質幹細胞。骨髓含有兩種主要細胞類型造血細胞和基質細胞。用於非造血組織的幹細胞被稱為間充質細胞，這是由於它們分化為間充質或基質細胞的能力。因此，在本說明書中，間充質幹細胞(MSC)是指能夠分化為成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、脂肪細胞和內皮的多能幹細胞。在本說明書中，MSC具體是指能夠分化為作為骨形成過程中的一部分的成骨細胞的多能幹細胞。通過微創技術能夠容易地從骨髓獲得間充質細胞並且可以將其在培養中擴增並允許分化成所需的系。可以通過應用特異生長因子來誘導分化。如骨形態發生蛋白(BMP)的轉化生長因子β (TGF-β)超家族成員蛋白是間充質幹細胞軟骨形成和成骨分化的重要因子。適合的MSC可以得自或來源於從骨髓吸取物中採集的骨髓單核細胞(BMMNC)(例如，Wexler 等人，Adult bone marrow is a rich source of humanmesenchymal 「stem，，cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not. HAEMOPOIESIS AND LEUCOCYTES British Journal of Haematology 121(2):368-374, 2003年4月)或臍帶的華頓氏膠質(例如，Ta等人，Long-term Expansion and PluripotentMarker Array Analysis of Wharton' s Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells. StemCells Dev. 2009 年 7 月 20 日(Epub))。可以通過在成骨培養基中的培養實現MSC向成骨系的分化。例如，將MSC以3000/cm2接種到6孔、12孔和腔室玻片中的維持培養基(DMEM、lg/l葡萄糖、10%FCS、2mM L-穀氨醯胺、50U/ml青黴素和50U/ml鏈黴素)中並保持24小時，然後更換為成骨培養基(維持培養基、IOnM地塞米松、25 μ g/ml抗壞血酸和IOmM β-甘油磷酸酯)。然後，將細胞維持多至28天，其中每3-4天更換一次培養基。14天後，可以在4%PFA中固定腔室玻片中的細胞並在4°C在PBS中儲存以用於免疫組織化學。在14和28天後，以用於鈣的茜素紅S和用於磷酸鈣的馮科薩氏染劑對細胞染色。還可以根據生產商的說明書使用Nucleospin RNA提取試劑盒(Macherey Nagel)提取RNA以用於分析,並且可以提取蛋白質樣品以用於分析。可以通過在生脂培養基中的培養實現MSC向生脂系的分化。例如，將MSC以18000/cm2接種到維持培養基中並如上所述培育2天。除去培養基並在加入生脂維持培養基(DMEM、4. 5g/l葡萄糖、10%FCS、L-穀氨醯胺和青黴素和鏈黴素)或生脂培養基(生脂維持培養基，其具有10 y g/ml胰島素、115 ii g/ml甲基-異丁基黃嘌呤、I U M地塞米松和20 y M吲哚美辛)前用PBS將細胞清洗一次。然後，將細胞維持多至28天，其中每3-4天更換一次培養基。在14和28天後，可以用油紅0對細胞染色以染色脂類小滴。還可以提取RNA和蛋白質用於分析。可以通過在軟骨形成培養基中的培養實現MSC向軟骨形成系的分化。例如，對MSC計數並以5 X IO5個細胞/ml在添加或未添加10ng/mlTGF □ 3 (Cambrex)的軟骨形成培養基(具有Cambrex軟骨形成單一等分部分的DMEM)中再懸浮，然後將500ml等分部分置於15ml管中，隨後以150 Xg在室溫下離心10分鐘並在37°C培育2天。兩天後，管中將 含有鬆散的圓形小粒。將小粒維持21天，其中每3-4天更換一次培養基，然後使用Trizol(Invitrogen)分離RNA或者在4%PFA中固定細胞小粒並包埋以用於低溫切片。在將玻片在-80°C儲存以用於免疫組織化學之前進行連續切片。當在匯合條件下研究成骨和生脂分化時，可以以30000/cm2接種細胞並允許在轉到相關分化培養基前達到匯合併如上所述進行培養。幹細胞的培養可以使用任何適合的幹細胞培養方法並且可以使用任何適合的容器使幹細胞增殖。適合的容器包括在美國專利公開US2007/0264713 (Terstegge)中所述的那些。例如，容器可以包括生物反應器和旋轉器。「生物反應器」是適合於(如)大規模培養真核細胞(例如，動物細胞或哺乳動物細胞)的容器。調控的生物反應器的典型培養體積在20ml至500ml之間。生物反應器可以包括調控的生物反應器，其中可以控制或監測一種或多種條件，例如，氧分壓。用於測量和調控這些條件的設備在本領域中是已知的。例如，氧電極可以用於氧分壓。可以通過所選氣體混合物(例如，空氣或者空氣和/或氧和/或氮和/或二氧化碳的混合物)的量和組成來調控氧分壓。Bailey, J E. (Bailey, J E.，生物化學工程基石出(Biochemical Engineering Fundamentals),第二版，McGraw-Hill, Inc.ISBN 0-07-003212-2Higher Education, (1986))或 Jackson A T. (Jackson AT., Verfahrenstechnik in der Biotechnologie, Springer, ISBN 3540561900 (1993))說明了適合用於測量和調控氧分壓的設備。其它適合的容器包括旋轉器。旋轉器是調控或未調控的生物反應器，其可以使用多種攪拌機構進行攪拌，如玻璃珠攪拌器、葉輪攪拌器及其它適合的攪拌器。旋轉器的培養體積通常在20ml至500ml之間。滾瓶是由塑料或玻璃製成的圓形細胞培養瓶，其具有400至2000cm2的培養面積。沿著這些燒瓶的整個內表面培養細胞；通過「滾動」運動(即，圍繞它們自身各自的軸轉動瓶)完成了培養基對細胞的塗覆。作為另外一種選擇，培養可以是靜態的，即不使用培養/培養基主動攪拌的情況。通過減少對培養的攪拌，可以允許形成細胞聚集體。雖然可以使用一些攪拌來促進培養基相對於培養細胞的分布和流動，但是可以應用這種攪拌從而基本上不破壞聚集體形成。例如，可以使用低rpm攪拌,例如，小於30rpm或小於20rpm。傳代增葙細胞培養方法可以包括培養期間的傳代或分種。這些方法可以包括連續或持續傳代。可以將培養中的細胞從基底或燒瓶中分離，並通過在組織培養基中稀釋並重新鋪板/重新培養來「分種」、繼代或傳代。術語「傳代」 一般可以是指取出細胞培養等份，完全或部分分離細胞，稀釋並接種到培養基中的過程。可以重複傳代一次或多次。所述等份可以包含細胞培養的全部或部分。所述等份中的細胞可以是完全、部分或未匯合的。傳代可以包括下列步驟順序中的至少一些吸取、清洗、胰酶消化、培育、移去、抑制、再接種和等分。可以使用Hedrick Lab, UC SanDiego 所發表的規程(http: //hedricklab. ucsd. edu/Protocol/COSCell. html )。 可以通過任何適合的方式分離細胞，如在本領域中已知的機械或酶促方式。可以通過機械分離打散細胞，例如，使用細胞刮刀或移液管。可以通過用適合的篩網尺寸進行篩分來分離細胞，如通過100微米或500微米篩網。可以通過酶促分離來使細胞分開，例如，通過用收穫的膠原酶或trypLE處理。所述分離可以是完全的或部分的。所述稀釋可以是任何適合的稀釋。細胞培養中的細胞可以以任何適合的比例分種。例如,細胞可以以I :2或以上、I :3或以上、I :4或以上或者I :5或以上的比例分種。因此，幹細胞可以傳代I次或以上。例如，幹細胞可以傳代2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25次或以上。