菲律賓實蠅的實時螢光pcr檢測方法及檢測用引物和探針的製作方法

2024-04-01 04:38:05

專利名稱：：菲律賓實蠅的實時螢光pcr檢測方法及檢測用引物和探針的製作方法
技術領域：
：本發明涉及林業和植物檢疫
技術領域：
，具體涉及一種菲律賓實蠅的檢測方法；尤其涉及一種菲律賓實蠅的實時螢光PCR檢測方法；此外，本發明還涉及檢測菲律賓實蠅的引物和探針。
背景技術：
：菲律賓實蠅Bactroceraphilippinensis屬雙翅目(Diptera)、實蠅科(T印hritidae)、離腹寡毛實蠅屬(Bactrocera)。主要分布在菲律賓等東南亞國家，寄主主要有木菠蘿，木瓜，蒲桃，芒果，桃欖等水果類經濟作物。在其分布區給水果生產造成嚴重損失，被列入《中國進境植物檢疫性有害生物名單》。由於我國與東南亞各國新鮮水果貿易量的日益增加，菲律賓實蠅隨貿易水果傳入我國、造成危害的風險逐漸增大，成為我國植物檢疫部門關注的重點有害生物之一。在口岸入境新鮮水果檢疫中截獲菲律賓實蠅的蟲態多為卵、幼蟲或蛹，菲律賓實蠅與其同屬的桔小實蠅B.dorsalis、楊桃實蠅B.carambolae和木瓜實蠅B.papayae形態特徵非常相近，卵、幼蟲和蛹更是無法用形態分類方法加以區分。在實際檢疫中，是將截獲的幼蟲等飼養到成蟲才能進行種類鑑定，飼養時間一般需要10-20天，給入境新鮮水果貿易帶來嚴重影響。因此，尋求快速、準確的鑑定方法是現階段檢疫技術亟待解決的問題和發展的方向。餘道堅等(2004)報導了用PCR法檢疫鑑定番石榴實蠅B.correcta,目前還未見有利用分子生物學方法對菲律賓實蠅進行種類鑑定的報導。
發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種菲律賓實蠅的實時螢光PCR檢測方法；為此，本發明還提供用於上述方法的檢測引物和探針。利用菲律賓實蠅檢測引物及探針可以快速、準確地對菲律賓實蠅進行檢測鑑定。本發明根據桔小實蠅、木瓜實蠅、楊桃實蠅和菲律賓實蠅(GenBank編號分別為DQ917577,DQ917578,EF014414,DQ995281)這幾個近似種的mtDNA中部分cob-nadhl基因的序列設計特異性引物和探針，建立了菲律賓實蠅的實時螢光PCR檢測方法，以達到快速準確檢測鑑定菲律賓實蠅的目的。在本發明的一方面，提供一種菲律賓實蠅的實時螢光PCR檢測方法，其特徵在於，包括如下步驟(1)設計引物和探針；該引物的序列為上遊引物G-FP:5，-CGGGCTGTGGCACAAACTAT-3，(SEQIDNO.1)或其互補鏈；下遊引物G-RP:5，-AACTCCGATTCACCTTCTGCAA-3，(SEQIDN0.2)或其互補鏈；該探針的序列為菲律賓實蠅探針G-MGB:FCATTAGTTTTATTATCCTTTGTATTTP(SEQIDΝ0·3)或其互補鏈；(2)提取菲律賓實蠅DNA；(3)採用步驟⑴設計的引物和探針進行實時螢光PCR檢測。步驟(2)具體為取菲律賓實蠅單頭蟲樣放入研缽，加液氮磨成粉末狀，用試劑盒提取樣品DNA。步驟(3)中，所述實時螢光PCR檢測的反應體系為25μL，包括5XrealtimePCRBuffer5uL,Mg2+solution0.5uL,dNTPmixture0.75uL,TaKaRaEx-TaqHS0.25uL,/^驟(1)設計的上下遊引物G-FP/RP各0.5uL，TaqMan-MGB探針0.6uL，DNA模板0.5uL，超純水補至25uL。步驟(3)中，所述實時螢光PCR檢測的反應程序為50°C2min，預變性95°CIOmin；然後95°C15sec，60°CImin循環40次。在本發明的另一方面，提供一種用於檢測菲律賓實蠅的引物，其序列為上遊引物G-FP:5，-CGGGCTGTGGCACAAACTAT-3，(SEQIDNO.1)或其互補鏈；下遊引物G-RP:5，-AACTCCGATTCACCTTCTGCAA-3，(SEQIDNO.2)或其互補鏈。