一種毛細管電泳檢測蛋白多肽相互作用的方法

2024-04-03 05:56:05

專利名稱：一種毛細管電泳檢測蛋白多肽相互作用的方法
技術領域：
本發明涉及生物分析領域，特別涉及一種毛細管電泳檢測蛋白多肽相互作用的方法。
背景技術：
主要組織相容性複合體蛋白(MHC)由主要組織相容性複合體編碼，廣泛存在於脊椎動物細胞表面的一個糖蛋白分子大家族。MHC表面有一溝，可與外來抗原的肽鏈結合，將其提呈給T細胞引起免疫反應。因此研究MHC與蛋白的相互作用對於研究一些疾病的致病機制非常重要。人類白細胞抗原DQ2蛋白(DQ2)是MHC很重要的一種蛋白。生物分析技術在揭示MHC蛋白和多肽的相互作用中起到了至關重要的作用。目 前研究MHC蛋白與多肽相互作用的方法主要有高效凝膠過濾色譜法(HPSEC) (B. J.McFarland, J. F. Katz, A. J. Sant, et al. J. Mol. Biol. 2005, 350, 170-183),突光偏振法(S. L. De Wall, C. Painter, J. D. Stone, et al. Nat. Chem. Biol. 2006,
2,197-201),核磁共振法(L. Schmitt, J. J. Boniface, Μ. M. Davis, et al. J. Mol.Biol. 1999，286，207-218)等。然而，現在大多數的分析方法只能測量單個多肽和MHC蛋白的結合過程，而無法反應在生物體內的抗原遞呈過程的複雜性一細胞內源多肽和外源抗原同時存在的這種競爭關係。毛細管電泳(CE)具有高效、高速、微量、低消耗、操作模式多，分離方法開發容易等優點，由於具備如此多的優點以及分離生物大分子的能力，CE成為近年來發展最迅速的分離分析方法之一。尤其是將螢光檢測與毛細管電泳相結合，大大提高了檢測限，拓展了毛細管電泳的應用。本試驗建立的多肽配體和HLA-DQ2蛋白相互作用的檢測方法，克服了已有方法存在的缺陷，可滿足大批量檢測需要，適用範圍較廣，有較高的精確性及較好的穩定性。

發明內容
本發明要解決的技術問題是為了克服現有技術對蛋白多肽相互作用檢測的不足，本發明提供一種毛細管電泳檢測蛋白多肽相互作用的方法。本發明解決其技術問題所採用的技術方案是一種毛細管電泳檢測蛋白多肽相互作用的方法，首先將DQ2與凝血酶混合，切除DQ2上的α I多肽(LQPFPQPELPY，SEQIDN0. I)。將外源多肽I螢光標記後與DQ2混合，然後進行毛細管電泳檢測，同時檢測蛋白多肽複合物和螢光多肽的出峰時間及螢光強度；將SDQ2_Pep/STotal作為Y軸，以時間為X軸，得到DQ2與多肽結合的曲線。其中SDQ2_Pep是DQ2多肽複合物的螢光峰面積積分，Slotal是整個電泳普通的螢光峰面積積分。本發明方法中所述的毛細管電泳檢測中，電泳緩衝液優選為25 mM硼酸緩衝液，PH9.3。所述硼酸緩衝液經O. 22 μ m濾膜過濾。本發明的方法還可以同時檢測不同外源多肽及不同外源多肽與DQ2的競爭關係。例如，當外源多肽為兩種時，將兩種不同螢光分子標記的外源多肽I和外源多肽2與DQ2混合，進行毛細管電泳檢測，分別記錄兩種螢光標記物的螢光變化。將蛋白與多肽混合後，可根據毛細管電泳譜圖的變化檢測蛋白多肽相互作用。該方法還可以檢測兩種外源多肽與蛋白相互作用的競爭過程。實驗證明，該方法操作簡單，檢測靈敏度高，所需時間短；可同時檢測多個螢光波長，從而減少了誤差，提高了檢測的準確性。該方法是對傳統蛋白多肽相互作用檢測技術進行改進，結合多波長螢光檢測靈敏度高等優點，建立的一種新的高靈敏蛋白多肽相互作用檢測技術。