傳代可以表示為細胞生長的代。幹細胞可以增殖 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25代或以上。幹細胞可以增殖至細胞倍增1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、21、22、23、24、25 次或以上。共培養和飼養細胞方法可以包括在存在或不存在共培養的情況下培養幹細胞。術語「共培養」是指在一起生長的兩種或更多種不同種類的細胞的混合物。所述兩種或更多種不同種類的細胞可以生長在相同表面(如顆粒或細胞容器表面)上或生長在不同表面上。不同種類的細胞可以生長在不同的顆粒上。飼養細胞可以表示不同類型細胞的培養所使用或所需要的細胞。在幹細胞培養的背景下，飼養細胞具有保證存活、繁殖和維持細胞多潛能性或多能性的功能。可以通過直接共培養飼養細胞來確保多潛能性/多能性。例如，可以用飼養細胞層塗覆如培養皿的容器的內表面。飼養細胞向培養基中釋放營養物。作為另外一種選擇或另外，可以在培養基中培養飼養細胞以對培養基進行調節。所述條件培養基可以用於培養幹細胞。因此，其中不存在或不需要飼養細胞的安排也是有可能的。除該組合明顯不允許或者明確應避免以外，本發明包括所述方面和優選特徵的組
口 ο本文所使用的章節標題僅是出於組織結構的目的，而不應視作對所述主題內容的限制。現在，將通過舉例說明並參考附圖對本發明的方面和實施方式進行說明。其它方面和實施方式對於本領域技術人員來說將是顯而易見的。本文中所提到的所有文檔均將作為參考併入本文。


現在，將參考附圖對說明本發明原理的實施方式和實驗進行討論，其中圖1.HS-2 提高了內源 FGF2。如通過 FGF2ELISA 所測量的，在 HS-2 (160ng/ml)中生長的人MSC (hMSC)所產生的內源FGF2水平比未給予HS-2的(基礎)細胞更高。給予FGF2 (5ng/ml)的細胞也產生了 FGF2，但是與在HS-2中生長的細胞相比水平較低。給予HS-2和FGF2的組合的細胞產生了甚至更多的FGF2。圖2. HS-2擴增的人MSC加速了骨癒合。(A)顯示不給予細胞、給予對照hMSC和HS-2擴增的hMSC的動物骨折後3周時骨再生的二維X射線和三維顯微CT圖像的顯微照片。(B)顯示不給予細胞、給予對照hMSC和HS-2擴增的hMSC的動物骨折後3周時骨折位點處百分比骨體積的圖。 圖3. HS-2擴增的人MSC加速了骨癒合。(A)顯示不給予細胞、給予對照hMSC和HS-2擴增的hMSC的動物骨折後7周時骨再生的二維X射線和三維顯微CT圖像的顯微照片。(B)顯示不給予細胞、給予對照hMSC和HS-2擴增的hMSC的動物骨折後7周時骨折位點處百分比骨體積的圖。圖4.馮科薩氏染色樹脂組織學。顯示不給予細胞、給予對照hMSC和HS-2擴增的hMSC的動物骨折後3周和7周時骨折位點處馮科薩氏染色的顯微照片。黑色染色(馮科薩氏陽性)標記了鈣化骨的區域。與對照和未處理的動物相比，用HS-2擴增細胞處理的動物提高了骨形成。圖5.紅色納米點的存在表明移植的HS-2MSC在移植後存活多至7周，而對照MSC僅可以在3周時發現。藍色(DAPI)對所有細胞染色，包括移植和宿主細胞。圖6. HS2擴增的人MSC的存活。(左側)對照(上)或HS_2處理的動物(下)7周時股骨的代表性組織切片。NB :新骨，BM :骨髓，SC :支架，HC :肥大軟骨細胞，P :支架的孔，和0B:骨鈣素陽性成骨細胞。括號描繪了缺損末端。(右側)代表性DAPI染色的股骨低溫切片，以顯示缺損中存活的hMSC。DAPl將細胞核染成藍色，而將用QTracker 預標記的hMSC染成螢光紅色。將抗人核抗原的抗體用於確認植入的幹細胞的存在，其在HS-2處理後特別顯著。圖7.顯示不給予細胞、給予對照hMSC和HS-2擴增的hMSC的動物移植後7周時血管的血管性血友病因子(vWF)染色的顯微照片。HS-2MSC治療的骨折中對vWF染色的增強表明與對照MSC相比，HS2擴增的hMSC引起了較大程度的血管形成。圖8.扭轉生物力學。(A)顯示通常骨的抗扭剛度的圖。(B)不給予細胞、給予對照hMSC和HS-2擴增的hMSC的動物骨折後移植後的7周時的骨扭矩強度。給予HS-2MSC的動物中的扭矩強度顯著大於不給予細胞或給予對照hMSC的動物中的扭矩強度。圖9.來自ElO神經上皮的細胞外HS2的預估凡的總結。在多種處理後，在
IX 120cm的Sepharose CL-6B柱上對HS的來源進行分離。在弱鹼處理前後確定純化的全長HS的尺寸以確定每個蛋白質芯中不止一條鏈的存在。另外，通過從Bio-Gel P-IO柱分離未分辨的大寡糖並將它們在Sepharose CL-6B柱上再次運行來確定肝素酶敏感的二糖之間的大致距離。
圖10. HS-2中對低pH值HNO2、乙醯肝素酶和肝素酶敏感的化學鍵的比例。用低pH值HNO2、肝素酶或乙醯肝素酶處理放射性標記的硫酸乙醯肝素2並在Bio-Gel P-IO柱上分離。通過2An/n在兩個獨立的實驗中確定了對處理敏感的總化學鍵的百分比，其中An是該色譜峰中總放射性的百分比，而n是通過洗脫位置確定的寡糖中二糖重複單元的數目(Turnbull 和 Gallagher, 1990 ；Kato 等人,1994)。圖11.來自ElO神經上皮的硫酸乙醯肝素的亞硝酸來源的二糖組成。用低pH值HNO2通過脫氨基裂解使放射性標記的HS-2解聚。在GAG的HNO2處理後分離二糖，然後將樣品在I X 120cm的Bio-Gel P-2柱上運行。通過SAX-HPLC分離所得的二糖。對色譜峰下的面積積分以獲得每種樣品中二糖的組成和隨後的百分比組成。圖12.通過SAX-HPLC分離來自HNO2處理的HS-2的四糖。最初，在Bio-Gel P-2柱上分離來源於HNO2處理的硫酸乙醯肝素的四糖，然後在SAX-HPLC上進一步分離。通過計算每個峰中的放射性並將其與所有合併的峰中的總放射性相比來確定每個的百分比。左列中四糖峰的數目對應於得自SAX-HPLC的峰。通過將這些氚化樣品與通過在相同條件下在相同色譜柱上運行的雙35S/3H放射性標記的樣品(得自Gordon Jayson博士, Universityof Manchester)所產生的峰相比,確定了硫酸化程度。 圖13.肝素裂合酶處理後，來自ElO神經上皮的硫酸乙醯肝素的二糖組成。使用乙醯肝素裂合酶的混合物使硫酸乙醯肝素2完全解聚。在P-2柱上分離所得的不飽和二糖並通過強陰離子交換柱色譜法分離。對每條所得曲線下的面積積分以計算每種樣品中每種二糖的百分比。數字表示兩次運行(對於最初的GAG樣品)和三次運行(對於2. 3D來源的樣品)的平均值。從每種樣品中回收了 97%以上的二糖。圖14.來自圖13中所示的HS-2混合物的二糖的硫酸化特徵。圖15.對HS-2的短期暴露提高了 hMSC的增殖。(A)暴露於提高的HS-2劑量的細胞的增殖；隨後使用了 160ng/ml。測定重複三次。(B)在對照(上方)和含有HS-2的培養基(下方)中培養的細胞的相差顯微照片，標尺=200 iim。(C)暴露於HS-28天後，通過膜聯蛋白和AAD-7染色使用GUAVA軟體所測量的活力水平。(D)在血清剝奪後，在短期暴露於對照或HS-2期間BrdU的摻入。(E)當在HS-2中培養3天時，處於細胞周期的S/G2/M期的細胞的比例。對照(黑色圓圈)和HS-2 (空心圓圈)。誤差線代表標準偏差，n=3。(F)暴露於添加(灰色柱)或未添加外源HS-2 (空心柱)的提高的FCS濃度的hMSC的WST-I代謝測定。實驗重複二次。圖16.暴露於HS-2提高了從骨髓吸出物中對CFU-F hMSC的回收並刺激了 STR0-1陽性亞群的擴增。(A)如通過FACS所建立的早期hMSC的免疫表型。