在本發明的另一方面，提供一種用於檢測菲律賓實蠅的探針，其序列為G-MGB=FCATTAGTTTTATTATCCTTTGTATTTP(SEQIDNO.3)或其互補鏈。上述實時螢光PCR檢測方法採用MGB(全稱為MinorGrooveBinder)探針。MGB探針一是在探針的3』端標記了自身不發光的淬滅螢光分子，以取代常規可發光的TAMRA螢光標記；二是探針的3』端另結合了Minorgroovebinder結合物，使探針的Tm值提高，大大增加了探針的雜交穩定性。該方法具有如下優點1、更容易設計；2、探針更短3、提高配對與司E配對模板間的Tm值差異；4、實驗結果更精確、分辯率更高；5、雜交的穩定性提高；6、低背景；7、重複性更強。該方法適合病原體的檢測、SNP和突變體檢測，既可以進行基因定量分析，又可以進行基因突變分析。與現有技術相比，本發明的有益效果在於1、檢測時間大大縮短，可以在八個小時內完成檢測，傳統的常規方法需10-20天；2、對菲律賓實蠅的鑑定準確率增大，傳統的常規方法還需要其他詳細產地等信息支持才能鑑定。圖1是本發明的引物G-FP/G-RP和探針G-MGB在菲律賓實蠅(DQ995281)上的位置示意圖；圖2是四種實蠅(菲律賓實蠅DQ995281，桔小實蠅DQ917577，楊桃實蠅EF014414，木瓜實蠅DQ917578)序列在探針位置的比對示意圖；圖3是不同來源的6個菲律賓實蠅樣品實時螢光PCR擴增的結果示意圖。具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的說明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork=ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述條件，或按製造廠商所建議的條件。實施例11.設計引物和探針根據桔小實蠅、木瓜實蠅、楊桃實蠅和菲律賓實蠅(GenBank編號分別為DQ917577,DQ917578,EF014414,DQ995281)這幾個近似種的mtDNA(線粒體DNA)中部分cob-nadhl基因的序列設計如下特異性引物G-FP/RP和探針G-MGB(引物和探針由上海基康公司合成)上遊引物G-FP:5，-CGGGCTGTGGCACAAACTAT-3，；下遊引物G-RP:5，-AACTCCGATTCACCTTCTGCAA-3，；菲律賓實蠅探針G-MGBFCATTAGTTTTATTATCCTTTGTATTTP上述引物及探針的檢測原理如圖1所示，四種實蠅(菲律賓實蠅DQ995281，桔小實蠅DQ917577，楊桃實蠅EF014414，木瓜實蠅DQ917578)序列在探針位置的比對見圖2。2、提取菲律賓實蠅DNA取菲律賓實蠅單頭蟲樣(樣品來源見表1)放入研缽，加液氮磨成粉末狀，用DNeasyTissueKit(Qiagen公司)提取樣品DNA。表1菲律賓實蠅樣品信息tableseeoriginaldocumentpage5SH65由廣東出入境檢驗檢疫局梁帆研究員贈送。3、實時螢光PCR檢測實時螢光PCR擴增體系25uL(大連寶生物公司TaKaRareal-timePCRcorekit):5XrealtimePCRBuffer(Mg2+free)5uL,Mg2+solution(250mmol/L)0.5uL,dNTPmixture(各lOmmol/L)0.75uL,TaKaRaEx-TaqHS(5U/uL)0.25uL,上下遊引物G-FP/RP(10umol/L)各0.5uL，TaciMan-MGB探針(5umol/L)0.6uL，DNA(1020ng/uL)模板0.5uL,超純水補至25uL，實時螢光PCR擴增在ABIPRISM7700定量PCR擴增儀上進行。