一種菸草黑脛病菌的簡便分離方法
2024-03-01 18:13:15
專利名稱：一種菸草黑脛病菌的簡便分離方法
技術領域：
本發明屬於農業微生物分離技術領域，具體涉及一種利用簡易的設備或條件高 效、快速分離菸草黑脛病菌的簡便分離方法。
背景技術：
菸草黑脛病(tobacco black shank)是世界菸草生產中危害最嚴重的病害之一， 特別是在溫帶、亞熱帶和熱帶發生較重，也是我國菸草的主要病害之一。菸草黑脛病病原 的分離方法通常是在發病田塊採集病株，在實驗室利用選擇性培養基平板分離病菌(鄭小 波，疫黴菌及其研究技術，北京，中國農業出版社，1997，P84-85)。因此，這種病樣採集與病 菌分離往往存在3 7天或者更長的時間差，病樣在此期間極容易受到其它雜菌的汙染，致 使一些病樣的病菌分離失敗。而且分離需要消毒、採用選擇性培養基，操作比較煩瑣。為 此，本發明人針對現有技術的不足，根據典型病樣的特點，研製開發了一種適合于田間採集 病樣並即時分離病菌的簡便分離方法，實驗證明，應用效果良好。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供了一種工藝簡便，適合于田間作業 條件下簡易環境應用的菸草黑脛病菌的簡便分離方法。本發明的目的是這樣實現的利用簡易設備和簡陋的空間條件營造潔淨工作環 境，快速分離菸草黑脛病菌，具體包括以下步驟A、病株選擇與採集選擇田間症狀典型，無其它症狀，病莖無開裂或未被人為剖 開，即呈碟片狀的病髓片被密封包裹於健康莖杆中的病株作為目標病株；採集時去莖頂、葉 片和根，僅留取病莖，衝洗表面浮塵後晾乾，每根病莖分別用滅菌的衛生紙包裹分隔，置於 一次性使用的乾淨封口袋內；B、淨化工作環境選擇不通風的室內，用潔淨水噴霧沉降空氣中的塵埃，達到分離 所需的空氣環境要求；分離前，用點燃的酒精燈火焰滅菌形成無菌小環境；C、病菌分離從上部剖開病莖，兩手抓住病莖上端，扳開病莖至呈碟片狀的病髓片 露出；用火焰滅菌的彎頭鑷子夾取呈碟片狀的病髓片，置於火焰下的培養基平板內，每個採 樣點用3 5個培養基平板，每個平板上放置病髓片3 5片；D、對分離的病菌進行室溫培養，根據菌落形態挑選目標病菌。E、病菌鑑定採用孢子灌根法或菌谷法接種感病品種紅花大金元進行病菌鑑定， 病情嚴重度大於1的菌株就有致病性。分離的病菌可採用水浸菌絲塊法於6 10°C恆溫條件下保存，通常可保存1 2 年。分離病菌的致病性可用孢子灌根法[梁元存，劉延榮，王玉軍，王智發，張廣民。菸草黑 脛病菌致病性分化和菸草品種的抗病性差異，植物保護學報，2003，30(2) 143-147]或菌 谷法(GB/T 23224-2008菸草品種抗病性鑑定)進行驗證。本發明適用于田間採樣後的即時病菌分離，整個操作所用設備簡單，在不具備微
3生物實驗室的條件下也可開展分離工作，分離病菌的純度高，保持了病菌野生型的特性。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但不以任何方式對本發明加以限定， 任何基於本發明技術思路的等同替換，均落入本發明的保護範圍。