(B)對於作為STRO-I+或(C) STRO-1+胃的分選細胞的比例，擴增並定量了早期hMSC。對照用白色柱表示，而HS-2用灰色柱表示。對於B和C，誤差線表示SD，n=3。(D)將低傳代MSC置於對照培養基(黑色圓圈)或HS-2 (空心圓圈)中並且通過FACS對STR0-1陽性細胞的比例監測10次群體倍增。(E)細胞倍增10次後，我們對細胞進行集落效率測定。黑色柱表示HS-2中擴增的細胞，而空心柱表示對照培養基中擴增的細胞。誤差線代表SD，n=3。圖17. HS-2的存在在hMSC的大規模擴增期間富集了具有更長端粒的更原態的幹細胞亞群。(A)將人MSC在對照或HS-2培養基中擴增45天並且將單個細胞所產生的細胞累積數目和群體倍增對時間作圖。(B)在對照或HS-2中擴增至群體倍增15次的hMSC的平均端粒長度。將數值歸一化為初始原代hMSC培養中端粒的長度。(C)來自3個不同人供體的細胞在對照或含有HS-2的培養基中擴增40天的培養中表面標誌物的表達。星號表示O. 0001 (***)或O. 005 (**)水平的顯著性。(D-F)如A中，在對照(白色柱)或HS-2 (灰色柱)培養基中擴增38天的hMSC的分化潛能。然後，擴增的細胞在生脂(D)、成骨(E)或軟骨形成培養基(F)中分化28天。通過油紅O染色(標尺=Imm)並且使用定量PCR對CCAAT/增強子結合蛋白_a(C/EBPa)和脂肪細胞脂質結合蛋白(ALBP)測量了脂肪形成；通過鹼性磷酸酶、茜素紅(標尺=Imm)以及定量PCR對鹼性磷酸酶(ALP)和骨涎蛋白2 (BSPII)測量了骨生成；通過H&E和阿辛藍染色(標尺=500 μ m)以及定量PCR對膠原2al (Coll2a)和SOX9測量了軟骨形成。圖18. HS-2擴增了能夠克隆並經歷多向分化的hMSC。(A)在HS-2或對照培養基中擴增的細胞的單細胞集落形成。在96孔板中的HS-2或對照培養基中擴增13次H)的細胞的克隆頻率。誤差線代表標準偏差，n=3。(B)從在對照或HS-2培養基中擴增13次 H)的培養中獲得的代表性克隆的多向分化測定。自上而下來自生脂培養的含脂肪細胞的相差顯微照片，礦化的成骨培養的茜素紅染色，軟骨形成培養的H&E和阿辛藍染色。(標尺=200 μm)圖19. HS-2保護hMSC培養抵抗幹細胞基因表達在時間上的損失。(A)通過化學發光GEArray (幹細胞SuperArray#HS601. 2)所測量的維持在對照培養基或HS-2中的hMSC的基因表達的分層聚類分析。(B)幹細胞相關基因表達的奇異值分解分析。將數據進行對數轉化並且對晶片間變化(cross-chip variation)進行修正。在HS-2 (空心圓圈)中生長較長時間段的MSC與在對照培養基(實心圓圈)中生長較短時間的MSC聚類。(C)列出了顯著調控的基因。圖20.在HS-2中培養的hMSC保留了它們的免疫調節能力並且提高了體內骨形成。(A)在對照(ctrl)或HS-2補充培養基中培養21天的hMSC的免疫調節活性。在另外24h後，將來自兩個不同供體的刺激性和反應性PBMC的混合物以不同的hMSC =PBMC的比值加入至孔中，然後在6天後通過FACS評價⑶3+Ki67+細胞的表達。陽性對照表示在不存在hMSC的情況下獲得的CD3+Ki67+細胞的最大個數。對每次實驗重複讀數兩次並且圖中為兩次獨立實驗的平均值土SD。(B)用HS-2擴增的hMSC (HS-2)和對照培養基(Ctrl)處理的股骨在3和7周時的代表性μ -CT圖像。(C)如通過CTan軟體所確定的3周和7周時的百分比骨體積。將結果表示為平均值土SD，對於每個處理組的每個時間點，n=6。(D)如B中所處理的股骨的代表性DAPI染色的低溫切片，以顯示缺損中存活的hMSC。DAPI將細胞核染成藍色，而將用QTracker 預標記的hMSC染成螢光紅色。(E)如B中所處理的股骨在7周時的代表性組織切片。NB :新骨，BM :骨髓，SC :支架，HC :肥大軟骨細胞，P :支架的孔，和OB :骨鈣素陽性成骨細胞。箭頭描繪了缺損末端。圖21.暴露於HS-2提高了從骨髓吸出物中對CFU-F hMSC的回收並刺激了 STR0-1陽性亞群的擴增。(A)從對照或含有HS-2的培養基中的3個不同骨髓單核細胞供體批次回收原代CFU-F hMSC和(B)對照和含有HS-2的培養基中I :15稀釋的培養中的集落數目。用單個(p〈0. 05，t檢驗)或三個星號(p〈0. 0001,t檢驗)標記了對照和HS-2組之間的顯著差異。(C)對照或含有HS-2的培養基中回收的CFU-F hMSC中的表面標誌物表達的代表性實例。(D-F)三種不同hMSC的混合物的細胞累積數目的增加。以5000個細胞/cm2將低傳代hMSC鋪板並在添加或未添加160ng/ml HS-2的培養基中培養至亞匯合，在此之上對細胞胰蛋白酶化、計數並以5000個細胞/cm2重新接種到相應培養基中。將這重複2周的一段時間。數目以從一個細胞開始的細胞數目累積增加。(G)另外6天後，對照(綠色)或含有HS-2的培養基(藍色)中回收的CFU-F hMSC的STRO-I表達譜的FACS分析。用紅線表示同型對照。對照用白色柱表示，而HS-2用灰色柱表示。對於H和I，誤差線表示SD，n=3。(J)將低傳代MSC置於對照培養基(黑色圓圈)或HS-2 (空心圓圈)中並且通過FACS對STR0-1陽性細胞的比例監測10次群體倍增。圖22.用於hMSC中端粒長度的相對定量的標準曲線。對來自人胚胎幹細胞系BGOlV (ATCC)的匯合層的染色體DNA定量。通過RQ-PCR重複三次分析BGOlV cDNA的連續稀釋的36B4 (,)和端粒重複( )的擴增，並且將cDNA的量作為平均Ct的函數作圖。通過Excel計算圖中所示的趨勢線的公式並用於估計HS-2或對照培養基中擴增的hMSC中36B4和端粒重複的表達。圖23. FGF2而不是HS-2的存在降低了 hMSC的生脂分化。匯合時，將hMSC更換至維持(對照；▲)或者補充或未補充(分化對照；《)160ng/mlHS-2(T)* 10ng/ml FGF2 (■)的 生脂培養基。將細胞培養32天，其中每周更換兩次培養基。(A)四種分化條件中的細胞的相差顯微照片(X200放大)。具有或不具有補充劑的維持培養基中的細胞不能積累脂肪。(B)每次更換培養基時的脂連素ELISA。收集樣品，在_80°C儲存並根據生產商的說明書使用脂連素ELISA試劑盒(Otsuka pharmaceutical)重複分析三次。與FGF-2相比，HS對脂連素水平無不利影響，這極大地抑制了其在所有時間點的表達。圖24. FGF2而不是HS_2的存在降低了 hMSC的成骨分化。匯合時，將培養基更換為維持或補充或未補充(CTRL)160ng/ml HS-2或10ng/mlFGF2的成骨培養基。將細胞培養21天，其中每周更換兩次培養基。16天後，將在補充了 FGF2的成骨培養基中培養的細胞從板中剝離。(A)14和21天後，四種分化條件中的細胞的相差顯微照片(X200放大)。(B)如通過茜素紅染色所確定的，在14和21天後hMSC的礦化。維持培養基中的細胞無法礦化。圖25.用於定量PCR的Taqman引物/探針的列表。圖26.局部加權平滑處理後的MA圖。僅將Ctrl-d32的數據相對於Ctrl_d21的數據作圖。對強度進行對數轉化和中值縮放(median scaled)。用藍色表示平滑處理前的數據，而用紅色表示擬合值。圖27.局部加權平滑處理後的數據圖。如補充圖26，對數據添加顏色。圖28.通過角度選擇所鑑別的基因列表。基於相對於原點的它們的加載物所對的角以及大於由2條最大差異軸所限定的投影空間上的90%的歐氏距離(歐幾裡德距離，Euclidean distance),分選基因。提供了 Unigene 號、Genbank RefSeq 號、基因符號和說明。圖29.基於奇異向量係數的基因選擇。係數的過濾是基於從原點(黑色十字)開始的歐氏距離的90%的。聚類表示相對於X軸每個聚類的基因所對的角。它們標為藍色(群I)、紅色(群2)和綠色(群3)並用橢圓圈起來。基因如圖28中編號。圖30.在對照、含有HS-2的培養基中培養21天後，基於所鑑別的生物標誌物的三種hMSC患者混合物的投影。對照(紅色圓圈)不同於HS (綠色圓圈)。(混合物I、2和3，分別為 hMSCU2 和 3 (圖 23))。
