旱半夏組織培養快速繁殖方法
2023-12-12 00:32:22 1
專利名稱：旱半夏組織培養快速繁殖方法
技術領域：
本發明屬於生物技術工程領域，具體涉及一種旱半夏組織培養快速繁殖技術。
背景技術：
半夏[Pinellia ternate (Thunb. ) Breit.]屬天南星科半夏屬植物，以乾燥塊莖入 藥，是一種重要的中藥材，具有降逆止吐、燥溼化痰、消痞散結等功能，多用於治療痰喘咳、 噁心嘔吐、眩暈等，近年發現半夏蛋白有抗早孕和抗腫瘤作用，目前國內全年用量就達5000 噸，是多年來緊缺的中藥材之一。藥用旱半夏幾乎都來自野生，我國雖具有豐富的野生旱半 夏種質資源，但由於旱半夏藥用和出口需求量大，造成野生資源日益枯竭難以滿足要求，價 格持續上揚，居高不下。目前，雖有人工栽培種植旱半夏可以緩解市場壓力，但由於旱半夏 生長要求陰溼環境，在災害性天氣較多的年份，會造成收穫量不足的情況，這對旱半夏的生 產造成極大限制。另外，旱半夏連作種植易導致病毒侵染，種性退後，產量和品質下降。因 此，考慮使用植物組培快繁技術進行旱半夏種苗生產並進行人工種植是解決旱半夏資源短 缺的有效途徑。 目前，現有技術中未見有完整關於旱半夏外植體選擇、愈傷組織誘導、器官分化誘 導、碳源濃度選擇的整套組培技術方案的報導。
發明內容
本發明的目的在於提供一種旱半夏組織培養快速繁殖方法。利用本發明的方法對
旱半夏進行大規模快繁，以解決旱半夏在天然狀態下繁殖困難以及旱半夏資源日益匱乏問
題，實現旱半夏的大規模人工種植，提高旱半夏儲量。 為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案 旱半夏組織培養快速繁殖技術，包括以下步驟 1)配製培養基，基本培養基和其它組培階段培養基的各組分與每升所含重量為
基礎培養基用MS培養基，附加蔗糖15-45g/L，瓊脂10g/L， pH5. 8 ;
愈傷組織誘導培養基:MS中添加KT 1. 0-3. Omg/L和2， 4-D 1. 0-3. Omg/L ;
分化培養基MS中添加KT 1. 0-3. Omg/L禾卩2， 4—D 1. 0—3. Omg/L ;
增殖培養基MS中添加KT 0. 2-2. Omg/L和2， 4-D 0. 2-2. Omg/L
生根培養基:MS中添加KT 1. 0-2. Omg/L和NAA 0-1. Omg/L ; 2)培養無菌苗將旱半夏塊莖滅菌處理後，將其切成5mm大小的小塊，接種在 MS+KT 2. 0mg/L+2 ， 4-D 2. Omg/L培養基上得到愈傷組織後，移至MS+KT 3. 0mg/L+2 ， 4-D 1. Omg/L培養基上使其分化，分化的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊)後接種到MS培 養基上繼續生長得到大量無菌苗； 3)誘導愈傷組織將步驟2)培養出的無菌苗的葉片、葉柄和愈傷組織塊，在無菌
條件下切成5mm大小，接種在愈傷組織誘導培養基上，誘導形成愈傷組織； 4)分化培養將步驟3)誘導形成的愈傷組織移至分化培養基上使其分化出芽；
5)增殖培養將步驟4)誘導形成的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊)移至 增殖培養基上再分化出叢芽； 6)生根培養將步驟5)增殖形成的單芽(包含基部愈傷組織塊)切下，接種在生 根培養基中進行生根培養； 7)移栽當步驟6)的生根組培苗生長至3-5cm，根數在5根以上時，移栽入基質，
在溫室中培養至成苗。 所述步驟2)旱半夏萌發無菌苗的方法是選旱半夏塊莖，用75X的乙醇浸泡45s 後，用0. 1 %的升汞消毒15min，無菌水衝洗5次後接種到培養基上，在溫度為25°C ，光照 2000Lx，光周期12h/d下培養30天。
所述步驟7)中栽培基質由腐殖土 珍珠巖按體積比i : i配製而成。
