利用基因表達譜篩選動物不同組織差異基因的方法
2024-04-05 19:29:05 1
利用基因表達譜篩選動物不同組織差異基因的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用基因表達譜篩選動物不同組織差異基因的方法，採用全基因組表達譜晶片技術多通量篩選動物各組織差異基因和調控通路。本發明採用全基因組表達譜晶片結合生物信息學技術對動物不同組織樣品轉錄譜進行比對分析，篩選到了影響動物不同組織的一些重要基因和調控通路，得到不同組織間的差異表達基因、相應的基因功能注釋、信號通路和代謝通路，為從轉錄水平揭示動物不同組織間差異形成的分子機制提供依據。
【專利說明】利用基因表達譜篩選動物不同組織差異基因的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，尤其是一種利用基因表達譜篩選動物不同組織差異基因的方法。
【背景技術】
[0002]基因晶片是生物晶片的一種，經過標記的待測樣本DNA通過與晶片上特定位置的探針雜交，根據減基互補配對的原則確定IEDNA序列，經雷射共聚集顯微鏡掃描，以計算機系統對螢光信號進行比較和檢測，並迅速得出所需的信息，，從而對這些基因表達的個體特異性、組織特異性、發育階段特異性、分化階段特異性等進行綜合的分析和判斷，迅速將某個或幾個基因與性狀聯繫起來，極大地加快這些基因功能的確定，其最顯著的特點是高通量、高集成、微型化、多樣化和自動化。自1995年史丹福大學Schena等在美國《科學》雜誌發表第一篇利用基因晶片技術研究基因表達譜的文章以來以來，該技術在國內外引起廣泛關注和重視，近年來，以高密度基因晶片為核心的基因組學技術迅速發展，已廣泛應用到畜牧學等各個領域，展示出了其動物性狀關鍵功能基因篩選等方面巨大的市場開發潛力。
[0003]例如，牛肉是主要的畜產品之一，具有高蛋白、低脂肪、維生素及礦物質含量豐富，含有人類所必需胺基酸等特點，是一種營養價值較高的保健型食品。隨著人們膳食結構的不斷變化及對健康的日益關注，牛肉品質受到了前所未有的重視，優質、高檔牛肉供不應求。國內外已經有較多將晶片技術應用於牛上的研究。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是:提供一種利用基因表達譜篩選動物不同組織差異基因的方法，它具有靈敏度高、檢測數量多、操作簡單等優點。
[0005]本發明是這樣實現的:利用基因表達譜篩選動物不同組織差異基因的方法，採用全基因組表達譜晶片技術多通量篩選動物各組織差異基因和調控通路。
[0006]具體是，從屠宰的動物屍體上採集不同組織的樣品；分別從樣品上提取RNA，將提取的RNA純化獲得mRNA，再將mRNA反轉錄合成雙鏈cDNA，並純化；用生物素標記cRNA後，將其與全基因組表達譜芯進行雜交，然後進行掃描和分析，再將獲得的數據進行差異表達基因的篩選，最後採用實時螢光定量PCR技術進行驗證。
[0007]由於採用了上述技術方案，本發明採用全基因組表達譜晶片結合生物信息學技術對動物不同組織樣品轉錄譜進行比對分析，篩選到了影響動物不同組織的一些重要基因和調控通路，得到不同組織間的差異表達基因、相應的基因功能注釋、信號通路和代謝通路，為從轉錄水平揭示動物不同組織間差異形成的分子機制提供依據。本發明簡單可靠，成本低廉，使用效果好。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0008]附圖1為關嶺牛晶片數據結果的PCA分析；附圖1中右上角文字說明從上至下為:LD:背最長肌，Hindsin:後展肌，liver:肝臟，S1:小腸，Heart:心臟，adipose:月旨肪:
附圖2為組織特異表達基因cluster聚類，取信號值變異(CV)最大的前10000個基因做非監督聚類；
附圖2中檑坐標應為對應解釋為，Heart:心腫，LD:背最長肌，Hindsin:後展肌，liver:肝臟，S1:小腸，adipose:脂肪；縱坐標從上至下依次為，3.00,2.00，