圖31.樣品投影得分之間的自舉歐氏距離。分布是大致正態的(中值距離在上下四分位數的中心)。虛線表示位於上下四分位數的四分位數間距離的相鄰值。僅顯示了相對於Ctrl-d21的比較。相對於對照距離，隨後傳代的HS距離基本不重疊。圖32.自舉統計表。a歐氏距離的估計值是基於前兩個奇異向量的。bCL下限和cCL上限提供了在1000個自舉重複內估計的95%的置信界限。
具體實施例方式通過舉例，在以下所附說明中說明了本發明的一個或多個實施方式的細節，包括本發明人對實施本發明所考慮的最佳方式的具體細節。對本領域技術人員來說顯而易見的是可以不限制於這些具體細節而實踐本發明。 實施例I方法人MSC分離和細胞培養在37°C下在加溼的5%C02培育箱中，將人間充質幹細胞(hMSC) (PT-2501 ；Lonza)維持在補充了 10%胎牛血清(FBS)、0. 1%青黴素/鏈黴素和2mM L-穀氨醯胺的DMEM，1000mg/l葡萄糖中。以三天間隔更換培養基，並且每4-5天繼代培養細胞(約80%匯合)；將來自2-5代的等分部分在液氮中冷凍備用。來自三位健康供體的未處理的原代人骨髓(#1M-125)購自Lonza並對其進行聚蔗糖(Ficoll)梯度分離以分離hMSC和消除不希望的細胞類型。然後，將細胞鋪板並如先前所報告地培養{Rider，2008#85}。hMSC免疫表型的鑑定實施流式細胞分析以比較HS-2擴增和對照擴增的hMSC對CD49a、CD73 (BDBioscience)>CD 105 (eBioscience)和 STR0-1 (R&D Systems)的譜，或與如先前所報導的同型對比對照{Rider, 2008#85}進行比較。使用Guava PCA-96臺式流式細胞儀和GuavaExpress 軟體(Millipore)分析樣品。集落形成單位-成纖維細胞在存在或不存在HS-2補充劑的情況下測定集落效率。如前所述{Rider, 2008#85}，將骨髓單核細胞(3X 105/cm2)或hMSC (30個細胞/cm2)在24孔板中重複鋪板3次，並培養14天。對具有不與其它集落接觸的超過50個細胞的集落進行計數。增殖和凋亡測定按照生產商的說明書在GUAVA PCA-96臺式流式細胞儀(Millipore)上分析細胞數、細胞周期動力學(碘化丙啶)和細胞凋亡(膜聯蛋白V)。根據生產商的建議(Roche)通過將細胞與WST-I培育來確定增殖相關代謝活性。將人MSC (3. 3X IO3)在96孔板中在添加HS-2的培養基或維持培養基中鋪板並培養持續不同的時間點。對於BrdU測定，在加入添加或未添加HS-2的培養基之前，使細胞(2. I X IO5個細胞/cm2)在96孔板中附著(2h)，然後血清飢餓(O. 2%FBS)。按照生產商的說明書使用細胞增殖ELISA試劑盒(Roche)測量BrdU摻入。為了確定HS-2補充對累積細胞數(長期生長)的影響，將hMSC以5X103個細胞/cm2鋪板並培養至85%匯合,用胰蛋白酶/EDTA剝離,計數(Guava Express軟體),然後以5X IO3個細胞/cm2重新鋪板。將該過程重複45天，其中每周更換兩次培養基。端粒長度
在不同的時間點，從在存在或不存在HS-2的情況下擴增的細胞中分離染色體DNA。在 PBS 中清洗細胞並在 37°C下在緩衝液(IOmM Tris, pH 7. 5, IOmM EDTA, IOmM NaCl,1%SDS 0.05mg/ml並且不含核糖核酸酶A-脫氧核糖核酸酶)中細胞溶解過夜。將蛋白酶K (lmg/ml)加入至溶胞產物，並將其在37°C培育5h。用2體積純乙醇和250mM NaCl沉澱DNA。在70%乙醇中清洗沉澱物，乾燥並在H2O中再懸浮。將DNA定量並且如先前所報導的{Cawthon, 2002#39 ；Guillot, 2007#40 ；Cawthon, 2002#39 ；Guillot, 2007#40}，通過 RQ-PCR將12. 5ng用於36B4基因和端粒重複的擴增，該實驗重複三次。根據由從人胚胎幹細胞系BGOlV (Invitrogen)分離的染色體DNA所製備的標準曲線(Ct相對於log量)估計端粒重複和36B4的相對表達(圖22)。幹細胞微陣列在培養指定天數後，從對照和HS-2培養中純化了總RNA。將重複三次(triplicate)的標記RNA樣品混合(I 1 :1)並用作化學發光cDNA陣列上的探針(GEArrayS 系列人幹細胞基因陣列，SuperArray Bioscience Corporation, Frederick, MD)。將該程 序對每組重複3次，總計每組3個重複三次的混合樣品。使用Chemi-Smart 3000圖像採集系統(Vilber Lourmat, Cedex, France)分析陣列。為了更全面地描述HS-2對hMSC基因表達測量的時間過程影響，我們基於使用奇異值分解(SVD)和主成分分析(PCA)對我們的微陣列的分析重建了遺傳網絡{Ghosh, 2002#147}。在(以下的)補充方法中描述了基於SVD投影的特徵(signature，標記)的構造。先前已表明PCA足夠靈敏從而能夠使用其基因表達特徵{Bild, 2006#34}和外切蛋白酶活性{Villanueva, 2006#41}來區分瘤的亞類。通過 DAVID 生物信息學資源 6. 7 (http: //david. abcc. ncifcrf. rov/) {Huang da, 2009#178 ；Dennis, 2003#184}和所產生的圖形熱圖(http://api. imapbuilder.net/editor/)對基因表達中的摺疊變化進行計算和數據分層聚類。免疫調節將在對照或含有HS-2的培養基中擴增21天的人MSC以I X IO5個細胞/孔接種到96孔板中。如先前所報導的{Rai, 2010#155}，在24小時後以不同的hMSC =PBMC的比值將來自兩個不同供體的刺激性和反應性PBMC的混合物加入到孔中，並且將細胞培育6天，然後通過FACS評價⑶3+Ki67+細胞的表達。多向分化如前所述{Rai，2010#155 ；Rider, 2008#85}，在HS-2或對照培養基中將人MSC連續傳代7代，然後在胰蛋白酶/EDTA中剝離並重新接種以比較在不存在HS-2的情況下用成骨、生脂或軟骨形成補充劑刺激時它們沉積骨狀基質、形成脂類小滴或分泌糖胺聚糖的能力。如前所述{Oest, 2007#49 ；Rai, 2010#155 ；Rai, 2007#48 ；Rider, 2008#85}，在相比較的培養中分離了總RNA並且確定了 mRNA轉錄本關於成骨、生脂和軟骨形成生物標誌物的水平(圖25)。還對在HS-2或對照培養基中擴增的hMSC進行了 13次群體倍增的克隆測定。使用FACSAria(BD Bioscience)將單個細胞接種到96孔板中並在存在或不存在HS_2的情況下培養14天，並且如上所述評價了集落形成效率。從相比較的孔中，克隆的hMSC在存在或不存在HS-2的情況下連續傳代並且如上所述再次評價了它們的多向潛能(miltilineagepotential)。體內骨形成
