山羊傳染性胸膜肺炎病原檢測雙重pcr診斷試劑盒及製備、使用方法
2024-04-02 16:42:05 1
專利名稱：山羊傳染性胸膜肺炎病原檢測雙重pcr診斷試劑盒及製備、使用方法
技術領域：
本發明涉及一種山羊傳染性胸膜肺炎病原檢測雙重PCR診斷試劑盒及製備方法。
背景技術：
山羊傳染性胸膜肺炎(ContagiousCaprine Plneuropneumonia, CCPP),又稱爛肺病，是山羊一種高度接觸性傳染病，我國農業部將其列為二類傳染病，臨床呈現纖維性肺炎及胸膜炎，發病後死亡率較高。絲狀支原體簇(Mycoplasma mycoides cluster)成員中山羊支原體山羊肺炎亞種(Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae, Mccp)、絲狀支原體絲狀亞種 LC 型(Mycoplasma mycoides subsp. mycoides LC, Mmm LC)與絲狀支原體山羊亞種(Mycoplasma mycoides subsp. capri, Mmc)均可使山羊患CCPP,綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae, Mo)也可感染山羊。目前，國內外對於CCPP的診斷主要依靠病原分離鑑定、血清學試驗以及分子生物學技術。對比三種診斷方法，傳統的分離鑑定由於支原體生長條件要求較高、生長速度緩慢的特點，因此診斷成本高且難度大、耗時長，無法立即解決快速診斷問題；血清學試驗主要為間接血凝試驗、補體結合試驗與競爭ELISA，三者敏感性差或特異性差，且不能作為病原診斷方法；分子生物學技術具有快速、準確、靈敏、特異等優點，尤其是多重PCR方法可對不同病原同時進行診斷。因此，本發明設計了分別針對Mycoplasma mycoides cluster與Mycoplasma ovipneumoniae 16S rRNA基因的特異性引物,通過優化反應條件及體系，建立一種快速、靈敏、特異且能同時檢測出Mycoplasma mycoides cluster與Mycoplasmaovipneumoniae的CCPP病原的診斷方法,為山羊CCPP防控提供了一定的技術支持。
發明內容
本發明要解決的技術問題在於，提供一種有效、快速、靈敏、特異的山羊傳染性胸膜肺炎病原檢測雙重PCR診斷試劑盒及製備、使用方法，以避免臨床對於CCPP疑似病例的病原檢測盲目性與繁瑣性，為CCPP防治提供技術支持，克服現有技術存在的診斷成本高且難度大、耗時長，無法立即解決快速診斷問題等不足。本發明的山羊傳染性胸膜肺炎病原檢測雙重PCR診斷試劑盒，其原料配方為1000^2000 u L PCR 反應液，10(T200ii L Taq DNA 聚合酶，50 100 y L 陽性對照、50 100 y L陰性對照、lmL-2 mL超純水。所述PCR反應液包括引物I混合液、引物2混合液、PCR反應緩衝液和dNTP，四種液體於PCR反應液中體積比為2:2:5:1。所述引物I為針對Mycoplasma mycoides cluster 16S rRNA基因通用引物Ps與Pa，引物濃度為IOiimol/ L，引物序列見表I。表I引物I (Ps與Pa)序列權利要求
1.一種山羊傳染性胸膜肺炎病原檢測雙重PCR診斷試劑盒，其特徵在於本試劑盒的原料配方為1000 200011 L PCR反應液，10(T200i! L 7 DNA聚合酶，50 100 y L陽性對照、5(Tl00iiL陰性對照和lmL 2 mL超純水。