本發明旱半夏組織培養快速繁殖技術。可更具體地概括為 (1)從大田直接採集旱半夏的塊莖作為外植體，消毒過後在接種到培養基上獲得 無菌苗，然後分別以其葉片、葉柄和塊莖作為外植體誘導愈傷組織。旱半夏塊莖先用75%的 酒精浸泡45s，再用0. 1 %的升汞消毒15min，使用無菌水清洗5次，將其切成5mm大小的小 塊，接種在MS+KT 2. 0mg/L+2， 4-D 2. Omg/L培養基上得到愈傷組織後，移至MS+KT 3. Omg/ L+2，4-D 1.0mg/L使其分化，分化的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊)後使其在MS培 養基上繼續生長。在溫度為25°C ，光照2000Lx， 12h/d的光周期條件下培養30天，即可長出 旱半夏無菌苗。 (2)分別以步驟(1)的旱半夏無菌苗的葉片、葉柄或愈傷組織塊為外植體，接入到 MS添加KT、2，4-D和蔗糖的培養基中，其中，MS培養基中KT的濃度為1.0-3. 0mg/L，2，4-D 的濃度為1. 0-3. Omg/L，蔗糖的濃度為15-45mg/L，培養基的pH值為5. 8，瓊脂量為10g/L， 在溫度12rC下滅菌20min，冷卻培養基，在25°C ，光照2000Lx，光周期12h/d下培養，誘導 出愈傷組織。 (3)將步驟(2)中產生的胚性愈傷組織接入MS添加KT、2，4-D和蔗糖的培養基上，
其中MS培養基中KT的濃度為1. 0-3. 0mg/L，2，4-D的濃度為1. 0-3. Omg/L，蔗糖的濃度為
15-45g/L，在25°C ，光照2000Lx，光周期12h/d下培養15天，即可萌發出不定芽。 (4)將步驟(3)中萌發出的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊)，接入MS添加
KT、2，4-D和蔗糖的培養基上，其中MS培養基中的濃度為KT 0. 2_2. Omg/L， 2， 4-D的濃度為
0. 2-2. Omg/L，蔗糖的濃度為30g/L，在25。C，光照2000Lx，光周期12h/d下培養15天，再次
萌發出大量不定芽。 (5)將步驟(4)中萌發出的單芽(包含基部愈傷組織塊)切出，轉入MS添加KT和 NAA的培養基中進行生根培養基中，其中，MS培養基中KT的濃度為1. 0-2. Omg/L， NAA的濃 度為0-0. 5mg/L，在25°C ，光照2000Lx，光周期12h/d下培養10天後生根率可達90%以上。
(6)當步驟(5)中已生根的旱半夏組培苗生長至3-5cm，根數5根以上時，移栽基 質培養至成苗，其中基質是由腐殖土 珍珠巖按體積比1 : 1配製。
所述的步驟(2)是利用鹽酸或氫氧化鉀調整pH值。 本發明的優越性在於利用大規模組織培養技術快速繁殖旱半夏幼苗，通過無菌苗 的培養、以不同部位的外植體誘導愈傷組織，並使其再生出植株。本發明芽和根的最高分化 率都達90%以上，苗移栽成活率也達90%以上。通過大規模組培快繁旱半夏，可以擴大旱
4半夏種植面積，提高旱半夏的產量，推動旱半夏產業鏈的健康發展。
具體實施例方式
下面用本發明的實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但並不以此來限定本發明。 實施例1 (以旱半夏葉片為外植體) 先用旱半夏塊莖使其愈傷分化培養得到無菌苗，然後以其葉片為外植體誘導愈傷組織。 (1)旱半夏萌發無菌苗的方法為將旱半夏塊莖用75X的酒精浸泡45s，再用
0. 1 %的升汞消毒15min，最後使用無菌水衝洗5次，將其切成5mm大小的小塊，接種在MS+KT 2. 0mg/L+2 ， 4-D 2. 0mg/L培養基上得到愈傷組織後，移至MS+KT 3. 0mg/L+2 ， 4-D
1. Omg/L培養基上使其分化，分化的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊)後使其在MS培養基上繼續生長。在溫度為25t:，光照2000Lx，光照12h/d下培養30天之後，即可得到旱半夏無菌苗。 (2)以步驟(1)的旱半夏無菌苗葉片為外植體接入到MS添加了 KT、2，4-D和蔗糖的培養基中，其中蔗糖的濃度為30克每升，利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調整培養基pH5.8，瓊脂的用量為IO克每升，在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘，冷卻培養基，在25t:，光照2000Lx，光周期12h/d下培養15天，誘導出旱半夏的愈傷組織，愈傷誘導率為52.9%。