如前所述{Rai, 2004#46}，將含有hMSC :HS_2或對照擴增的hMSC (IXlO6個細胞；傳代4次)的複合材料支架加載到聚(e -己內酯)_磷酸三鈣(PCL-TCP)複合材料支架{Hutmacher, 2000#44 ；Hutmacher, 2001#45 ；Rai, #46 ；Rai,2005#47 ；Rai,2010#155}(Osteopore International)上，並置於24孔培養板中，與纖維蛋白Tisseel密封劑(Tisseel kit, Immuno, Austria)以3 :1的比例混合。細胞接種後，將Iml新鮮培養基加入到每個孔中，並且在移植前將細胞在加溼的氣氛中在37°C和5%C02下培育過夜。大鼠股骨缺損模型為了確定HS-2擴增的hMSC對骨癒合的效力，將含有hMSC的複合材料支架植入到裸大鼠中的雙側股骨大段臨界性(critical-sized)缺損中。按照所有適當的指導原則，使用18隻雄性CBH/Rnu大鼠(重量220-260g)的研究規程經過了新加坡科技研究局實驗動物保護和使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)的批准。如先前所建立的{Oest，2007#49 ；Rai, 2010#155 ；Rai, 2007#48}，實施所有手術程序。簡要地，在通過近端後肢上的縱切使股骨暴露後，用常規模塊固定板固定股骨並且用微型往復鋸產生8mm雙側大段臨界性缺損。每隻大鼠在其中一個股骨缺損中接受hMSC接種的PCL-TCP支架，而對側股骨缺損接受HS-2擴增的hMSC接種的PCL-TCP支架。在3周和7周安樂死後，收穫樣品並保存在10%的中性緩衝的福馬林中以用於隨後的二維放射照相 (每組n=6)、三維顯微計算機斷層掃描(y -CT)(每組n=6)、細胞存活分析(每組n=3)、組織學(每組n=3 )和免疫組織化學(每組n=3 )。石蠟組織學、細胞存活、二維放射照相和U -CT分析如先前所發表的{Rai，2010#155}，在手術後立即進行並且在3周和7周時再次進行股骨的石蠟組織學、細胞存活分析和成像。樹脂組織學根據我們先前所建立的方法{Sawyer，2009#80}，對所選的股骨在甲基丙烯酸甲酯中進行未脫鈣的樹脂處理/包埋。將橫截面切割為5 u m並用四鉻染劑(MacNeal)/馮科薩氏染劑染色，並在Olympus Stereo (SZX12)顯微鏡下檢查。免疫組織化學根據我們先前所建立的方法{Sawyer，2009#80}實施該程序。將組織切片與骨隹丐素的第一抗體(primary antibodies) (Abeam, Cambridge, UK)或相同濃度的小鼠IgG(Caltage Laboratories, Burlingame CA, USA ;作為陰性對照)一起培育。統計分析數據以至少三個獨立實驗(每個實驗重複測量三次)的平均值土標準差表示。實施了雙側非配對t檢驗，並且用單個(p〈0. 05)、兩個(p〈0. 005)或三個星號(p〈0. 0001)標記對照和HS-2組之間的顯著性差異。結果HS-2提高了 hMSC生長並維持它們的活力我們先前已描述了對神經前體細胞具有有效生物活性的FGF-2結合HS (HS_2){Brickman, 1995#28 ；Nurcombe, 1993#29}。由於 FGF-2 是幹細胞(包括 hMSC)有效的有絲分裂原，因此我們檢查了 HS-2刺激hMSC擴增的生物活性。在該研究中，我們研究了 HS-2是否可以支持並加快hMSC的離體擴增以獲得治療數目的細胞而不損失多能性。此外，我們確定了當體內移植時，HS-2擴增的細胞是否能夠提高骨形成。
典型(Pilot)實驗顯示HS-2提高細胞增殖的最佳劑量在ng/ml的範圍內，其中160ng/ml獲得了最大刺激活性(圖23)，這與我們之前的研究一致{Dombrowski，2009#82}。160ng/ml的HS-2在6天的一段時間內將亞匯合hMSC的增殖提高了約65% (p〈0. 005)(圖15A)，這與顯微觀察一致(圖15B)。這種細胞數目的增加是由於細胞存活力的適度提高(數據未顯示)和基於膜聯蛋白V染色的細胞凋亡的降低(圖15C)。為了區別HS-2對細胞周期動力學的影響與對增殖-靜止過渡的影響，我們實施了血清剝奪實驗(圖MD和E)。在不存在/存在HS-2的情況下，用血清刺激血清剝奪靜止細胞。在不存在/存在HS的情況下，血清刺激導致15h內進入S期，然而通過HS-2刺激，S期內的細胞數目要大得多(圖15D)。類似地，在血清刺激後，HS-2提高了 G2/M細胞的量，而不是它們在時間上的表現(圖15E)。因此，在血清刺激後，HS-2不影響通過Gl導致進入S期和G2的時間進展，而是影響從GO進入細胞周期的細胞數目。由於HS-2似乎影響G0/G1過渡，因此如通過監測增殖相關代謝活性的WST-1測定所測量的，我們考察了 HS-2是否可以改善FCS的增殖效力(圖15F)。將FCS濃度逐漸從10%降低至1%導致增殖活性降低。然而，在存在HS-2的情況下，FCS的促有絲分裂活性顯著得 到改善；例如，加入HS-2的2. 5%FCS的活性水平反映了無HS-2的7. 5%FCS的活性水平。此夕卜，與正常劑量的10%FCS相比，5%FCS或以上的活性水平在加入HS-2時均表現出更穩健的增殖活性。有趣地，HS-2的補充導致hMSC將大量FGF2釋放到培養基中，從而表明了糖觸發的自分泌環的形成/增強(數據未顯示)。總體而言，這些結果表明HS-2通過刺激正常靜止細胞群體進入細胞周期並保持它們的增殖來提高細胞數目。為了確定HS-2補充是否影響hMSC的免疫表型譜，我們實施了亞培養細胞的流式細胞分析。首先，我們建立了早期傳代的hMSC的譜，並注意到了 CD73和CD105的高表達以及⑶49a和STR0-1的中度表達(圖16A)。隨後，將這些細胞在對照和HS-2補充培養基中進一步擴增並再次分析STR0-1表達(圖16B和C)。HS-2處理導致顯著更大的STR0-1表達，並且特別是STRO-1+胃群體。此外，在獨立的實驗中，我們在HS-2培養基中將低傳代hMSC連續培養多至10次群體倍增(圖16D)並且注意到STR0-1表達細胞比例的顯著增加。這與維持在對照培養基中的細胞形成對比，對照培養基中表達STR0-1的細胞比例持續降低。該發現通過集落效率測定得到證實，其中在10次群體倍增後，與對照培養基中培養的細胞相比HS-2擴增的細胞所形成的集落多約50%(圖16E)。總體而言，這些數據表明HS-2對隨時間維持在培養中的STR0-1陽性群體具有顯著影響。在HS-2中長期擴增的人MSC更易於增殖，並且還保持了它們的多能性由於HS-2對hMSC培養的生長具有有效的早期影響，因此我們接著設法確定了其長期影響。用於臨床用途的hMSC的擴增通常需要將細胞培養多至一個月以達到治療劑m (http: //osiris, com)。按照所建立的規程{Haynesworth, 1992#32 ；Jaiswal, 1997#33 ；Haynesworth, 1992#32 Jaiswal, 1997#33},我們在 HS-2 或對照培養基中擴增了 hMSC。僅21天後，補充HS-2的培養導致產生了比對照數量級更多的細胞(圖17A)。為了確定HS-2補充對hMSC的長期影響，我們進行了檢查端粒長度、CFU-F頻率、免疫表型和多向分化潛能的一系列測定。在HS-2中擴增15次H)的細胞具有比在對照培養基中擴增的細胞顯著更長的端粒(圖17B)。值得注意的，如先前所報導的(數據未顯示){Shi，2002#ll ；Simonsen, 2002#12}，不管培養處理，在這些細胞中不能檢測到端粒酶活性。另外，重複傳代與核型異常無關(數據未顯示)。為了測試長時間暴露於HS-2是否會不利地影響hMSC表型，在至少15次後分析了表面標誌物表達。