打開SequenceDetection1.71，設置PCR反應條件，兩步法擴增反應程序:50°C2min，預變性95°CIOmin；然後95°C15sec，60°CImin循環40次。點擊運行，進行PCR反應，Ih56min反應結束，保存文件，打開分析軟體，儀器自動分析實驗結果，給出△Rn(第η個循環時的螢光增加值)與循環數圖像。檢測結果如圖3所示，在圖3中，有6條上升的曲線(數字1-6曲線)，數字1_6曲線表示的樣品詳細信息如表1所示。在圖3中，1表示樣品編號為SH102的菲律賓實蠅樣品，2表示樣品編號為SH104的菲律賓實蠅樣品，3表示樣品編號為SH126的菲律賓實蠅樣品，4表示樣品編號為SH103的菲律賓實蠅樣品，5表示樣品編號為SH114的菲律賓實蠅樣品，6表示樣品編號為SH65的菲律賓實蠅樣品，7表示沒有模板DNA的陰性對照。由圖3表明此次實時螢光PCR檢測到的是菲律賓實蠅，表明引物G-FP/RP和探針G-MGB可以特異性檢測菲律賓實蠅。權利要求一種菲律賓實蠅的實時螢光PCR檢測方法，其特徵在於，包括如下步驟(1)設計引物和探針；該引物的序列為上遊引物G-FP5』-CGGGCTGTGGCACAAACTAT-3』(SEQIDNO.1)或其互補鏈；下遊引物G-RP5』-AACTCCGATTCACCTTCTGCAA-3』(SEQIDNO.2)或其互補鏈；該探針的序列為菲律賓實蠅探針G-MGBFCATTAGTTTTATTATCCTTTGTATTTP(SEQIDNO.3)或其互補鏈；(2)提取菲律賓實蠅DNA；(3)採用步驟(1)設計的引物和探針進行實時螢光PCR檢測。2.如權利要求1所述的菲律賓實蠅的實時螢光PCR檢測方法，其特徵在於，步驟(2)具體為取菲律賓實蠅單頭蟲樣放入研缽，加液氮磨成粉末狀，用試劑盒提取樣品DNA。3.如權利要求1所述的菲律賓實蠅的實時螢光PCR檢測方法，其特徵在於，步驟(3)中，所述實時螢光PCR檢測的反應體系為25μL，包括5XrealtimePCRBuffer5uL，Mg2+solution0.5uL，dNTPmixtureO.75uL,TaKaRaEx-TaqHSO.25uL，步驟(1)設計的上下遊引物G-FP/RP各0.5uL,TaqMan-MGB探針0.6uL,DNA模板0.5uL,超純水補至25uL。4.如權利要求1或3所述的菲律賓實蠅的實時螢光PCR檢測方法，其特徵在於，步驟⑶中，所述實時螢光PCR檢測的反應程序為50°C2min，預變性95°ClOmin;然後95°C15sec，60°CImin循環40次。5.一種用於檢測菲律賓實蠅的引物，其特徵在於，其序列為上遊引物G-FP:5，-CGGGCTGTGGCACAAACTAT-3，(SEQIDNO.1)或其互補鏈；下遊引物G-RP:5，-AACTCCGATTCACCTTCTGCAA-3，(SEQIDNO.2)或其互補鏈。6.一種用於檢測菲律賓實蠅的探針，其特徵在於，其序列為G-MGB:FCATTAGTTTTATTATCCTTTGTATTTP(SEQIDNO.3)或其互補鏈。全文摘要本發明公開了一種菲律賓實蠅的實時螢光PCR檢測方法及檢測用引物和探針，根據桔小實蠅、木瓜實蠅、楊桃實蠅和菲律賓實蠅(GenBank編號分別為DQ917577，DQ917578，EF014414，DQ995281)這幾個近似種的mtDNA中部分cob-nadh1基因的序列設計特異性引物G-FP/RP(上遊引物SEQIDNO.1所示序列，下遊引物SEQIDNO.2所示序列)和探針G-MGB(SEQIDNO.3所示序列)，建立了菲律賓實蠅的實時螢光PCR檢測方法，以達到快速準確檢測鑑定菲律賓實蠅的目的。文檔編號C12N15/11GK101805792SQ20101014242公開日2010年8月18日申請日期2010年4月8日優先權日2010年4月8日發明者葉軍,房蕊,易建平申請人:中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局