1.00,-1.00,-2.00,-3.PO, Heart:心腫，LD:背最長肌，Hindsin:後展肌，liver:肝腫，S1:小腸，adipose:脂肪；
附圖3為組織特異表達基因cluster聚類，組織特異表達基因k-means聚類(6clusters,均值)；
附圖3中，橫坐標從左到右依次為:adipose:脂肪，S1:小腸，Heart:心臟，liver:肝)?, LD:背最長肌,Hindsin:後展肌:
附圖4為組織特異表達基因k-means聚類，組織特異表達基因k-means聚類(4clusters,均值)；
附圖4中，橫坐標從左到右依次為:adipose:脂肪，S1:小腸，Heart:心臟，liver:肝)?, LD:背最長肌,Hindsin:後展肌: 附圖5為組織特異表達基因k-means聚類，組織特異表達基因k-means聚類(4clusters,信號值)；
附圖5中，橫坐標從左到右依次為:adipose:脂肪，S1:小腸，Heart:心臟，liver:肝)?, LD:背最長肌,Hindsin:後展肌:
附圖6為clusters所屬基因的分子功能注釋，脂肪組織特異性表達基因的GO通路；附圖 6 中，B1logical process:牛.物過程，Cellular component:細胞組成，Molecular funct1n:分子功倉R:
附圖7為clusters所屬基因的分子功能注釋，小腸組織特異性表達基因的GO通路；附圖 7 中，B1logical process:牛.物過程，Cellular component:細胞組成，Molecular funct1n:分子功倉R:
附圖8為clusters所屬基因的分子功能注釋，心臟組織特異性表達基因的GO通路；附圖 8 中，B1logical process:牛.物過程，Cellular component:細胞組成，Molecular funct1n:分子功倉R:
附圖9為clusters所屬基因的分子功能注釋，肝臟組織特異性表達基因的GO通路；附圖 9 中，B1logical process:牛.物過程，Cellular component:細胞組成，Molecular funct1n:分子功倉R:
附圖10為為clusters所屬基因的分子功能注釋,組織特異性基因的KEGG pathway ；附圖 10 中，B1logical process:牛.物過程，Cellular component:細胞組成，Molecular funct1n:分子功倉R:
附圖11為qRT-PCR圖；
圖 11 中，(A) ucp3, (B) myhl, (C) ipoll, (D) mybpH, (E) myh3, (F) myoDI, (G)adpiο, (H) mybpcl, (I) myh8, (J) myh4, and (K) mstogenes are shown。
【具體實施方式】
[0009]本發明的實施例1:利用基因表達譜篩選動物不同組織差異基因的方法，包括以下步驟:
步驟I)材料的選擇:隨機選擇3頭遺傳背景相同、飼養環境相同的18月嶺的關嶺牛，所有實驗動物按照商業屠宰程序屠宰；動物屠宰後於迅速採集心臟、肝臟、後展肌、小腸、背最長肌、脂肪下丘腦、垂體等組織樣品，一部分置液氮迅速冷凍，另一部分置於RNAlater中保存，運輸至實驗室；使用晶片為牛全基因組晶片(GeneChip? Bovine Genome Array)；步驟2)RNA提取、cDNA合成:Trizol RNA試劑(Invitrogen公司)抽提總RNA,經紫外分光光度計(ND-1000, NanoDrop公司)和瓊脂糖凝膠電泳鑑定總RNA ;按照Qiagen公司說明書，經 RNeasy MinElute Cleanup Kit 純化得到 mRNA ;mRNA 經 Poly-A RNA Controlkit (Affymetrix公司)反轉錄合成雙鏈cDNA,並純化；