在存在HS-2的情況下，STR0-1、⑶49a和⑶105的表達顯著提高，而⑶73保持不變(圖17C和D)，儘管存在HS-2的補充到這時獲得了多13倍細胞的事實(圖17A)。接著，我們使用組織學和PCR基方法的組合設法確定了在適當分化培養基中培養時這些細胞的生脂(圖17E)、成骨(圖17F)和軟骨形成(圖17G)潛能。值得注意的，HS-2擴增的細胞與對照相比具有類似的，或者在一些情況下具有提高的多能性。此外，這些細胞進入成骨或軟骨形成系的能力是特別顯著的。這些數據表明HS-2顯著提高了具有較長端粒的高度多能(STR0-1表達)hMSC亞群的增殖。HS-2擴增的hMSC保留了 CFU-F並且在單細胞克隆後是多能的為了嚴格表明HS-2補充能夠靶向真正的間充質幹細胞的擴增而不是祖代的混合群體，我們評價了從先前在HS-2或對照培養基中擴增13次的hMSC中分離的單細胞克 隆的集落形成和多能性。將單細胞接種到96孔板中並培養2周。在HS-2中擴增的細胞(12%)比對照培養基中的細胞(7%)表現出更高的集落形成速率(圖18A)。還通過生脂(月旨肪累積)、成骨(茜素紅染色)和軟骨形成(阿辛藍染色)測定評價了相比較(parallel)集落的多向潛能(圖18B)。這些數據進一步確認相對於擴增相同數的對照細胞，在存在HS-2的情況下擴增的hMSC保持了它們的多能性。HS-2中hMSC的擴增維持了它們的原態性最經常地，基於對組織培養塑料製品的粘附、免疫表型譜和多向測定{Dominici, 2006#185}以及體內骨形成{Shi, 2002#11}的評價報告了 hMSC乾性的定性測量。我們還使用幹細胞特異性陣列利用基因圖譜(圖19A)和主成分分析{Villanueva, 2006#41} (PCA ;圖19B)來評價HS-2的影響。基於分層聚類的熱圖在功能上顯示在對照中與細胞周期進展和促有絲分裂信號有關的基因下調，而在HS-2中參與細胞定型和分化的基因下調。特別值得注意地，在最上調的基因中，參與細胞粘附和生長的那些是顯著的，而在最下調的基因中，fct和TGF家族成員是顯著的。然後，將陣列數據投影到前兩個最大差異的奇異向量上以通過奇異值分解(SVD)產生表達特徵(圖19B) {Alter, 2000#36 ；Holter, 2000#37}(補充方法)。這些數據顯示在存在HS-2 (空心圓圈)的情況下擴增21天的hMSC具有獨特的基因表達特徵並且不與來自其它處理(如培養45天的對照細胞)的細胞聚類。然而，在存在HS-2的情況下培養32或45天的細胞和21或32天的對照細胞之間的聚類是明顯的。這表明HS-2獲得了幼小對照細胞所特有的幹細胞基因特徵。為了確定HS-2的影響是否穩健，將21天時來自兩個其它供體的幹細胞基因表達特徵與第一供體相比較。還根據處理將它們聚類在一起。這表明HS-2的影響不是供體特異的，並且通過SVD產生的基因表達特徵可以用於可靠地比較來自不同供體的細胞。HS-2擴增的hMSC在正位缺損中刺激穩健的骨形成由於hMSC已顯示出施加免疫抑制作用{Aggarwal，2005#214 ；Shi, 2010#187}，我們首先設法確定HS-2中的連續擴增是否具有任何不利影響(圖20A)。將人MSC在HS-2或對照中擴增21天，然後用來自兩個不同供體的刺激性和反應性PBMC的混合物以不同的hMSC PBMC比例攻擊6天，然後評價⑶3+Ki67+的表達。HS-2不損害hMSC的免疫抑制效果。
接著，我們設法確定當植入到臨床相應體內骨缺損模型中時hMSC在HS-2中的長期離體擴增是否影響它們的治療應用。在手術後3周和7周通過X射線和μ -CT成像評價骨缺損內的骨形成並且表明hMSC移植導致使用HS-2擴增的hMSC更顯著的骨修復(圖20B)。μ -CT圖像的定量分析顯示在用HS-2擴增的hMSC處理的缺損中加快了新骨形成(圖20C)。由於僅在骨再生的後期發生，因此未在任何處理的股骨中觀察到骨橋。為了評價植入的hMSC的體內存活，用Qtracker 螢光納米顆粒預標記的細胞處理所選的缺損。植入後3周，在所有處理的股骨的骨缺損位點內存在標記的hMSC (圖20D)。值得注意的，僅發現細胞質標記物共定位於DAPI陽性細胞，從而確認是通過植入的hMSC所保留的。用人核特異抗體的免疫染色進一步驗證缺損位點內存在存活的hMSC。7周時，缺損位點中仍存在的唯一標記細胞是來自於HS-2中擴增的hMSC。
手術後7周，通過組織學評價進一步驗證了植入的hMSC的治癒潛能。接受HS-2擴增的hMSC的缺損(defects)的H&E切片顯示出新骨狀組織、骨髓以及從宿主骨界面和皮下界面浸潤缺損位點的肥大軟骨細胞(表明軟骨內骨化)(圖20E)。馮科薩氏染色切片確認橋連大部分缺損並浸潤支架孔的HS-2細胞組中的礦化骨狀組織(染色黑色)的存在。類似地，在整個缺損位點大量骨鈣素富集組織也是明顯的。相反，用對照擴增的hMSC處理的缺損導致產生了很大程度缺少馮科薩氏染色和骨鈣素染色的少量礦化組織(圖20E)。因此，儘管HS-2擴增的hMSC廣泛地離體擴增，但HS-2擴增的hMSC保留了它們刺激穩健骨形成的能力。此外，HS-2擴增的hMSC在缺損處提高的存活可以導致生物活性分子更大或更持續的分泌，從而導致骨形成的改善{Meirelles Lda，2009#58}。HS-2穩健擴增了從未分離的(unfractionated)骨髓吸出物中分離的hMSC由於HS-2在多能hMSC的培養擴增中證明了有效性，為了確定其直接臨床應用，我們接著設法確定從未分離的骨髓中直接分離的細胞是否還對HS-2補充正響應。來自三位獨立健康供體的吸出物含有塑料製品(plastic-adherent)附著的hMSC,在它們的增殖能力和它們的集落形成能力方面，hMSC對HS-2強烈響應(圖20A和B)，因此證實了通過所建立的hMSC培養所獲得的結果(圖15和16)。流式細胞評價顯示沒有細胞表達造血標誌物CD34或CD45 (數據未顯示)，但確實表達了 hMSC標誌物CD49a、CD73、CD105和STR0-1 (圖21C和D)。由於來源於骨髓單核細胞(BMMNC)的大部分CFU-F包含在具有高STR0-1表達(STRO-Γ亮)的細胞亞群內{Gronthos, 1995#31 ；Gronthos, 2003#9}，因此我們確定了 HS-2對STRO-1+胃細胞的比例的影響(圖21C和D)。HS-2擴增的細胞中的平均STRO-1+胃的含量為46. 4%，相比之下對照培養基中擴增的細胞為26. 6% (圖21D)。因此，HS-2優先促進包含在骨髓吸出物內的STRO-I+^hMSC亞群的擴增。為了進一步評價HS-2擴增hMSC的能力，將通過塑料製品粘附從三位骨髓供體分離的低傳代細胞在存在或不存在HS-2的情況下培養2周。在所有三種情況下，HS-2的補充加快了細胞數目的累積增加，這與先前在建立hMSC培養上的結果一致(圖15和16)。討論該研究的結果表明胚胎硫酸乙醯肝素(HS-2)可以用於優選真正hMSC的快速擴增而無需預期的免疫分選或使用始終導致非均勻培養的蛋白因子的可變混合物。此外，這些HS-2擴增的hMSC在植入到整形外科創傷的臨床相應模型中時表現出優良的治療應用。因此，HS-2作為獨立方法使用以選擇性富集並隨後增殖最具治療希望的hMSC亞群是特別有吸引力的。當前用於產生用於臨床使用的hMSC的策略依賴於通過對塑料製品的粘附對它們分離，並且隨後在將它們再植入前進行長時間離體擴增。由於成熟骨髓中hMSC極低的頻率，因此需要該過程{Caplan, 2009#59 ；Gronthos, 2003#9 ；Pittenger, 2004#6 ；Psaltis, 2010#102}。通過hMSC生長潛力的年齡相關損失{Ciapetti, 2006#735}和在分離和培養時多種hMSC仍保持靜止的事實{Terai，2005#38}進一步加劇了這種情況。