(3)將步驟(2)中葉片誘導形成的胚性愈傷接入MS添加了 KT、2，4-D和蔗糖的培養基上，其中蔗糖的濃度為30克每升，利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調整培養基pH5. 8，瓊脂的用量為10克每升，在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘，冷卻培養基，在溫度25t:，光照2000Lx，光周期12h/d下培養15天，即可萌發出芽。芽分化率可達93% 。
(4)將步驟(3)中萌發出的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊)，接入MS添加KT、2，4-D和蔗糖的培養基上，其中蔗糖的濃度為30克每升，利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調整培養基pH5. 8，瓊脂的用量為10克每升，在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘，冷卻培養基，在25t:，光照2000Lx，光周期12h/d下培養15天，再次萌發出芽，芽再分化率為92. 5% 。
(5)將步驟(4)中萌發出的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊)轉入生根培養基中生根，生根培養基是使用MS添加KT、 NAA和蔗糖的培養基，其中蔗糖的濃度為30克每升，利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調整培養基PH5. 8，瓊脂的用量為10克每升，在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘，冷卻培養基，在25°C ，光照2000Lx，光周期12h/d下，MS+KT 2. Omg/L+NAA0. 5mg/L培養10-15天後，生根率達96%。 (6)當生根的旱半夏組培苗生長至3-5cm，根數5根以上時，移栽入由腐殖土 珍珠巖按體積比l : l配製而成的基質中培養，定期肥水管理，旱半夏長勢良好，成活率可達90%以上。 實施例2 (以旱半夏葉柄為外植體) 先用旱半夏使其愈傷分化培養得到無菌苗，然後以其葉柄為外植體誘導愈傷組織。 (1)旱半夏萌發無菌苗的方法為將旱半夏塊莖用75X的酒精浸泡45s，再用0. 1 %的升汞消毒15min，最後使用無菌水衝洗5次，將其切成5mm大小的小塊，接種在MS+KT 2. Omg/L+2 ， 4_D 2. 0mg/L培養基上得到愈傷組織後，移至MS+KT 3. Omg/L+2 ， 4_D1. Omg/L使其分化，分化的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊)後使其在MS培養基上繼續生長。在溫度為25t:，光照2000LX下培養30天之後，即可得到旱半夏無菌苗。
(2)以步驟(1)的旱半夏無菌苗的葉柄為外植體直接接入到MS添加了 KT、2，4-D和蔗糖的培養基中，其中蔗糖的濃度為30克每升，利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調整培養基pH5.8，瓊脂的用量為10克每升，在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘，冷卻培養基，在25t:，光照2000Lx，光周期12h/d下培養，誘導出愈傷組織。MS+KT1. Omg/L+2. 4_D 1. Omg/L的愈傷誘導率為57%。 (3)將步驟(2)中葉柄誘導形成的胚性愈傷接入MS添加了 KT、2，4-D的培養基上，其中蔗糖的濃度為30克每升，利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調整培養基pH5. 8，瓊脂的用量為10克每升，在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘，冷卻培養基，在25°C ，光照2000Lx，光周期12h/d下培養15天，即可萌發出芽。MS+KT 3. Omg/L+2. 4-D1. Omg/L的芽分化率為93%。