2.根據權利要求I所述的山羊傳染性胸膜肺炎病原檢測雙重PCR診斷試劑盒，其特徵在於PCR反應液包括引物I混合液、引物2混合液、PCR反應緩衝液和dNTP，四種液體於PCR反應液中體積比為2:2:5: I。
3.根據權利要求2所述的山羊傳染性胸膜肺炎病原檢測雙重PCR診斷試劑盒，其特徵在於弓丨物I為針對Mycoplasma mycoides cluster 16S rRNA基因通用引物Ps與Pa,引物濃度為IOiimol/ L，引物序列見表I : 表I引物I (Ps與Pa)序列引物I序列(5，一3』)'Ps_GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT_Pa Icagcgtcaataacaagccagtaag —O
4.根據權利要求2所述的山羊傳染性胸膜肺炎病原檢測雙重PCR診斷試劑盒，其特徵在於引物2為針對Mycoplasma ovipneumoniae 16S rRNA基因特異性引物Ms與Ma，引物濃度為lOumol/ L，引物序列見表2: 表2引物2 (Ms與Ma)序列 引物I序列(5，一3』)Ms_AAACTATGTGCCAGCAGCGTAAGMa Icaccatctgtcatctcgttagcc —O
5.根據權利要求2所述的山羊傳染性胸膜肺炎病原檢測雙重PCR診斷試劑盒，其特徵在於PCR反應緩衝液為IOXT^ Buffer並含Mg2+，該PCR反應緩衝液包括200mmol/LTris-HCl、pH8. 4，200mmol/L KCl, 100mmol/L- (NH4) 2S04 和 15mmol/L MgCl20
6.根據權利要求2所述的山羊傳染性胸膜肺炎病原檢測雙重PCR診斷試劑盒，其特徵在於dNTP為dATP、dGTP、dTTP、dCTP和dUTP在內等量混合游離核苷酸，其濃度為IOmmol/L0
7.根據權利要求I所述的山羊傳染性胸膜肺炎病原檢測雙重PCR診斷試劑盒，其特徵在於'Taq DNA聚合酶，其濃度為2. 5U/ U L/U L0
8.根據權利要求I所述的山羊傳染性胸膜肺炎病原檢測雙重PCR診斷試劑盒，其特徵在於陽性對照為絲狀支原體簇與綿羊肺炎支原體16S rRNA基因部分序列克隆質粒混合物，其濃度為 I. OX IO5Copies/u L0
9.根據權利要求I所述的山羊傳染性胸膜肺炎病原檢測雙重PCR診斷試劑盒，其特徵在於陰性對照為不含絲狀支原體簇與綿羊肺炎支原體16S rRNA基因部分序列的pMD18-T空載體質粒。
10.一種山羊傳染性胸膜肺炎病原檢測雙重PCR診斷試劑盒的製備方法，其特徵在於包括以下內容第一，最佳反應退火溫度的確定；第二，特異性檢測；第三，敏感性檢測；第四，臨床應用性檢測；第五，試劑盒包裝。
11.根據權利要求10所述的山羊傳染性胸膜肺炎病原檢測雙重PCR診斷試劑盒的製備方法，其特徵在於最佳反應退火溫度的確定過程如下取6支PCR反應管，每管中均加A PCR反應液10. OuL, TaqMk聚合酶I. 0 y L，陽性對照2. 0 y L，超純水37. 0 y L ;以94°C預變性4min ;94°C變性40s，50°C 60°C退火40s，72°C延伸I. 5min，共34個循環後72°C延伸IOmin進行退火溫度的梯度擴增，I. 0%瓊脂糖凝膠電泳分析以確定最佳退火溫度。