照此，需要允許該特定亞群離體擴增的策略以實現有效處理方式。為了解決這種需要，已試驗了一定範圍的分離和擴增方法，其包括使用一定範圍抗-抗原的mAb的預期免疫選擇，所述抗原包括 STR0-1 {Dennis, 2002#736 ；Gronthos, 1994#740}、STR0-3 {Gronthos,2007#755}、CD49a{Rider,2007#508 ；Deschaseaux,2003#809}、CD146{Filshie, 1998#751 ；Shi,2003#747}、SSEA4{Gang, 2009#357}、LNGFR/CD271 {Jones, 2008#839}和 VCAM-I {Gronthos, 2003#9};使用一些因子的培養擴增，所述因子如 FGF-2{Solchaga, 2010#769 ； solchaga, 2005#15 ；ffalsh, 2000#18 ；Lee, 2009#376} 以及最近血小板來源產物{Avanzini, 2009#326 ；Capelli, 2007#510 ；Doucet, 2005#55 ；Kocaoemer, 2007#549 ；Schallmoser, 2007#516 ;Vogel, 2006#561}和限定專用培養基的使用{Hudson，2010#270}。儘管對這些策略進行了廣泛的研究，但它們還未得到廣泛接受。在免疫選擇的靶標中，STRO-1+胃亞群已顯示出對克隆源性基質細胞(CFU-F)的富集{Gronthos，1994#740}，但這需要長時間的細胞分選程序。相反，避免mAb基預選的HS-2處理在僅傳代一次後提高了 STRO-1+hMSC (包括STRO-1+胃亞群)的增殖。值得注意的，HS-2中的連續傳代導致STRO-I表達的進一步提高(從約45%提高至約70%)，這種提高未用標準培養條件重複。因此，在需要大規模hMSC擴增以獲得有效劑量的治療環境中，HS-2的存在將大大降低所需的培養時間。此外，HS-2優選已知作為有助於其治療價值的旁分泌因子來源的高度多能的hMCS的擴增{Caplan，2009#59}。的確，用HS-2擴增的hMSC處理的臨界性骨缺損表現出極大的骨修復改善，其中植入的細胞在缺損位點內存活多至7周。值得注意的，早在移植後3周時觀察到了明顯的新骨形成，但未觀察到我們先前所報導的處理差異性{Rai, 2010#155}。使用HS-2擴增hMSC還消除了對預分化細胞的需要，預分化細胞是在一些模型中似乎能改善癒合結果的策略。特別值得注意的是儘管使用HS-2補充實現了多能hMSC的大規模擴增，但是這些細胞保持了它們的免疫抑制能力{Meirelles Lda, 2009#58}，一種與體內較高存活機會有關的能力{Stenderup，2001#8}。外源FGF-2已表現出調節hMSC自我更新{Ahn，2009#850 ；Sotiropoulou, 2006#622 ；Tsutsumi, 2001#17}，但是其長期使用還提高了它們的異質性{Walsh, 2000#847}並上調了 HLA I 類和誘導了低 HLA-DR表達{Sotiropoulou，2006#622}，從而損害了其臨床使用。相反，我們表明連續補充HS-2類似地調節了 hMSC自我更新，還極大地改善了均一性水平，從而使其特別適合於在再生醫學中使用。可以通過消除如細菌、病毒和朊病毒的傳染物的一系列公認的酶促、化學和色譜步驟來提取和純化這些高度帶電的HS分子。與蛋白生長因子相反，HS對於一定範圍的生物加工程序是能夠恢復活力的，它是熱穩定的並且具有化學耐受性{Luong-Van，2007#854 ；Luong-Van, 2006#855}，從而使其不但很好地適合作為培養補充劑，而且還適合於一定範圍的生物醫學應用。HS-2極大地擴增hMSC製劑的使用具有低異質性和優良的再生潛能，這應使它們未來的臨床應用具有優勢。補充方法使用GUAVA PCA-96臺式流式細胞儀測定細胞。在每次傳代時並且在增殖測定期間，使用Viacount FLEX試劑和軟體確定細胞數目。對於表面標誌物的分析，將細胞胰蛋白酶化,封閉Ih (PBS、5%FCS、1%BSA和10%人血清)，在染色緩衝液(PBS、2%FCS、0. 02%NaN3)中再懸浮，並且與小鼠抗STR0-1 (R&D Systems)或者小鼠IgM對照(Caltag)緊接PE結合的山羊抗小鼠IgM (Caltag)或者與PE結合的小鼠抗人CD49a、CD73、CD105 (均來自BDbioscience)和IgG對照(Caltag)培育。然後,使用Guava軟體分析來自2000個事件的細胞。對於細胞周期分析，將細胞進行血清飢餓並如前所述更換培養基，然後在所提及的時間點之後胰蛋白酶化，在PBS/lmM EDTA中清洗兩次，在冰冷的甲醇中固定並在4°C儲存直至染色。將固定的細胞在染色緩衝液(參見上文)中清洗一次，在BD核糖核酸酶A/PI染色液(BD Bioscience)中染色並使用Guava軟體分析。對於細胞凋亡測定,將細胞培養8天,然後使用Guava軟體測量膜聯蛋白和AAD-7的表達。
分化測定。對於生脂分化，將細胞(18000個細胞/cm2)接種到12孔板中並培養至匯合，此時將培養基更換為添加或未添加(對照)I μ M地塞米松、10 μ M胰島素、20 μ M吲哚美辛和115 μ g/ml 3-異丁基-I-甲基黃嘌呤的脂肪細胞維持培養基(4500mg/l葡萄糖)，並且培養28天並用油紅O染色。對於成骨分化，將細胞(3000個細胞/cm2)接種到12孔板中保持24h，然後更換至添加或未添加(對照)IOnM地塞米松、IOmM β -甘油-磷酸酯和25 μ g/ml L-抗壞血酸-2-磷酸酯的維持培養基中，培養28天，並用茜素紅或鹼性磷酸酶染色。對於軟骨形成分化，將細胞(250000個細胞/管)在15ml管中在添加或未添加(對照)10ng/ml TGF- β 3的軟骨形成培養基(Cambrex)中成顆粒並培養28天，在此將細胞固定、包埋、封固並用Η&Ε和阿辛藍染色。在補充方法中描述了染色和組織學的詳細內容，該補充方法對應於Li et al1的方法。對於所有分化實驗，在第28天分離了總RNA並通過定量PCR分析系特異性基因表達。染色和組織學。甘油三酯的油紅O染色；將細胞在PBS中清洗並在4%多聚甲醛(PFA) (Sigma)在PBS中的溶液中固定lh，用水清洗，並用3. 6 μ g/ml油紅O (Sigma)在60%異丙醇中的溶液染色Ih並用水清洗。茜素紅染色；將細胞在PBS中清洗，在4%PFA中固定10分鐘，清洗並在O. 37%茜素紅(pH 4. I，Sigma)中染色30分鐘，再次清洗並空氣乾燥。按照生產商的說明書，使用白細胞鹼性磷酸酶試劑盒(Sigma)實施鹼性磷酸酶染色。將軟骨細胞顆粒在PBS中清洗並在4%PFA中固定，在O.C.T.中包埋並封固到載玻片上。用H&E和阿辛藍對固定並封固的軟骨細胞載玻片染色。在Olympus BX51顯微鏡上分析染色的細胞。FGF2ELISA。將細胞以3000/cm2鋪板，並根據我們前述的方法2在維持培養基(DMEMUg/Ι葡萄糖、10%FCS、2mM L-穀氨醯胺、50U/ml青黴素和50U/ml鏈黴素)中培養4天，在該維持培養基上除去培養基和基質結合蛋白並根據生產商的建議(R&D Systems)使用 FGF2QuantikineELISA 測量 FGF2 水平。RNA純化和相對定量PCR。使用Nucleospin II試劑盒(Macherey-Nagel)純化了來自後期培養(繼續培養，carry-on culture)的總RNA、脂肪細胞和成骨細胞。用PBS清洗軟骨細胞顆粒，用膠原酶II和IV處理,通過離心收集,在Trizol (Invitrogen)中再懸浮並分離RNA。