(4)將步驟(3)中萌發出的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊)，接入MS添加KT、2，4-D和蔗糖的培養基上，其中蔗糖的濃度為30克每升，利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調整培養基PH5. 8，瓊脂的用量為10克每升，在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘，冷卻培養基，在25。C，光照2000LX，光周期12h/d下培養15天，再次萌發出芽。MS+KT 1. Omg/L+2. 4-D0. 3mg/L的芽再分化率為97%。 (5)將步驟(4)中萌發出的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊)轉入生根培養基中生根，生根培養基是使用MS添加KT、 NAA和蔗糖的培養基，其中蔗糖的濃度為30克每升，利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調整培養基pH5. 8，瓊脂的用量為10克每升，在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘，冷卻培養基，在25°C ，光照2000Lx，光周期12h/d下，MS+KT 2. Omg/L+NAA0. 5mg/L培養10-15天後，生根率可達100%。 (6)當生根的旱半夏組培苗生長至3-5cm，根數5根以上時，移栽入由腐殖土 珍珠巖按體積比l : l配製而成的基質中培養，定期肥水管理，旱半夏長勢良好，成活率可達90%以上。 實施例3 (以旱半夏愈傷塊為外植體) 先用旱半夏使其愈傷分化培養得到無菌苗，然後以其愈傷塊為外植體繼續誘導成愈傷組織。 (1)旱半夏萌發無菌苗的方法為將旱半夏塊莖用75X的酒精浸泡45s，再用0. 1 %的升汞消毒15min，最後使用無菌水衝洗5次，將其切成5mm大小的小塊，接種在MS+KT 2. 0mg/L+2 ， 4-D 2. Omg/L培養基上得到愈傷組織後，移至MS+KT 3. 0mg/L+2 ， 4-D1.0mg/L使其分化，分化的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊)後使其在MS培養基上繼續生長。在溫度為25t:，光照2000Lx下培養30天之後，即可得到旱半夏無菌苗。
(2)以步驟(1)的旱半夏愈傷塊為外植體直接接入到MS添加了 KT、2，4-D和蔗糖的培養基中，其中蔗糖的濃度為30克每升，利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調整培養基pH5.8，瓊脂的用量為10克每升，在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘，冷卻培養基，在25°C ，，光照2000Lx，光周期12h/d下培養，誘導出旱半夏的愈傷組織。MS+KT 2. Omg/L+2. 4-D 2. Omg/L的愈傷誘導率為93%。 (3)將步驟(2)中愈傷塊誘導形成的胚型愈傷接入MS添加了 KT、2，4-D的培養基上，其中蔗糖的濃度為30克每升，利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調整培養基pH5. 8，瓊脂的用量為10克每升，在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘，冷卻培養基，在25°C，，光照2000Lx，光周期12h/d下培養15天，即可萌發出芽。MS+KT3. Omg/L+2. 4-D 1. Omg/L的芽分化率為96%。