步驟3)生物素標記cRNA、雜交:以cDNA為模板，應用MessageAmpTM I1-B1tin ArnaAmplificat1n Kit (Amb1n公司)體外轉錄合成生物素標記cRNA,純化後按Affymetrix公司的真核生物表達譜單輪晶片擴增程序加入5X片段化緩衝液得到大小分布在35~200 nt的片段化cRNA ;祀標製備完成後，應用真核生物Hybridizat1n Control Kit(Affymetrix公司)配製雜交液，注入雜交液的晶片平衡放置於雜交爐中，45°C，60 r/min 旋轉雜交 16 h (Hybridizat1n Oven 640, Affymetrix 公司)，然後在 Affymetrix公司提供的洗漆工作站中(Fluidics Stat1n 450,Affymetrix公司)完成晶片的清洗染色；
步驟4)掃描和分析:應用GeneChip? Scanner 3000 (Affymetrix公司)掃描儀掃描圖像。掃描圖像首先用 GeneChip? Operating Software Vers1nl.4(GC0S 1.4,Affymetrix公司)軟體進行圖像到信號值的轉換，轉換成原始數據文件。然後使用軟體 dChip 2006 中的 invariant set Normalizat1n 方法和 Model-base Express1nIndex模型對GCOS輸出結果進行進一步的數據分析。根據在各晶片中檢測到的P值，當數據集的檢測值Call值(Absolute Call, Abs Call)為不存在A(Absent)或者臨界值M(Marginal)時，被視為不表達，只有Abs Call值為存在P (present)的數據集才被用於進一步的分析；
步驟5)牛各組織差異表達基因的篩選:差異表達基因的篩選利用SignificantAnalysis of Microarray Software (SAM)算法進行。聚類分析米用Spearman相關分析和平均連鎖層次聚類分析方法(Cluster 3.0)，並用Tree View工具來顯示聚類結果。功能富集類分析和調控通路分析以牛的GO terms註解信息(B1logical process)和通路為依據，在免費的分子注釋系統平臺(MAS 3.0，www.capitalb1.com)上進行；
步驟6)QRT-PCR:應用Primer Premier 5.0軟體設計引物，以與晶片雜交相同的總RNA為模板，qRT-PCR 採用 CFX96 real-time PCR 檢測系統(B1-Rad, Hercules, CA, USA)對樣品cDNA模板進行擴增、檢測和相對定量分析；相對定量選用β-actin作為內參基因，按照北京全氏金公司TransStart Green qPCR SuperMix UDG試劑盒使用說明配置反應體系；目的基因反應體系同內參基因β-actin，採用熱啟動模式:95 °C變性I min，然後40個循環包括95 °C變性30 s、58°C退火30 s、72 °C延伸I min，每次循環第三步進行螢光採集，最後95 °C變性I min，退火至58.9 °C保溫I min，每隔10s，上升0.5 °C，檢測螢光值，繪製融解曲線。內參基因與目的基因各設置3個待測樣品重複，同時設定空白對照。PCR結束後，取5μ L產物進行電泳檢測。
[0010]組織特異性基因引物序列如表1所示:
【權利要求】
1.一種利用基因表達譜篩選動物不同組織差異基因的方法，其特徵在於:採用全基因組表達譜晶片技術多通量篩選動物各組織差異基因和調控通路。
2.根據權利要求1所述的利用基因表達譜篩選動物不同組織差異基因的方法，其特徵在於:具體是，從屠宰的動物屍體上採集不同組織的樣品；分別從樣品上提取RNA，將提取的RNA純化獲得mRNA，再將mRNA反轉錄合成雙鏈cDNA，並純化；用生物素標記cRNA後，將其與全基因組表達譜芯進行雜交，然後進行掃描和分析，再將獲得的數據進行差異表達基因的篩選，最後採用實時 螢光定量PCR技術進行驗證。
【文檔編號】C12Q1/68GK104131069SQ201410094854
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年3月16日 優先權日:2014年3月16日
【發明者】許厚強, 陳偉, 劉忠偉, 陳祥, 趙佳福 申請人:貴州大學