評價RNA的質量和濃度並且根據生產商的建議使用Superscript III聚合酶(Invitrogen)將O. 5 μ g用於反轉錄。圖25顯示了用於定量PCR的Taqman引物/探針。使用Primer express (Applied Biosystems)設計並通過Proligo合成引物和探針。將探針序列修飾為雙重標記的LNA (FAM/BHQ-1)雜交探針，(在表中，探針序列中的大寫字母表示LNA核苷酸)。對於所有反應，將雙重標記MGB (VIC/TAMRA)標記的18S rRNA引物探針用作對照。通過瓊脂糖凝膠電泳分析所有PCR反應產物並測序以驗證擴增子的特異性。每次定量PCR反應(總計20 μ I)中含有80ng cDNA (參見材料和方法)、300mM正向和反向引物、250μ M探針(ΙΟΟμ M膠原酶2al探針是唯一的例外)和10μ I Taqman Universalmaster mix (Applied Biosystems)。以類似的方式使用50nM正向和50nM反向引物以及IOOnM 探針進行 18S rRNA 檢測。在 ABI Prism 7000 序列檢測系統(Applied Biosystems)上實施定量PCR反應，重複三次，其中在95°C進行初始10分鐘活化步驟，隨後按照以下條件分別循環45次，950C，20秒；55°C，10秒；60°C，30秒；72°C，40秒。通過將基因的2(-Drt)值歸一化為18S的2(_Dc;t)值並乘以IO6來計算相對表達單元。奇異值分解·這構成了獲取原始數據中所存在的最大信息的數據集向新降維空間的線性投影的基礎(即主成分分析)。幹細胞陣列數據的局部加權回歸(LOESS)歸一化。來源於基於基因雜交技術的強度測定經常會受基因晶片間變化的影響，這妨礙了單個基因的有意義的比較。這些晶片間變化需要將晶片強度調整至常規分布。通過雜交中恆定全局差異的強度縮放的廣泛使用的替代方法是使用LOESS平滑函數3將線性加性模型擬合至對數轉化的基因強度值。然後，使用擬合的強度來推斷微分式。我們首先通過對照之間的比較檢驗了改變相鄰參數(α )對平滑函數的影響。對於0. α < 0.8的範圍，未觀察到數據圖曲率的根本改變。然後，選擇了守恆值或α=0. 2並應用於所有陣列。MA圖僅顯示了圖中中等程度的改變(參見圖27中Ctrl-d21相對於Ctrl-d32)，其中影響對於微分式的極值要更顯著(圖27-29)。幹細胞陣列數據的奇異值分解。在這些實驗中使用的基因表達微陣列數據是包括數百個基因及其共表達的高維度數據集。儘管這似乎是複雜的，但是區分HS-2和對照的大部分重要分子信息實際上是作為多個簡單並且基礎的模式(pattern)存在的。我們希望在數據集內發現最信息性的模式(或奇異向量)並使用它們通過奇異值分解獲得HS-2對乾性影響的穩健定義。在奇異值分解4前，首先通過採用其協方差矩陣對表示由行上的m個獨立實驗條件(硫酸乙醯肝素相對於對照的處理)和列上的η個變量(每個陣列上的基因)組成的幹細胞陣列數據的矩陣A進行預處理。該矩陣分解如下
「02771 A=USVf.(1)其中S是由矩陣A' A CA'表示A的轉置)的奇異值(λ ^ λ 2. . . λ η)組成的對角矩陣。U和V的列分別是對應於矩陣A' A和AA'的奇異向量。U和V均是正交矩陣，從而如下給出了這些向量上的投影C C = USV' V = AV = US (2)
因此，通過下式給出了與第一 t向量Var有關的方差的比例
權利要求
1.通過在存在HS-2的情況下的細胞培養所獲得的間充質幹細胞在製備用於治療骨折的藥物中的用途。
2.根據權利要求I所述的用途，其中所述藥物在加強的間充質幹細胞介導的骨折修複方法中使用。
3.根據權利要求2所述的用途，其中所述加強的間充質幹細胞介導的骨折修復包括相對於通過使用由在不存在HS-2的情況下的培養所獲得的間充質幹細胞的治療所獲得的骨折修復速度，骨折修復速度的改善。
4.通過在存在HS-2的情況下的培養所獲得的間充質幹細胞，用在骨折治療方法中。
5.一種藥物組合物，包含通過在存在HS-2的情況下的培養所獲得的間充質幹細胞，其中所述藥物組合物在骨折治療方法中使用。
6.根據權利要求4所述的間充質幹細胞或根據權利要求5所述的藥物組合物，其中所述間充質幹細胞或包括間充質幹細胞的藥物組合物在包含加強的間充質幹細胞介導的骨折修復的治療方法中使用。
7.根據權利要求6所述的間充質幹細胞或藥物組合物，其中所述加強的間充質幹細胞介導的骨折修復包括相對於通過使用由在不存在HS-2的情況下的培養所獲得的間充質幹細胞的治療所獲得的骨折修復速度，骨折修復速度的改善。
8.—種生物相容性植入物或假體，其包含生物材料和通過在存在HS-2的情況下的培養所獲得的間充質幹細胞。
9.根據權利要求8所述的植入物或假體，其中所述植入物或假體塗覆有通過在存在HS-2的情況下的培養所獲得的間充質幹細胞。
10.根據權利要求8所述的植入物或假體，其中所述植入物或假體浸潰有通過在存在HS-2的情況下的培養所獲得的間充質幹細胞。
11.一種形成生物相容性植入物或假體的方法，所述方法包括用通過在存在HS-2的情況下的培養所獲得的間充質幹細胞塗覆或浸潰生物材料的步驟。
12.—種治療受試者骨折的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的通過在存在HS-2的情況下的培養所獲得的間充質幹細胞。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述方法是加強的間充質幹細胞介導的骨折修複方法，所述方法包括相對於通過使用由在不存在HS-2的情況下的培養所獲得的間充質幹細胞的治療所獲得的骨折修復速度，骨折修復速度的改善。
14.根據權利要求12或13所述的方法，其中在施用間充質幹細胞之前，所述方法包括與HS-2接觸培養幹細胞以產生所述治療有效量的間充質幹細胞。
15.根據權利要求14所述的方法，還包括將所述治療有效量的間充質幹細胞配製為藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包含通過在存在HS-2的情況下的培養所獲得的間充質幹細胞和可藥用載體、佐劑或稀釋劑，其中將所述藥物組合物施用給所述受試者。
16.根據權利要求12至15中任一項所述的方法，其中所述方法包括將所述間充質幹細胞或藥物組合物施用至骨折周圍的組織。
17.根據權利要求12至15中任一項所述的方法，其中所述間充質幹細胞或藥物組合物的施用包括將所述間充質幹細胞或藥物組合物注射到骨折周圍的組織。
18.一種治療受試者骨折的方法，所述方法包括通過手術將生物相容性植入物或假體植入到所述受試者骨折位點處或骨折位點周圍的組織，所述植入物或假體包含生物材料和通過在存在HS-2的情況下的培養所獲得的間充質幹細胞。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述植入物或假體塗覆有通過在存在HS-2的情況下的培養所獲得的間充質幹細胞。
20.根據權利要求18所述的方法，其中所述植入物或假體浸潰有通過在存在HS-2的情況下的培養所獲得的間充質幹細胞。
全文摘要
在存在HS-2的情況下培養的間充質幹細胞用於治療骨折的用途。與使用無HS-2培養的間充質細胞的骨折治療相比，使用這些細胞的骨折修復得到加強。可以將這些間充質幹細胞配製到藥物組合物中並直接注射到骨折周圍的組織或在生物相容性植入物或假體中使用。
文檔編號A61K31/727GK102971414SQ201080064450
公開日2013年3月13日 申請日期2010年12月22日 優先權日2009年12月22日
發明者西蒙·庫爾, 維克託·努爾科姆比 申請人:新加坡科技研究局