用於微生物多樣性檢測校對的組合物和方法
2024-04-05 21:43:05
用於微生物多樣性檢測校對的組合物和方法
【專利摘要】本發明公開了一種用於微生物多樣性檢測校對的組合物，包括若干種微生物的rRNA序列，這些序列形成至少三個以上豐度梯度，各個豐度梯度差至少相差一個數量級。在rRNA通用引物對的配合下，可用於對微生物多樣性進行檢測和校對，實現對高通量測序的流程進行監控。
【專利說明】用於微生物多樣性檢測校對的組合物和方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種用於檢測的核苷酸組合物，具體涉及一種可作為標準樣的核苷酸組合物，在rRNA引物對的配合下，利用PCR技術對生物的核糖體RNA進行擴增，以實現對微生物的多樣性進行檢測和校對。
【背景技術】
[0002]微生物多樣性是微生物和它們組成的系統的總體多樣性和變異性，是地球生命賴以生存和持續發展的物質基礎，其大致可包括三個層次:基因多樣性、物種多樣性和生態系統多樣性。微生物多樣性的研究對資源的保護、合理開發和利用提供了科學依據。
[0003]傳統的微生物多樣性檢測採用分離培養的方法研究環境中的微生物組成及豐度，如:中國發明專利ZL200910214270.1。但已知98%的微生物無法在現有實驗條件下進行培養。現代分子生物學技術在微生物多樣性研究上的應用克服了微生物培養技術的限制。新一代的多樣性檢測，如:16S 核糖體 DNA (rDNA)測序(CN102399855 和 CN101445822)、DGGE/TGGE/TTGE (CN102382877)、T-RFLP (CN101724690)、SSCP、FISH、印記雜交、定量 PCR 和基因晶片等。其中，通過利用高通量測序技術，先對環境中的微生物群落整體進行核酸提取，使用通用引物對微生物rRNA中的高變區進行擴增，隨後進行後續的高通量測序和生物信息學分析，研究該樣品中的微生物組成，物種豐度，以及分類學和進化關係。
[0004]這種基於高通量測序的微生物多樣性檢測，是用物種特異的rRNA序列對應的測序序列條數來反映該微生物存在於環境中的豐度。由於環境樣品需要經過核酸提取，rRNA高變區擴增，樣品製備，上機測序和生物信息分析等實驗環節，流程較長。其中，rRNA高變區擴增步驟會引入一定程度的偏向性，所以需要一個標準樣品對整個流程進行監控，並進行必要的校準。
·[0005]Illumina公司推出的高通量測序內參標準樣品，由PhiX病毒基因組製成，主要用於文庫製備和上機測序質量的監控。PhiX病毒的基因組較小，且已經完成對其全序列的測定，所具有的各個鹼基的信息都已明確。如果測序產生的數據能夠通過拼接還原出PhiX病毒的基因組，就能說明文庫製備和上機測序情況良好。
[0006]Illumina的技術主要用於基因組相關的高通量測序。目前的高通量測序技術的應用越來越廣泛，不以基因組測序為目的的應用就不適用此技術。Illumina的標準樣品是用病毒基因組序列組成的，但微生物多樣性研究的主要是細菌，並且只針對核糖體RNA高變區進行測序和分析。Illumina的標準樣品不含有細菌核糖體RNA序列，並且僅為定性的對照，而無法用定量的方法對微生物多樣性的測序結果進行評判和校準。
【發明內容】
[0007]本發明的一個方面在於提供一種組合物，用於對生物多樣性進行檢測和校對。
[0008]本發明提供的組合物，包括若干種微生物的rRNA基因序列。這些有關的rRNA基因序列可從已公開論文、期刊和專利等出版物，以及網絡公共數據平臺，如=NCBI獲得。[0009]本發明所應用的微生物為細菌，尤其是SSU rRNA的基因序列區域(是否為該區域的全序列)。這些基因序列形成至少三個以上豐度梯度，各個豐度梯度差至少相差一個數量級，如:10倍、100倍、1,000倍和10，000倍等。