(4)將步驟(3)中萌發出的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊)，接入MS添加KT、2，4-D和蔗糖的培養基上，其中蔗糖的濃度為30克每升，利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調整培養基PH5. 8，瓊脂的用量為10克每升，在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘，冷卻培養基，在25。C，光照2000Lx，光周期12h/d下培養15天，再次萌發出芽。MS+KT 1. Omg/L+2. 4-D0. 3mg/L的芽再分化率為98%。 (5)將步驟(4)中萌發出的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊)轉入生根培養基中生根，生根培養基是使用MS添加KT、 NAA和蔗糖的培養基，其中蔗糖的濃度為30克每升，利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調整培養基pH5. 8，瓊脂的用量為10克每升，在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘，冷卻培養基，在25°C ，光照2000Lx，光周期12h/d下，MS+KT 2. Omg/L+NAA0. 5mg/L培養10-15天後，生根率可達100%。 (6)當生根的旱半夏組培苗生長至3-5cm，根數5根以上時，移栽入由腐殖土 珍珠巖按體積比l : l配製而成的基質中培養，定期肥水管理，旱半夏長勢良好，成活率可達90%以上。 實施例4(以旱半夏塊莖為外植體得出碳源濃度影響的結果) 先用旱半夏塊莖愈傷分化得到無菌苗，然後以其愈傷塊為外植體誘導坯性愈傷組織。 (1)旱半夏萌發無菌苗的方法為將旱半夏塊莖用75X的酒精浸泡45s，再用0. 1 %的升汞消毒15min，最後使用無菌水衝洗5次，將其切成5mm大小的小塊，接種在MS+KT 2. 0mg/L+2 ， 4-D 2. Omg/L培養基上得到愈傷組織後，移至MS+KT 3. 0mg/L+2 ， 4-D1.0mg/L使其分化，分化的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊)後使其在MS培養基上繼續生長。在溫度為25t:，光照2000Lx下培養30天之後，即可得到旱半夏無菌苗。
(2)以步驟(1)的的旱半夏愈傷塊為外植體直接接入到MS添加了 KT 2. 0mg/L、2，4-D 2.0mg/L和蔗糖的培養基中，其中蔗糖的濃度為分別為15， 30， 45克每升，利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調整培養基PH5. 8，瓊脂的用量為10克每升，在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘，冷卻培養基，在溫度25°C ，光照2000Lx，光周期12h/d下培養，誘導旱半夏產生愈傷組織。結果發現，45g/L時旱半夏塊莖的愈傷組織誘導率為85%，在此濃度範圍內愈傷組織誘導率與蔗糖濃度成正比。 (3)將步驟(2)中愈傷塊誘導形成的胚型愈傷組織接入MS添加KT 3. 0mg/L、2，4-D 1.0mg/L和蔗糖的培養基上，其中蔗糖的濃度為分別為15，30，45克每升，利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調整培養基PH5. 8，瓊脂的用量為10克每升，在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘，冷卻培養基，在25t:，光照2000Lx，光周期12h/d下培養15天，即可萌發出芽。蔗糖含量為40g/L時，芽的分化率最高為90%。 (4)將步驟(3)中萌發出的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊)，接入MS添加2，4-D、KT和蔗糖的培養基上，其中蔗糖的濃度為30克每升，利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調整培養基PH5.8，瓊脂的用量為10克每升，在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘，冷卻培養基，在25。C，光照2000Lx，光周期12h/d下培養15天，再次萌發出芽。在MS+KT 1. Omg/L+2. 4-D0. 3mg/L的芽分化率分別為98%。 (5)將步驟(4)中萌發出的叢芽切成單芽(包含基部愈傷組織塊)轉入生根培養基中生根，生根培養基是使用MS添加KT和NAA的培養基，其中蔗糖的濃度為30克每升，利用鹽酸和氫氧化鉀溶液調整培養基pH5. 8，瓊脂的用量為10克每升，在溫度121攝氏度下滅菌20分鐘，冷卻培養基，在25°C ，光照2000Lx，光周期12h/d下MS+KT 2. Omg/L+NAA 0. 5mg/L培養10-15天後，生根率可達100%。 (6)當生根的旱半夏組培苗生長至3-5cm，根數5根以上時，移栽入由腐殖土 珍珠巖按體積比l : l配製而成的基質中培養，定期肥水管理，旱半夏長勢良好，成活率可達90%以上。