本發明利用簡易設備和簡陋的空間條件營造潔淨工作環境，快速分離菸草黑脛病 菌，具體包括以下步驟A、病株選擇與採集選擇田間症狀典型，無其它症狀，病莖無開裂或未被人為剖 開，即呈碟片狀的病髓片被密封包裹於健康莖杆中的病株作為目標病株；採集時去莖頂、葉 片和根，僅留取病莖，衝洗表面浮塵後晾乾，每根病莖分別用滅菌的衛生紙包裹分隔，置於 一次性使用的乾淨封口袋內；B、淨化工作環境選擇不通風的室內，用潔淨水噴霧沉降空氣中的塵埃，達到分離 所需的空氣環境要求；分離前，用點燃的酒精燈火焰滅菌形成無菌小環境；C、病菌分離從上部剖開病莖，兩手抓住病莖上端，扳開病莖至呈碟片狀的病髓片 露出；用火焰滅菌的彎頭鑷子夾取呈碟片狀的病髓片，置於火焰下的培養基平板內，每個採 樣點用3 5個培養基平板，每個平板上放置病髓片3 5片；D、對分離的病菌進行室溫培養，根據菌落形態挑選目標病菌。E、病菌鑑定採用孢子灌根法或菌谷法接種感病品種紅花大金元進行病菌鑑定， 病情嚴重度大於1的菌株就有致病性。所述的病菌分離中病髓片放置所用培養基平板直徑為6 9cm，平板打開角度為 10° 15°，病髓片每片放置的時間為3 5s。所述的室溫培養是將培養基平板用封口膜封口，3 5個平板一起置於密封的培 養盒內，室溫條件培養3 5天，然後根據菌落形態挑選目標病菌。所述的培養基為燕麥培養基或利馬豆培養基。所述的燕麥培養基的組成為燕麥片30g，瓊脂17 20g，蒸餾水1000ml。所述的利馬豆培養基的組成為利馬豆60g，瓊脂17 20g，蒸餾水IOOOml。實施例1選擇田間症狀典型，無其它症狀，病莖無開裂或未被人為剖開，即病髓片呈碟片狀 被密封、包裹於健康莖杆中的病株作為目標病株，採集時去莖頂、葉片和根，僅留取病莖，衝 洗表面去浮塵，晾乾，每根病莖分別用滅菌的衛生紙包裹分隔，置於一次性使用的乾淨封口 袋內。在潔淨的環境下進行病菌分離，首先從莖上部剖開病莖，兩手抓住病莖上端，扳開病 莖，至呈碟片狀的病髓片露出。然後用火焰滅菌的彎頭鑷子夾取病髓片，置於火焰下的燕麥 培養基平板內；所用培養基平板直徑為6 9cm，平板打開角度為10° 15°，病髓片每片 放置的時間為3 5s ；每個採樣點用3 5個平板進行分離，每個平板放病髓片3 5片。 將平板用封口膜封口，3 5個平板一起置於密封的培養盒內，室溫條件下培養3 5天，根 據純白色的菌落形態挑選目標病菌。分離病菌的致病性用孢子灌根法接種感病品種紅花大 金元進行驗證，病情嚴重度大於1(GB/T 23222-2008菸草病蟲害分級及調查方法)的菌株 就有致病性。實施例2
4
用利馬豆培養基平板代替燕麥培養基平板，其餘同實施例1。實施例3按實施例1的方式選擇病莖、分離病髓片並進行室溫培養，根據純白色的菌落形 態挑選目標病菌。分離病菌的致病性用菌谷法接種感病品種紅花大金元進行驗證，病情嚴 重度大於1的菌株就有致病性。實施例4按實施例2的方式選擇病莖、分離病髓片並進行室溫培養，根據純白色的菌落形 態挑選目標病菌。分離病菌的致病性用菌谷法接種感病品種紅花大金元進行驗證，病情嚴 重度大於1的菌株就有致病性。發明的工作原理和特點本發明利用黑脛病菌從根莖部侵染、蔓延至莖髓部的特性，以健康組織包裹的內 部病組織為分離材料，與國內同類分離方法相比優點表現在1、本發明提供的一種菸草黑脛病菌簡便分離方法更適用于田間採樣的及時分離， 整個操作所用設備簡單，在不具備微生物實驗室的條件下也可開展分離工作。2、本發明中使用的培養基平板在嚴格的微生物實驗條件下製備，分離在相對簡陋 的潔淨環境中進行，有利於實驗室專業人員與基層技術人員的工作對接，即專業人員製備 平板、培訓簡易分離技術，基層技術人員在基層可及時分離，專業人員就可直接收集病菌分 離物，有利於擴大病菌收集範圍。3、本發明採用的病組織為病莖的內部組織，所以病菌類型單一，分離時不必進行 表面消毒、不採用選擇性培養基，保持了病菌野生型特性，可降低成本，節省時間。4、本發明從典型病樣的篩選、採集與存放，病菌分離時剖莖的器具沒有接觸到病 髓片、彎頭鑷子的使用(可減少平板開啟的角度)、平板的選擇以及開啟角度和時間的限 定，病菌密封培養等措施保證了分離病菌的純度。分離的效率可達90% 95%，比常規技 術效率(70% 80%)顯著提高，汙染率明顯下降，減少汙染2 4倍。
