丹參素鈉誘導心臟幹細胞增殖的用途的製作方法
2024-02-29 16:06:15
專利名稱：丹參素鈉誘導心臟幹細胞增殖的用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於醫藥技術領域，具體涉及一種中藥單體化合物丹參素鈉的用途，特別涉及丹參素鈉在促進心臟幹細胞(cardiac stem cells, CSCs)體外增殖方面的用途。
背景技術：
心血管疾病是危害人類健康的頭號殺手，其中因冠心病而死亡的佔其死亡總數的50%左右。目前冠心病的發病率在40歲以上的人群佔4%-7%，且呈上升趨勢。有研究顯示，心梗後有很少量心肌細胞發生分裂增生，但不能完整修復心肌組織因此心梗後心肌細胞數量減少，纖維癱痕組織增生，心室重塑，心功能下降，最終發展為缺血性心力衰竭。目前 臨床所用的治療手段不能逆轉已壞死的心肌，溶栓與冠狀動脈搭橋以及植入支架等介入手段也只能恢復血流的再灌注，防止心梗部位的擴大，而異體心臟移植由於受供體來源,移植排斥反應及高昂的費用限制難以在臨床廣泛應用。近年來隨著幹細胞理論及技術的開展，己經取得了初步結果。這些重要發現為修復和重建病損心肌提供了很好的基礎。但目前的難題是不能獲得足夠的幹細胞用於臨床治療，國內外研究證實多種胚胎及成體幹細胞在適當的培養環境中加入某種有效成份時可在體外誘導分化為心肌樣細胞和大量擴增。丹參，味苦，性微寒，無毒，入心經。中醫理論認為丹參具有活血通絡、祛淤止痛、涼血消癰、清心除煩等功效。古有「一味丹參，功同四物」之說，丹參可用於月經不調、經閉痛經、瘤痛積聚、胸腹刺痛、熱痺疼痛、瘡瘍腫痛、心煩不眠、肝脾腫大、心絞痛等。其主要成分為脂溶性成分和水溶性成分兩大類。其中，水溶性成分主要為酚酸類物質，具有抗氧化、抗缺血、改善微循環等功效。藥理研究及臨床證實，丹參製劑如滴丸、注射液、草藥對冠心病、心肌缺血，均有明顯改善其心悸、胸悶、氣短諸症的作用，對心腦血管系統等均有保護作用。丹參中最早發現的是丹參素，化學名為B-3，4_ 二輕苯乳酸，是各種丹酚酸的基本化學結構，為棕黃色粉末或黃色粉末。丹酚酸類化合物還包括丹酚酸A、B、C、D、E、F、G、H、I，迷迭香酸，紫草酸等。它們都具有很強的抗脂質過氧化和清除自由基作用。丹參素重要的藥理作用體現在以下幾方面
HOC H2C H(OH)COOH圖.丹參素化學結構I.對心肌的作用丹參素具有縮小心肌梗死範圍和減輕病程的作用，同時對心肌缺血再灌注損傷具有保護作用。張力等報導丹參素為超氧陰離子清除劑，從而推測其可保護心肌線粒體免受氧自由基引發的脂質過氧化物的損傷。蘇曉華等研究表明，丹參素對大鼠心肌線粒體ADP/0，RCR及細胞色素氧化酶具有保護作用，提示丹參素為良好的Off清除劑，並對大鼠心肌線粒體膜具有保護作用。2.抑制血小板聚集及抗凝作用丹參素能明顯抑制血小板的聚集，並明顯增加血小板膜的流動性，提示其對冠心病有效。3.抗菌消炎及增強機體免疫作用丹參素阻止鈣離子內流，顯著抑制大鼠腹腔巨噬細胞產生前列腺素E2 (DGE2)及血栓丸B2 (TXB2)。4.抗動脈粥樣硬化及降血脂作用丹參素抑制細胞內源性膽固醇的合成，還具有抗脂質蛋白氧化作用，降低血膽固醇，因此具有保護血管屏障，防止脂質沉積及動脈粥樣硬化(AS)作用。5.抗血栓形成作用嚴常開等研究丹參素的活血化瘀作用，發現丹參素能明顯抑制由ADP誘導的大鼠血小板體外聚集活性，延長電刺激大鼠頸總動脈後血栓形成時間，明顯降低血瘀大鼠低、高切變率的全血黏度，血液黏度，紅細胞壓積等。但丹參素穩定性差，通常以其鈉鹽即丹參素鈉存在，丹參素鈉和丹參素具有相同的藥理作用。
發明內容
本發明的目的是提供丹參素鈉的一種用途，即在誘導體外培養心臟幹細胞增殖的新用途。本發明人研究發現，丹參素鈉具有誘導心臟幹細胞增殖的用途，為臨床治療提供足夠的幹細胞。丹參素鈉可為市售高純度的丹參素鈉(含量> 98. 5% )，也可按常規方法進行製備。本發明的優點是丹參素鈉誘導心臟幹細胞增殖，可為治療心梗及梗死後恢復期心律失常的預防和幹細胞治療提供足夠的幹細胞，降低機體免疫排斥反應，降低急性心肌梗死的死亡率，療效確切。
下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。圖I是丹參素鈉體外培養心臟幹細胞增殖MTT試驗結果；圖2是流式細胞儀檢測結果。圖2(1)為正常對照組；圖2(2)為丹參素用藥組