12.根據權利要求10所述的山羊傳染性胸膜肺炎病原檢測雙重PCR診斷試劑盒的製備方法，其特徵在於特異性檢測過程如下取8支PCR反應管，每管中均加入PCR反應液10.0 ii L與Taqmk聚合酶I. 0 y L後，從第I管至第8管依次加入絲狀支原體山羊亞種、綿羊肺炎支原體、大腸桿菌、鏈球菌、產氣莢膜梭菌、沙門氏菌、巴氏桿菌及山羊痘病毒的基因組DNA各2. 0 ii L進行PCR擴增，I. 0%瓊脂糖凝膠電泳分析以檢測試劑盒特異性。
13.根據權利要求10所述的山羊傳染性胸膜肺炎病原檢測雙重PCR診斷試劑盒的製備方法，其特徵在於敏感性檢測過程如下取6支PCR反應管，每管中均加入PCR反應液10. 0 il L與ragDNA聚合酶I. 0 y L後,從第I管至第6管依次加入濃度為I. OX IO7Copies/U L "I. OX IO2Copies/ u L的陽性對照2. 0 y L進行PCR擴增，I. 0%瓊脂糖凝膠電泳分析以檢測試劑盒敏感性。
14.根據權利要求10所述的山羊傳染性胸膜肺炎病原檢測雙重PCR診斷試劑盒的製備方法，其特徵在於臨床應用性檢測過程如下以所建雙重PCR方法分別對不同份疑似CCPP病死山羊病變肺組織、胸腔積液及鼻腔分泌物進行檢測，並與傳統支原體分離及生化鑑定結果進行比較，以檢測方法的臨床應用性。
15.根據權利要求10所述的山羊傳染性胸膜肺炎病原檢測雙重PCR診斷試劑盒的製備方法，其特徵在於試劑盒包裝過程如下將試劑原料按類別分別裝入平底聚丙烯管內，貼標籤後以全封閉式焊頭封閉各管管口 ；將已裝原料各管正面放置於泡沫試劑託盤上並裝入試劑盒內；於試劑盒內放入使用說明書後膠封試劑盒；將包裝好的試劑盒置_20°C保存。
16.一種山羊傳染性胸膜肺炎病原檢測雙重PCR診斷試劑盒的使用方法，其特徵在於包括以下過程①取出試劑盒內所裝試劑置冰上徹底溶解取無菌PCR反應管，向內依次加入所述試劑將已加50. 0 ii L反應體系的PCR反應管置熱循環PCR儀中，按以下反應程序進行PCR擴增94°C預變性4min ;94°C變性40s，54°C退火40s，72°C延伸I. 5min，共34個循環後72°C延伸IOmin ;④取8 y L擴增產物以I. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，結果判定陰性對照無條帶出現，陽性對照應出現兩條412bp與534bp兩條條帶；若待檢擴增模板僅出現大小約412bp特異性片段，則判定待檢樣本絲狀支原體感染陽性；若待檢擴增模板僅出現大小約534bp特異性片段，則判定待檢樣本綿羊肺炎支原體感染陽性；若待檢擴增模板同時出現大小約534bp與412bp兩條特異性片段，則判定待檢樣本絲狀支原體與綿羊肺炎支原體感染陽性；若待檢擴增模板無任何條帶出現，則判定待檢樣本陰性。
全文摘要
本發明公開了一種山羊傳染性胸膜肺炎病原檢測雙重PCR診斷試劑盒的原料配方及製備、使用方法。原料配方為1000~2000μLPCR反應液，100~200μLTaqDNA聚合酶，50~100μL陽性對照、50~100μL陰性對照、1mL-2mL超純水。PCR反應液包括引物1混合液、引物2混合液、PCR反應緩衝液和dNTP，四種液體於PCR反應液中體積比為2:2:5:1。製備方法包括最佳反應退火溫度的確定；特異性檢測；敏感性檢測；臨床應用性檢測和試劑盒包裝。本發明對山羊養殖場疑似山羊傳染性胸膜肺炎病羊病原、疑似病例的快速、確定性診斷提供了有效方法，為山羊傳染性胸膜肺炎防控提供技術支持。
文檔編號C12Q1/68GK102634601SQ20121014244
公開日2012年8月15日 申請日期2012年5月10日 優先權日2012年5月10日
發明者周碧君, 張雙翔, 文明, 王開功, 程振濤 申請人:貴州大學