大熊貓精液冷凍保存液及其製備方法
2024-03-05 10:28:15 2
專利名稱：大熊貓精液冷凍保存液及其製備方法
技術領域：
本發明屬於生物材料保存技術領域，具體涉及大熊貓精液冷凍保存液及其製備方法。
背景技術：
大熊貓是我國的特有種，屬世界瀕危珍稀動物，截至2004年結束的第三次全國大熊貓種群數量調查，雖然大熊貓野外種群數量由上世紀80年代的1100餘只上升到1590餘只，但依然沒有擺脫瀕危的境地。經過多年的努力，我國大熊貓圈養繁殖水平有了很大提高，至2008年底，圈養種群數量已達到268隻。但是，如何避免近親繁殖已成為大熊貓圈養繁育必須面對的問題。通過對大熊貓精液保存技術研究，可以使遺傳性能好的雄性個體的精液得以長期保存，從而為大熊貓人工授精繁育的開展奠定了基礎，同時為減緩因近交和遺傳漂變所造成大熊貓種群遺傳多樣性降低的速度，提高大熊貓繁殖性能、擴大種群數量等有著重要意義。近年來，成都大熊貓繁育基地進行了大熊貓精液冷凍保存液的研究，獲得的冷凍保存液配方為20%卵黃、12%蔗糖、5%甘油及少量ATP，用該保存液進行大熊貓精液的冷凍保存，解凍後進行精子活力檢查，平均為55. 79% (侯蓉等，2005.大熊貓細管凍精製備程序的建立與應用.中國獸醫學報，25C3))。本發明人按照該配方和方法進行多次冷凍保存實驗，解凍後精子活力平均為36. 56%，遠低於報導中的效果。所以，至今該保存液並沒有在大熊貓精液冷凍保存中得到應用。目前，大熊貓人工繁育中的精液冷凍保存，包括成都大熊貓繁育基地、臥龍大熊貓研究中心以及北京動物園等，均採用美國Irvine kientific公司生產的TEST保存液完成。用TEST保存液在冷凍保存解凍後的精子活力為40 60% (黃炎等.2000.大熊貓電刺激採精及精液冷凍保存研究.四川師範學院學報(自然科學版)，21 (3)；黃炎等.2000. 大熊貓精液的保存實驗.中國獸醫雜誌，26(6))，經冷凍後的精液可以在液氮中保存20 60年。採用TEST保存液進行大熊貓精液的冷凍保存，雖然解凍後的精子活力達到了人工授精要求，但是存在有以下問題①其配方不公開，國內沒有生產、購買不方便，而且價格昂貴，每盒(5ml χ 20瓶)7000元；②保質期短，在-10°C條件下保存期小於1年。由於大熊貓是季節性發情、每年一次，且發情期持續短，每年採精進行冷凍保存時，需提前訂貨購買TEST保存液，當年剩存的TEST保存液在來年無法使用。另外，冷凍保存液是大熊貓人工繁育中的基礎試劑，需求量比較大，又是含有蛋白質的營養試劑，以進口方式並進行長時間保存，對於精液的即時冷凍保存會造成影響，也給工作帶來不便。所以，冷凍保存液採用現配現用方式的效果最好。
發明內容
針對現有技術所存在的問題，本發明的目的是提供一種大熊貓精液冷凍保存液及
3其製備方法，使該保存液在解凍後的精子活力滿足人工授精要求的前提下，成本低廉、製備方法簡單，可以現配現用，實現精液的即時保存。本發明所提供的大熊貓精液冷凍保存液按IOOml配製，其組成配比為葡萄糖4 6g、果糖4 6g、檸檬酸三鈉0. 05 0. 15g、卵黃15 18ml、丙三醇6 7ml、以及青黴素和鏈黴素各0. 5萬IU 2萬IU，餘量為雙蒸水。所述冷凍保存液的優化配比為葡萄糖5g、果糖5g、檸檬酸三鈉0. lg、卵黃16ml、 丙三醇6. 7ml、以及青黴素和鏈黴素各1萬IU，餘量為雙蒸水。由於大熊貓精液呈弱鹼性， pH在7. 2 7. 5，以個體不同有所差異，為避免酸鹼度變化對精子的影響，所述冷凍保存液的PH為7.4。