權利要求
旱半夏組織培養快速快繁方法，包括以下步驟1)配製培養基，基本培養基和其它組培階段培養基的各組分與每升所含量為基本培養基用MS培養基，附加蔗糖15-45g/L，瓊脂10g/L，調節pH5.8；愈傷組織誘導培養基MS中添加KT 1.0-3.0mg/L和2，4-D 1.0-3.0mg/L；分化培養基MS中添加KT 1.0-3.0mg/L和2，4-D 1.0-3.0mg/L；增殖培養基MS中添加KT 0.2-2.0mg/L和2，4-D 0.2-2.0mg/L；生根培養基MS中添加KT 1.0-2.0mg/L和NAA 0-1.0mg/L；2)培養無菌苗將旱半夏塊莖進行滅菌處理後，切成5mm左右的小塊，將其移至MS+KT 2.0mg/L+2，4-D 2.0mg/L的培養基上產生愈傷，其後轉入MS+KT3.0mg/L+2，4-D 1.0mg/L的培養基上使其分化，將產生的叢芽塊，再將其切成單芽塊移至MS基本培養基上生長得到無菌苗；3)誘導愈傷組織在無菌條件下，將步驟2)培養出的無菌苗的葉片、葉柄及愈傷組織塊切成5mm大小的組織，接種在愈傷組織誘導培養基上，誘導形成愈傷組織；4)分化培養將步驟3)誘導形成的愈傷組織移至分化培養基上使其分化出芽；5)增殖培養將步驟4)生成的叢芽切成單芽(包含基部的愈傷組織塊)，接種至增殖培養基上進行增殖培養，使其再分化出芽；6)生根培養將步驟5)形成的叢芽塊切成單芽(包含基部的愈傷組織塊)，接種在生根培養基中進行生根培養；7)移栽當步驟6)的生根組培苗生長至3-5cm，根數在5根以上時，移栽入基質中，在溫室中培養至成苗。
2. 根據權利要求l所述的方法，其特徵在於所述步驟2)旱半夏萌發無菌苗的方法是 選旱半夏塊莖，用75 %的乙醇浸泡45s後，用0. 1 %的升汞消毒15min，無菌水衝洗5次後接 種到培養基上，在溫度為25t:，光照2000Lx，光周期12h/d下培養30天，得到無菌苗。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述步驟7)中栽培基質由腐殖土 珍珠 巖按體積比l:l配製而成。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述基本培養基和組培各階段培養基各 組分與每升所含重量為1) 基本培養基MS基本培養基，蔗糖15-45g/L，瓊脂10g/L， pH5. 8 ;2) 愈傷組織誘導培養基以葉片為外植體時，MS+KT 3. 0mg/L+2，4-D 1. Omg/L ; 以葉柄為外植體時，MS+KT 1. Omg/L+2. 4-D 1. Omg/L ; 以土央莖為外植體時，MS+KT `2. Omg/L+2. 4-D 2. Omg/L ;3) 分化培養基MS+KT 3. Omg/L+2. 4-D 1. Omg/L ;4) 增殖培養基MS+KT 1. Omg/L+2. 4-D 0. 3mg/L ;5) 生根培養基MS+KT 2. Omg/L+NAA 0. 5mg/L。
全文摘要
本發明涉及一種旱半夏組織培養快速繁殖方法。利用組織培養技術誘導無菌旱半夏塊莖產生愈傷組織並分化產生無菌苗，然後取無菌苗的葉片、葉柄及愈傷組織塊作為外植體，再經愈傷組織誘導、分化培養，增殖培養，生根培養後，大量繁殖旱半夏組培苗。本發明外植體來源豐富，體積較大，接種成活率高，操作簡單快捷，繁殖係數高，速度快，適合工廠化育苗。
文檔編號A01H4/00GK101720670SQ20091021838
公開日2010年6月9日 申請日期2009年12月17日 優先權日2009年12月17日
發明者屈文國, 李昆志, 王藝霖, 陳麗梅 申請人:昆明理工大學