[0010]所應用的微生物數量至少為所設豐度梯度的整數倍。如:當豐度梯度為3時，至少包括3種微生物，或按3的整數倍重複，即6種微生物，或9種微生物，以此類推；再如:當豐度梯度為5時，至少包括5種微生物，或按5的整數倍重複，即10種微生物，或15種微生物，以此類推。
[0011]可選用的細菌如:節桿菌(Arthrobacter sp.)、芽孢桿菌(Bscillus sp.)、伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)、解環菌(Cycloclasticus sp.)、微桿菌(Microbacteriumsp.)、小雙抱菌(Microbispora sp.)、類諾卡氏菌(Nocardioides sp.)、類芽抱桿菌(Paenibacillus sp.)、副球菌(Paracoccus sp.)、土微菌(Pedomicrobium sp.)、青枯菌(Ralstonia sp.)、紅球菌(Rhodococcus sp.)、葡萄球菌(Staphylococcus sp.)、亞硫酸鹽桿菌(Sulfitobacter sp.)和黃單胞菌(Xanthomonas sp.),以及其它各類常見的細菌，如纖維桿菌門細菌(Fibrobacteres),螺旋體門細菌(Spirochaetes),酸桿菌門細菌(Acidobacteria),梭桿菌門細菌(Fusobacria),芽單胞菌門(Gemm),黃桿菌門(Flteria),厚壁菌門(Firmicutes),產金菌門(Chrysiogenetes),硝化螺旋菌門(Nitrospirae)等。
[0012]一種具體的實施方式，本發明提供的組合物，包括若干種微生物的SSU rRNA，這些基因序列形成五個豐 度梯度，各個相鄰豐度梯度相差10倍。該15種微生物為:節桿菌、芽孢桿菌、伯克霍爾德氏菌、解環菌、微桿菌、小雙孢菌、類諾卡氏菌、類芽孢桿菌、副球菌、土微菌、青枯菌、紅球菌、葡萄球菌、亞硫酸鹽桿菌和黃單胞菌。
[0013]本發明的另一個方面在於提供一種標準對照樣或對照試劑盒，包括上述組合物與至少一組rRNA引物對，用於對生物多樣性進行檢測和校對，實現對高通量測序的流程進行監控。
[0014]這些引物對為擴增rRNA基因序列的通用引物對至少包括一條正向引物(ForwardPrimer, F)和一條反相引物(Reverse Primer, R),技術人員可從已公開的專利和文獻中獲得，如:Symbiosis2009, 49，163-180 ；Appl.Environ.Microb.，1997，63，3327 - 3332 ；Appl.Environ.Microb., 1997,63,2593-2599 ；Eur.J.Phycol.,2005, 40, 363-378 ；J.Bacteriol., 1991, 173, 697-703 ；J.Bacteriol., 1998, 180, 3453-3461 ；J.Eukaryot.Microbiol., 1999, 46, 327-338,以及 Nucleic acid techniques in bacterialsystematics, John Wiley and Sons, New York, NY, 1991，115-175。也可以在 rRNA 基因序列的基礎上，通過現有的常用軟體(Primer Premier6.0,或Oligo等)進行設計而得。
[0015]另一種具體的實施方式，本發明提供的標準對照樣或對照試劑盒，包括若干種微生物的SSU rRNA和至少一組rRNA通用引物對。這些SSU rRNA基因序列形成五個豐度梯度，各個相鄰豐度梯度相差一個數量級(即10倍)。豐度最高的序列和豐度最低的序列相差4個數量級(即一萬倍)。微生物種類至少為所設豐度梯度的1-5整數倍，如:1、2、3、4和5。