本發明冷凍保存液中，葡萄糖、果糖和卵黃為精子的代謝提供能量，因為在冷凍過程中和解凍後精子都需要能量維持自身的新陳代謝；檸檬酸三鈉是維持保存液中適當的滲透壓和電解質平衡，以保證精子內外的滲透壓平衡，其還具有緩衝作用，可以中和精子代謝產生的酸，防止PH的改變；由於冷卻過程中的精液要從體溫降至4 5°C，並需平衡一段時間，卵黃中的卵磷脂可以保護精子免受傷害；在冷凍和解凍的操作中，精子內的組織液和精液液體都要經歷由液態到固態的變化，會出現冰晶狀態，丙三醇能夠保護精子免受冰晶的傷害；青、鏈黴素主要是控制操作過程中的微生物汙染。所述大熊貓精液冷凍保存液的製備方法為，根據製備量按上述比例稱、量各組分， 將固體組分用雙蒸水溶解，再加入溶解後的青黴素和鏈黴素溶液，混合均勻，然後吸取鮮卵黃加至混合液中攪拌均勻，再將丙三醇加入混合液中攪拌均勻，餘量用雙蒸水補足，充分混合均勻，置於4 5°C保存備用。由於製備操作的環境條件原因，本發明在冷凍保存液中加入青黴素和鏈黴素，目的是抑制環境帶來的有害細菌汙染，但其也會對精子造成一定傷害，若在無菌條件下或清潔實驗室進行操作配製，完全可以不加青黴素和鏈黴素，從而使精子免受抗生素的傷害。所述大熊貓精液冷凍保存液的使用方法為，先把獲取的精液移入帶蓋的離心管中，按1 1比例加入冷凍保存液，緩慢搖動使其充分混勻，在鏡檢後活力達到輸精要求，即放入4 5°C冰箱中平衡3小時以上，平衡結束後再次鏡檢，活力達到輸精要求後倒管，封口後做標記，最後置入液氮罐中長期保存。在人工授精使用時，將凍存管從液氮罐中取出，於 37°C溫水中解凍1分鐘，剪開凍存管即可用於人工授精，同時進行精子活力檢查。採用本發明冷凍保存液對大熊貓精液進行冷凍保存，解凍後精子的活力符合人工授精的要求，平均活力> 58 %，最高為65 %，檢測方法採用侯蓉等，2005.大熊貓細管凍精製備程序的建立與應用.中國獸醫學報，25(3)的方法。由於冷凍保存液含有蛋白質，容易受環境的變化而變性。而本發明最重要的是可以按照需要量現配現用，不用擔心冷凍保存液的變性；其製備方法簡便，一人在15分鐘內即可完成。目前，陝西省珍稀野生動物搶救飼養研究中心一直在採用本發明的冷凍保護液對遺傳性能好的雄性大熊貓的精液進行低溫冷凍保存，並使用凍存精液進行人工授精，開展大熊貓的搶救繁育工作，取得了很好的效果。與美國TEST保存液相比，本發明的冷凍保存液所需的試劑和原料取材方便、價格便宜，配製IOOmL冷凍保存液的成本約50元，並且製備方法簡便，可以現配現用，實現精液的即時保存；置於4 5°C可保存1周，在-10°C條件下保存1月以上；冷凍後的精液在液氮中可保存50年以上。為大熊貓人工授精提供符合要求的精液，使大熊貓人工繁育和精液長期保存的成本大大降低，對於提高大熊貓繁殖性能、擴大種群數量都具有重要意義。
具體實施例方式為了保證本發明技術方案的可比性和檢測結果的一致性，以下實例中精子活力檢測方法均採用「侯蓉等，2005.大熊貓細管凍精製備程序的建立與應用.中國獸醫學報， 25(3)，，的檢測方法，由相同人員進行具體操作。實施例1、按IOOml配製稱、量葡萄糖4g、果糖6g、檸檬酸三鈉0. lg、卵黃15mL、 丙三醇6mL、青黴素和鏈黴素各1萬IU，餘量為雙蒸水。先將固體組分用適量雙蒸水充分溶解，再用注射器加入溶解後的青黴素和鏈黴素溶液，混合均勻；用移液管吸取新鮮卵黃加至混合液中攪拌均勻，再用移液管將丙三醇加入混合液中攪拌均勻，用雙蒸水補足100ml，充分混合均勻，置於4 5°C冰箱保存備用。以該冷凍保存液對圈養秦嶺大熊貓精液進行冷凍保存，解凍後精子的活力平均為 60%。主要原因卵黃含量低，使精子從體溫降至5°C的過程中卵磷脂和脂蛋白的量不夠， 導致部分精子遭受低溫的傷害；丙三醇含量低，沒有足夠滲入精子內部，從而在低溫冷凍過程中，使得精子內液體形成了冰晶物質，導致部分精子受到冰晶破壞。2007年，用該冷凍保存液對一隻7歲齡雄性大熊貓的精液進行冷凍保存，1月後解凍檢查活力為56%，凍存13個月後檢查活力仍為56%，用該精液對一隻發情的雌性秦嶺大熊貓進行人工授精，該大熊貓成功受孕。