菸草細胞內氧化還原酶製劑的純化、分子修飾和低聚物保護方法及生產工藝的製作方法
2024-03-02 22:28:15
專利名稱：菸草細胞內氧化還原酶製劑的純化、分子修飾和低聚物保護方法及生產工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及烤菸的自然發酵技術領域。
背景技術：
菸葉發酵是捲菸加工中極為重要的環節，未經發酵處理的菸葉不同程度的帶有多種品質缺陷，不能直接用來生產捲菸。目前菸草工業普遍使用的自然發酵工藝周期過長，儘管能使菸葉品質有所改善和提高，但制約著捲菸業企業生產優質捲菸所需的原料。150年前英國科學家曾試圖用微生物來提高菸草發酵質量，這方面的系統研究始於1950年(Frankenburg，W.G 1950 Enzymology10325-431)，當時提出了菸葉發酵由酶催化的系統理論；之後前蘇聯科學家和其他國家的科研人員做了大量的微生物發酵實驗，均未取得成功；隨後又對用人為的方法控制溫溼度條件的人工發酵方法進行了大量的研究。但其所處理的菸葉遠遠不能達到自然發酵的菸葉品質，因而沒有被菸草工業普遍接受。
中國專利CN 86 1 02596 A公開了一種「菸葉的強化發酵方法」，它是在調製的菸葉上噴灑澱粉酶和過氧化氫混合溶液，然後採用除雜劑處理。《河南農業科學》-1998(12)報導的「菸草發酵增質劑對烤菸發酵質量的影響」，《山地農業生物學報》-1999，18(4)報導的「微生物發酵對考煙內在品質的影響」，《河南農業大學學報》-2000，34(3)報導的「烤菸發酵高菌株的篩選」以及《華中農業大學學報》-2000，19(6)報導的「陳化期間烤菸葉片中生物活性變化的研究」等，上述文件闡述的微生物、酶及活性主要表現為微生物、胞外酶；所闡述的縮短陳化周期在自然發酵領域無明確的時間；所闡述的應用未說明產品的耐高溫性；所闡述的內容對處理菸葉的含水率未說明。
近年來，菸葉尤其是烤菸缺乏足夠的酶活性強度被越來越多的研究證明，見盧紅、王晶晶發表於《雲南農業大學學報》-2000(2)。菸葉發酵酶工程是應用生物酶的高專性和高效酶解性能，有選擇地加速菸草某些不良成分的分解，形成許多有利於提高菸草品質的致香成分，使菸草的發酵周期明顯縮短，菸草潛在的優良品質得到充分發揮。由於捲菸工藝特殊的低含水條件限制了酶製劑的活性作用，使這一領域的研究成果一直沒有得到推廣應用並實現產業化。
發明內容
隨著菸葉發酵機理研究的進一步深入，菸草的香氣來源和直接導致不良吸吃味成分的確定，本發明提出一種菸草細胞內氧化還原酶製劑的純化、分子修飾和低聚物保護方法及生產工藝，它從鮮活烤菸細胞內純化分離氧化還原酶群，並用輔酶和輔基置換對該酶群進行酶分子修飾，有效提高該類胞內酶活性；通過水含低聚物活性保護，有效延長了酶群活性半衰期，並實現低含水介質條件下的高效酶解作用，配合調製復烤後烤菸的胞內酶群放活處理。
本發明解決了酶製劑在菸草打葉復烤工藝中高溫條件下對酶活性的保護以及在捲菸工藝特定的低含水條件下酶製劑活性的發揮，從而在發酵過程中應用酶工程技術增加菸葉純正天然煙香，提供的酶製劑通過在捲菸工業中實際應用證明，能大幅度縮短菸草發酵周期，高選擇地降低菸葉品質缺陷，進一步發揮其潛在優良品質，提高菸草的可用性和安全性，適宜菸草工業中普遍推廣應用。
本發明的優點或積極效果本發明闡述的酶為細胞內酶基礎上的酶分子修飾，可應用於復烤線上經受復烤菸葉面80℃高溫後仍能發生作用，可在儲存菸葉12％±0.5的含水率條件下產生作用。與現有技術比較，本發明具有加快自然發酵過程，縮短自然發酵周期，除去烤菸內部不良缺陷，提高烤菸品質的特點。主要具有下列六個方面的作用1、降解烤菸殘留葉綠素，消除青雜氣。在底物(葉綠素)分解後作用自然終止；2、降解烤菸萜烯類化合物中的大分子成分為小分子香氣成分，增強烤菸天然香氣，發揮烤菸潛在優良品質；3、加速烤菸適當酸化過程，降低PH值一個單位，醇化烤菸，明顯提高烤菸可用性；4、速氨氮化合物脫氨揮發，降低烤菸總氮含量，降低刺激性，改善吃味，易轉化氨氮分解後作用自然終止；5、當降解烤菸菸鹼含量，降解產物為煙酸，改進烤菸吸吃味，提高烤菸安全性。6、比烤菸自然發酵的時間縮短5～6倍，由原來2～3年縮短為夏季100～150天、冬季150～200天。
圖面說明
圖1為本發明的工藝流程圖。
圖2為打葉復烤活性因子處理工藝流程。