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步說明。I.材料方法I. I 試藥胎牛血清(FBS, Hyclone) ;EDTA(Sigma)、IMDM 培養基(Iscove, sModified Dulbecco ' s Medium, Gbico)、青 / 鏈黴素雙抗(Penicilin/streptomycin,Gbico)、膠原酶(Collagenase, Sigma)、Mercaptoethanol (北京)。取 Collagenase O. 02g,用D-hank』 s液20mL配製成所需濃度,然後過濾滅菌備用。Febronectin、bFGF, EGF, LIF,HEPES和ITS均為BD公司產品。I. 2儀器Milipore純水器(Academic-120型，美國Millipore公司)；電子天平(德國Sartorius)、深低溫冰箱(美國Thermo Forma ;倒置相差顯微鏡日本Olympus ;離心機(Eppendorf);電熱磁力攪拌器(德國IKA) ;96孔培養板、6孔培養板(丹麥Nunc);微量可調加樣器(Eppendorf公司)，電熱恆溫乾燥箱(SKG-0H,國產)。1.3CSCs分離培養取48h內新生SD幼鼠脫臼處死，在燒杯中用75%的酒精浸泡5min消毒後送入超淨工作檯，無菌取出大鼠心臟，放在冰浴中已滅菌的平皿中，眼科剪把心臟剪碎為Imm3的小塊，加0. 1%的Collagenase 37°C消化15min，收集消化的細胞4°C，1200rpm離心IOmin, PBS洗滌兩次，加入基礎培養液(78. 3 % ^ IMDM, 20 % ^ FBS, I %的Penicilin/streptomycin 和 0. 7% 的 Mercaptoethanol),調整細胞濃度為 2 X IO5 細胞 /mL,以每孔0. 5mL加入包被的96孔無菌培養板，放入二氧化碳培養箱(37°C、5% CO2)內培養一周，加入0. 25%的trypsin,室溫下放置5_7min,在顯微鏡下觀察發現多數細胞變圓時，加入少許血清終止消化，輕輕側立沿孔壁收集消化液到離心管，4°C 1200rpm離心lOmin，PBS 洗滌兩次，加入第二階段的培養液(DMEM和 Ham’s F12 (ratio I I)，bFGF(10ng/mL)，EGF(20ng/mL)，LIF(10ng/mL)，HEPES (5mM))重懸細胞，以0. 5mL/孔加入培養皿，傳代三天後，用PBS收集上層圓形小細胞，培養至第三個96孔培養板，培養液在第二階段培養液的基礎上加入I. 25%的ITS，每隔3天換液一次。
I. 4MTT法觀察細胞增殖細胞經傳代2次後，2天後逐漸貼壁快速生長，此時將培養的細胞分為空白對照組(正常血清培養)和丹參素鈉組，丹參素鈉溶液配成相應濃度並過濾滅菌加入培養皿，分為 DNl 組(KTW/L)、DN2 組(l(T2mol/L)、DN3 組(l(T3mol/L)、DN4 組(l(T4mol/L)、DN5 組(10_5 mol/L)和DN6組(10_6mol/L)，每組8孔，加藥後繼續培養觀察細胞生長狀況，並分別於24h、48h後收集細胞，通過MTT法觀察丹參素鈉對CSCs的影響。I. 5流式細胞術檢測按照抗體使用說明，避光加入抗體，行流式細胞儀測定c-kit7CD45_細胞的含量。I. 6統計分析實驗數據用f±sd表示,採用Origin 8. 0軟體進行統計學處理分析，兩組間比較採用t檢驗、多組間比較採用單因素方差分析，當P < 0. 05時認為有統計學差異。2.結果2. I細胞生長狀況及MTT結果細胞經傳代培養後，逐漸貼壁，鏡下觀察，用丹參素鈉加藥血清培養的細胞生長增殖迅速，當其濃度超過10_3mol/L時，心臟幹細胞增殖更顯著(見圖I所示)。2. 2流式細胞儀檢測結果用藥24h後，丹參素鈉加藥血清培養的細胞生長增殖迅速，當其濃度超過10_3 mol/L時，心臟幹細胞增殖顯著，與正常對照組相比，有顯著的統計學差異(P< 0.05或P <0.01)。圖2所示，圖2(1)為正常對照組即空白血清對照組；圖2⑵為丹參素用藥組即血藥濃度為10_2mol/L的結果。圖中Q2象限為c-kit+/⑶45_部分，從圖中可以看出兩者相差非常顯著。
權利要求
1.一種丹參素鈉在促進心臟幹細胞體外增殖方面的用途，其特徵在於涉及一種單體化合物丹參素鈉的用途，具體指丹參素鈉在促進心臟幹細胞體外增殖方面的用途。
2.根據權利要求I所述的丹參素鈉在促進心臟幹細胞體外增殖的用途，其特徵在於丹參素鈉的濃度為1X10_3 lXlO'ol/L時，其促進心臟幹細胞增殖的作用顯著。
全文摘要
本發明提供一種丹參素鈉誘導體外培養心臟幹細胞增殖的用途。研究發現，丹參素鈉具有誘導體外培養心臟幹細胞增殖的作用，為臨床治療提供足夠的幹細胞。其中丹參素鈉可為市售高純度的丹參素鈉(含量＞98.5％)，也可按常規方法進行製備。其優點是丹參素鈉誘導心臟幹細胞增殖，可為治療心梗及梗死後恢復期心律失常的預防和幹細胞治療提供足夠的幹細胞，降低機體免疫排斥反應，降低急性心肌梗死的死亡率，療效確切。
文檔編號C12N5/071GK102719392SQ20121014196
公開日2012年10月10日 申請日期2012年5月9日 優先權日2012年5月9日
發明者華菲, 呂勇剛, 孫紀元, 李嶽洋, 楊倩, 王四旺, 程蕊 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學