[0016]該標準對照樣或對照試劑盒中，還包括三組平行試樣，保證實驗的準確性和穩定性。
[0017]本發明的另一個方面在於提供一種對生物多樣性進行檢測和校對的方法，以相同的引物對同時對含有若干種微生物的rRNA基因序列的樣品進行擴增，實現對高通量測序的流程進行監控。
[0018]另一種具體的實施方式，本發明提供的對微生物多樣性進行檢測和校對的方法，以rRNA通用引物對同時對含有若干種微生物的rRNA基因序列的樣品進行擴增，將所得產物建庫，並進行高通量測序，與樣品中的rRNA區域進行基因序列比對，將所得出的各個菌種對應的測序序列條數代表其經過擴增及測序後的相應豐度，所得豐度與樣品中各個微生物所含序列的原始豐度具有相關性(如:成線性正相關)。
[0019]另一種具體的實施方式，本發明提供的對生物多樣性進行檢測和校對的方法，以rRNA通用引物對同時對由15種微生物的SSU rRNA基因序列形成的五個豐度梯度的樣品進行擴增，將所得產物建庫，並進行高通量測序，與樣品中的SSU rRNA區域進行基因序列比對，將所得出的各個菌種對應的測序序列條數代表其經過擴增及測序後的相應豐度，所得豐度與樣品中各個微生物所含序列的原始豐度成正比。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1是標準樣中各菌種的原始豐度與其測序條數的相關性；
[0021]圖2是三次平行實驗給出的實驗結果，其中「各菌種對應的測序條數」值為各菌種對應的測序條數的常用對數值(請確認);
[0022]圖3是標準樣曲線I;
[0023]圖4是標準樣曲線2。
【具體實施方式】
[0024]本發明如下實施例使用15種不同的細菌rRNA基因的SSU區域，並按照如下表1所列濃度用微型螢光計TBS-380定量後混合。
`[0025]表1標準組合物所涉菌種及其相應的豐度
【權利要求】
1.一種組合物，其特徵是包括若干種微生物的rRNA基因序列，所述各個基因序列形成至少三個以上豐度梯度，各個豐度梯度差至少相差一個數量級。
2.根據權利要求1所述的組合物，其特徵是所述的微生物為細菌。
3.根據權利要求1所述的組合物，其特徵是所述的微生物選自於節桿菌、芽孢桿菌、伯克霍爾德氏菌、解環菌、微桿菌、小雙孢菌、類諾卡氏菌、類芽孢桿菌、副球菌、土微菌、青枯菌、紅球菌、葡萄球菌、亞硫酸鹽桿菌和黃單胞菌。
4.根據權利要求1所述的組合物，其特徵是所述的rRNA為SSUrRNA。
5.根據權利要求1所述的組合物，其特徵是所述的豐度梯度為5，各個相鄰豐度梯度相差一個數量級。
6.—種對照試劑盒,其特徵是包括權利要求1-5之一所述的組合物和至少一組rRNA通用引物對。
7.根據權利要求6所述的對照試劑盒，其特徵是所述的rRNA通用引物對選自於為SEQID Nol-SEQ ID No29。
8.一種對微生物多樣性進行檢測和校對的方法，以rRNA通用引物對同時對含有權利要求1-5所述的組合物的樣品進行擴增，將所得產物建庫，並進行高通量測序，與樣品中的rRNA基因序列進行比對，將所得出的各個菌種對應的測序序列條數代表其經過擴增及測序後的相應豐度，所得豐度與樣品中各個微生物所含序列的原始豐度具有相關性。
9.根據權 利要求8所述的對生物多樣性進行檢測和校對的方法，其特徵是所述的rRNA通用引物對選自於為SEQ ID Nol-SEQ ID No29。
【文檔編號】C12Q1/68GK103589789SQ201310504059
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月23日 優先權日:2013年10月23日
【發明者】楊功達, 林芹, 胡秋萍, 張祥林 申請人:上海美吉生物醫藥科技有限公司