實施例2、按200ml配製稱、量葡萄糖10g、果糖10g、檸檬酸三鈉0. 2g、卵黃32mL、 丙三醇13. 4mL、青黴素和鏈黴素各2萬IU，餘量為雙蒸水。先將固體組分用適量雙蒸水充分溶解，再用注射器加入溶解後的青黴素和鏈黴素溶液，混合均勻；用移液管吸取新鮮卵黃加至混合液中攪拌均勻，再用移液管將丙三醇加入混合液中攪拌均勻，用雙蒸水補足200ml， 充分混合均勻，置於4 5°C冰箱保存備用。以該冷凍保存液對圈養秦嶺大熊貓精液(30餘份)進行冷凍保存，解凍後檢測精子活力平均為65%。用該冷凍保存液對採集到的大熊貓精液進行冷凍保存操作，分別解凍後，對發情期的雌性秦嶺大熊貓進行了人工授精，成功繁育大熊貓4胎6仔2008年繁育1 胎2仔；2009年繁育2胎3仔；2010年繁育1胎1仔。實施例3、按IOOml配製稱、量葡萄糖5g、果糖5g、檸檬酸三鈉0. 15g、卵黃18mL、 丙三醇7mL、青黴素和鏈黴素各1萬IU，餘量為雙蒸水。先將固體組分用適量雙蒸水充分溶解，再用注射器加入溶解後的青黴素和鏈黴素溶液，混合均勻；用移液管吸取新鮮卵黃加至混合液中攪拌均勻，再用移液管將丙三醇加入混合液中攪拌均勻，用雙蒸水補足100ml，充分混合均勻，置於4 5°C冰箱保存備用。以該冷凍保存液對圈養秦嶺大熊貓精液進行冷凍保存，解凍後精子的活力平均為 58%。主要原因是緩衝物檸檬酸三鈉含量高，導致PH值偏高；卵黃含量高，使部分精子產生聚集現象，影響精子的直線運動；丙三醇含量高，對精子的毒害超過了保護作用，導致部分精子頂替蛋白遭到破壞，從而造成了精子活力的降低。2008年，用該冷凍保存液對一隻23歲雄性大熊貓的精液進行冷凍保存，凍存20天後檢查活力為58%，凍存1年後檢查活力仍為58%。2009年用該精液對一隻發情的雌性大熊貓進行人工授精，該大熊貓成功受孕。
權利要求
1.一種大熊貓精液冷凍保存液，其特徵在於，按IOOml配製其組成配比為葡萄糖4 6g、果糖4 6g、檸檬酸三鈉0. 05 0. 15g、卵黃15 18ml、丙三醇6 7ml、以及青黴素和鏈黴素各0. 5萬IU 2萬IU，餘量為雙蒸水。
2.根據權利要求1所述的冷凍保存液，其特徵在於，按IOOml配製其組成配比為葡萄糖5g、果糖5g、檸檬酸三鈉0. lg、卵黃16ml、丙三醇6. 7ml、以及青黴素和鏈黴素各1萬IU， 餘量為雙蒸水；冷凍保存液的PH為7. 4。
3.製備權利要求1所述大熊貓精液冷凍保存液的方法，其特徵在於，按所述比例稱、量各組分，將固體組分用雙蒸水溶解，再加入溶解後的青黴素和鏈黴素溶液混合均勻，然後吸取鮮卵黃加至混合液中攪拌均勻，再將丙三醇加入混合液中攪拌均勻，餘量用雙蒸水補足， 充分混合均勻，置於4 5°C保存。
全文摘要
一種大熊貓精液冷凍保存液及其製備方法，本發明採用葡萄糖、果糖、檸檬酸三鈉、卵黃、丙三醇以及雙蒸水配製；先將固體組分溶解後，再加入液體組分充分混合均勻而成。採用本發明的冷凍保存液對大熊貓精液冷凍保存，解凍後精子的活力符合人工授精的要求，平均活力≥58％，最高為65％；與美國TEST保存液相比，所需的試劑和原料取材方便、價格便宜，配製100mL冷凍保存液的成本約50元，並且製備方法簡便，可以現配現用，實現精液的即時保存；冷凍後的精液在液氮中可保存50年以上。為大熊貓人工授精提供符合要求的精液，使大熊貓人工繁育和精液長期保存的成本大大降低，對於提高大熊貓繁殖性能、擴大種群數量都具有重要意義。
文檔編號A01N1/02GK102246744SQ201110112099
公開日2011年11月23日 申請日期2011年5月3日 優先權日2011年5月3日
發明者吳曉民, 封託, 車利峰, 金學林, 馬清義 申請人:陝西省動物研究所