權利要求
一種菸草黑脛病菌的簡便分離方法，其特徵在於利用簡易設備和簡陋的空間條件營造潔淨工作環境，快速分離菸草黑脛病菌，具體包括以下步驟A、病株選擇與採集選擇田間症狀典型，無其它症狀，病莖無開裂或未被人為剖開，即呈碟片狀的病髓片被密封包裹於健康莖杆中的病株作為目標病株；採集時去莖頂、葉片和根，僅留取病莖，衝洗表面浮塵後晾乾，每根病莖分別用滅菌的衛生紙包裹分隔，置於一次性使用的乾淨封口袋內；B、淨化工作環境選擇不通風的室內，用潔淨水噴霧沉降空氣中的塵埃，達到分離所需的空氣環境要求；分離前，用點燃的酒精燈火焰滅菌形成無菌小環境；C、病菌分離從上部剖開病莖，兩手抓住病莖上端，扳開病莖至呈碟片狀的病髓片露出；用火焰滅菌的彎頭鑷子夾取呈碟片狀的病髓片，置於火焰下的培養基平板內，每個採樣點用3～5個培養基平板，每個平板上放置病髓片3～5片；D、對分離的病菌進行室溫培養，根據菌落形態挑選目標病菌。E、病菌鑑定採用孢子灌根法或菌谷法接種感病品種紅花大金元進行病菌鑑定，病情嚴重度大於1的菌株就有致病性。
2.根據權利要求1所述菸草黑脛病菌的簡便分離方法，其特徵在於所述的病菌分離中 病髓片放置所用培養基平板直徑為6 9cm，平板打開角度為10° 15°，病髓片每片放置 的時間為3 5s。
3.根據權利要求1所述菸草黑脛病菌的簡便分離方法，其特徵在於所述的室溫培養是 將培養基平板用封口膜封口，3 5個平板一起置於密封的培養盒內，室溫條件培養3 5 天，然後根據菌落形態挑選目標病菌。
4.根據權利要求1或3所述菸草黑脛病菌的簡便分離方法，其特徵在於所述的培養基 為燕麥培養基或利馬豆培養基。
5.根據權利要求4所述菸草黑脛病菌的簡便分離方法，其特徵在於所述的燕麥培養基 的組成為燕麥片30g，瓊脂17 20g，蒸餾水1000ml。
6.根據權利要求4所述菸草黑脛病菌的簡便分離方法，其特徵在於所述的利馬豆培養 基的組成為利馬豆60g，瓊脂17 20g，蒸餾水1000ml。
全文摘要
本發明提供一種菸草黑脛病菌的簡便分離方法，利用簡易設備和簡陋的空間條件營造潔淨工作環境，快速分離菸草黑脛病菌，具體包括(1)病株選擇與採集；(2)淨化工作環境；(3)病菌分離；(4)病菌室溫培養等步驟。即在簡易條件下營造潔淨的工作環境，酒精燈火焰滅菌形成無菌小環境，剖開病莖，鑷取病莖內碟片狀的病髓片，置於燕麥或利馬豆培養基平板；培養基平板用封口膜封口，3～5個平板置於密封的培養盒內，室溫培養3～5天，根據菌落形態即可得到目標病菌。本發明適用于田間採樣後及時分離，整個操作所用設備簡單，在不具備微生物實驗室的條件下也可開展分離工作，分離病菌的純度高，保持了病菌野生型的特性。
文檔編號C12R1/645GK101914454SQ20101025123
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月12日 優先權日2010年8月12日
發明者餘清, 宋春滿, 方敦煌, 晉豔, 秦西雲, 莫笑晗 申請人:雲南省菸草農業科學研究院