如圖所示本發明的工藝流程如下A、鮮活菸葉或頂杈於4～8℃下加鮮組織3～5倍的5％～10％亞硫酸氫鈉溶液勻漿10～20分鐘至0.2mm，按常規工藝過濾或壓濾排除固形物。
B、濾液於1～9℃、4000～145000轉/分鐘離心分離，取液體於棉纖維或石英柱PH3～8醋酸洗脫液柱沉析，排除廢液。
C、酶坯溶液加入0.01～0.1％EDTA等1號輔料，在1～9℃沉澱10～20分鐘後，過濾排除沉澱物獲得淨化液。
D、淨化液於1～9℃下加入適量工程輔酶和輔基等2號輔料進行分子修飾工程輔酶置換，完成後酶液由淡黃色轉為淡綠色，即加入0.01％的糖類低聚物活性保護。
E、酶溶液於-4℃至-8℃冷凍乾燥濃縮，製劑液體縮小2～8倍時，於8℃解凍包裝。
在打葉復烤處理流程的烤菸解把、第一次潤葉、第二次潤葉、打葉、復烤、緊壓打包過程中，本發明製得的烤菸發酵活性因子在第二次潤葉時加入。
實施例1A、鮮活菸葉或頂杈6℃，加鮮組織4倍的7.5％亞硫酸氫鈉溶液勻漿15分鐘，壓濾排除固形物。B、濾液5℃、14500轉/分鐘離心分離，取液體於棉纖維或石英柱PH5.5醋酸洗脫液柱沉析。C、酶坯溶液加入0.06％EDTA等1號輔料，5℃沉澱10分鐘後，過濾排除沉澱物。D、淨化液5℃加入適量工程輔酶和輔基等2號輔料進行分子修飾工程輔酶置換。完成後酶液由淡黃色轉為淡綠色，即加入0.01％的糖類低聚物活性保護。E、酶溶液於-6℃冷凍乾燥濃縮，製劑液體縮小5倍時，於8℃解凍包裝。
實施例2A、鮮活菸葉或頂權4℃加鮮組織3倍的5％亞硫酸氫鈉溶液勻漿10分鐘，壓濾排除固形物。B、濾液1℃、4000-5000轉/分鐘離心分離，取液體於棉纖維或石英柱PH3醋酸洗脫液柱沉析。C、酶坯溶液加入0.01％EDTA等1號輔料，1℃沉澱20分鐘後，過濾排除沉澱物。D、淨化液1℃加入適量工程輔酶和輔基等2號輔料進行分子修飾工程輔酶置換。完成後酶液由淡黃色轉為淡綠色，即加入0.01％的糖類低聚物活性保護。E、酶溶液於-8℃冷凍乾燥濃縮，製劑液體縮小8倍時，於8℃解凍包裝。
實施例3A、鮮活菸葉或頂權8℃加鮮組織5倍的10％亞硫酸氫鈉溶液勻漿20分鐘，壓濾排除固形物。B、濾液9℃、5000轉/分鐘離心分離，取液體於棉纖維或石英柱PH8醋酸洗脫液柱沉析。C、酶坯溶液加入0.1％EDTA等1號輔料，9℃沉澱20分鐘後，過濾排除沉澱物。D、淨化液9℃加入適量工程輔酶和輔基等2號輔料進行分子修飾工程輔酶置換。完成後酶液由淡黃色轉為淡綠色，即加入0.01％的糖類低聚物活性保護。E、酶溶液於-8℃冷凍乾燥濃縮，製劑液體縮小8倍時，於8℃解凍包裝。
權利要求
1.一種菸草細胞內氧化還原酶製劑的純化、分子修飾和低聚物保護方法及生產工藝，其特徵在於工藝流程如下A、鮮活菸葉或頂杈於4～8℃下加鮮組織3～5倍的5％～10％亞硫酸氫鈉溶液勻漿10～20分鐘至0.2mm，按常規工藝過濾或壓濾排除固形物。B、濾液於1～9℃、4000～145000轉/分鐘離心分離，取液體於棉纖維或石英柱PH3～8醋酸洗脫液柱沉析，排除廢液。C、酶坯溶液加入0.01～0.1％EDTA等1號輔料，在1～9℃沉澱10～20分鐘後，過濾排除沉澱物獲得淨化液。D、淨化液於1～9℃下加入適量工程輔酶和輔基等2號輔料進行分子修飾工程輔酶置換，完成後酶液由淡黃色轉為淡綠色，即加入0.01％的糖類低聚物活性保護。E、酶溶液於-4℃至-8℃冷凍乾燥濃縮，製劑液體縮小2～8倍時，於8℃解凍包裝。
2.根據權利要求1所述的生產工藝，在打葉復烤處理流程的烤菸解把、第一次潤葉、第二次潤葉、打葉、復烤、緊壓打包中，其特徵在於烤菸發酵活性因子在第二次潤葉時加入。
全文摘要
本發明提出一種菸草細胞內氧化還原酶製劑的純化、分子修飾和低聚物保護方法及生產工藝,它從鮮活烤菸細胞內純化分離氧化還原酶群,並用輔酶和輔基置換對該酶群進行酶分子修飾,有效提高該類胞內酶活性;通過水含低聚物活性保護,有效延長了酶群活性半衰期,並實現低含水介質條件下的高效酶解作用,配合調製復烤後烤菸的胞內酶群放活處理,本發明解決了酶製劑在菸草打葉復烤工藝中高溫條件下對酶活性的保護以及在捲菸工藝特定的低含水條件下酶製劑活性的發揮。
文檔編號C12N9/02GK1362515SQ0211327
公開日2002年8月7日 申請日期2002年1月25日 優先權日2002年1月25日
發明者盧紅 申請人:雲南萬芳生物技術有限公司