下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。圖I DQ2與外源多肽相互作用示意圖。
圖2毛細管電泳螢光檢測DQ2與多肽P印2的相互作用。其中，a是P印2的電泳 譜圖；b是DQ2與P印2混合物的電泳譜圖，DQ2/Pep2=l: 10 ;c是DQ2與P印2混合物的電泳譜圖，002外印2=10:1。激發光源λ ex=490 nm。圖3毛細管電泳螢光檢測DQ2與多肽P印I的相互作用。其中，a是P印I的電泳譜圖山是002與？印1混合物的電泳譜圖，002外印2=10:1。激發光源λ ex=490 nm。圖4毛細管電泳同時螢光檢測兩種外源多肽P印2和P印3與DQ2的相互作用。P印2的檢測波長為520 nm (檢測FAM)，P印3的檢測波長為670 nm (檢測Cy5),DQ2:Pep2:Pep3=10:1:1,激發光源 λ ex=490 nm。圖5毛細管電泳螢光檢測P印3多肽與DQ2相互作用的動力學。A，是P印3與DQ2混合後不同時間檢測的毛細管電泳譜圖是SDQ2_Pep3/STtal隨時間變化的曲線。
具體實施例方式現在結合附圖對本發明作進一步詳細的說明。本發明原理如圖I所示，下述實施例中具體操作流程如下
I、首先將DQ2與凝血酶混合，切除DQ2上的α I多肽。2、將螢光標記的外源多肽與步驟I中切除了 α I多肽的DQ2混合。3、進行毛細管電泳檢測
電泳緩衝液:為25 mM硼酸緩衝液(ρΗ9. 3)；
毛細管為未塗層毛細管(內徑75 μ m，長度60 cm，有效長度35 cm)。電泳檢測進樣電壓12 KV，進樣10 S，然後停止加壓。分離電壓18 KV，分離10min，可同時檢測多個通道的螢光強度，收集、分析得到相應的檢測結果。4、將SDQ2_Pep/STtal作為Y軸，以時間為X軸，得到DQ2與多肽結合的曲線。其中SDQ2-Pep是DQ2多肽複合物的螢光峰面積積分，Slotal是整個電泳普通的螢光峰面積積分。DQ2可通過現有技術獲得，例如可按照文獻的方法製備(/辦？ Chem Soc 2006;128: 1859-1867)。也可以通過下述方法得到2升High-Five細胞(濃度為2_2. 5 r IO6個/毫升)首先用杆狀病毒感染(感染複數MOI為3-5)，4天後離心30分鐘收集上清液。可溶性DQ2分子通過蛋白A-瓊脂糖凝膠柱純化，並用pHll. 5的緩衝液(含有50mM 二乙胺，O. 15M NaCl和2M Tris)洗脫。實施例I
實例中使用的儀器及操作條件如下
所用毛細管電泳為基於螢光顯微鏡自搭毛細管電泳系統，高壓電源為上海核物理研究所生產；螢光光譜儀為海洋光學QE65000 ;自製顯微鏡接口，將顯微鏡標準口的螢光通過光纖導入光譜儀。採用電壓進樣，進樣電壓12 KV，進樣時間為10 S，電泳電壓為18 KV，電泳10 min。圖2為用毛細管電泳螢光檢測DQ2與多肽P印2的相互作用。P印2序列為MATPLLMQALPMGALPQ (SEQ ID NO. 3)，用羧基螢光素(FAM)標記；實驗結果表明，DQ2與多肽P印2的相互作用後在約500 s產生一個新的螢光峰，而多肽的峰明顯減弱，因此該方法可以用來檢測DQ2與多肽的相互作用。 實施例2
實驗條件同實施例1，區別在用毛細管電泳檢測外源多肽P印I與DQ2的相互作用，外源多肽P印I序列為FAM-PVSKMRMATPLLMQA(SEQ ID NO. 2)，用FAM標記。檢測結果如圖3所示，DQ2與多肽P印I的相互作用後產生一個新的螢光峰，證明外源多肽P印I可以與DQ2相
互作用。實施例3
實驗條件同實施例1，區別在用毛細管電泳同時檢測兩種外源多肽P印2和P印3與DQ2的相互作用，外源多肽P印2用FAM標記；外源多肽P印3序列為LQLQPFPQPELPYPQPELPY(SEQID NO. 4),用近紅外菁類染料(Cy5)標記。如圖4所示。實驗結果表明，在同一光源激發下，可同時檢測兩種外源多肽與DQ2的相互作用。實施例4
實驗條件同實施例1，區別在用毛細管電泳檢測P印3多肽(用Cy5標記)與DQ2相互作用的動力學，如圖5所示。實驗結果表明，DQ2與Pep3複合物的電泳峰(圖5A，約520 S)，隨時間的增加而逐漸增加。因此可通過毛細管電泳檢測DQ2與外源多肽的結合過程。通過上述四個實施例可以看出，本發明的一種毛細管電泳檢測蛋白多肽相互作用的方法可以實現蛋白多肽相互作用檢測，並且靈敏度高，操作方便，結果準確。以上述依據本發明的理想實施例為啟示，通過上述的說明內容，相關工作人員完全可以在不偏離本項發明技術思想的範圍內，進行多樣的變更以及修改。本項發明的技術性範圍並不局限於說明書上的內容，必須要根據權利要求範圍來確定其技術性範圍。
權利要求
1.一種毛細管電泳檢測蛋白多肽相互作用的方法，其特徵在於包括以下步驟先將DQ2與凝血酶混合，切除DQ2上的α I多肽；再與經螢光標記的外源多肽混合得混合物，然後對混合物進行毛細管電泳螢光檢測，同時檢測混合物中DQ2-多肽複合物和外源多肽的出峰時間及螢光強度，得出DQ2與外源多肽結合的曲線。
2.如權利要求I所述的一種毛細管電泳檢測蛋白多肽相互作用的方法，其特徵在於所述外源多肽為兩種或兩種以上，不同的外源多肽分別用不同的螢光分子標記，進行毛細管電泳檢測，分別記錄不同螢光標記物的螢光變化。
3.如權利要求I所述的一種毛細管電泳檢測蛋白多肽相互作用的方法，其特徵在於所述的毛細管電泳檢測中，電泳緩衝液為25 mM硼酸緩衝液，ρΗ9. 3。
4.如權利要求3所述的一種毛細管電泳檢測蛋白多肽相互作用的方法，其特徵在於所述硼酸緩衝液經O. 22 μ m濾膜過濾。
5.如權利要求I所述的一種毛細管電泳檢測蛋白多肽相互作用的方法，其特徵在於所述的外源多肽為DQ2的抗原多肽P印I和/或和/或；所述P印I、Pep2和P印3的序列分別如SEQ ID NO. 1-3所示。
全文摘要
本發明涉及一種毛細管電泳檢測蛋白多肽相互作用的方法，屬於生物分析領域。首先將DQ2與凝血酶混合，切除DQ2上的αI多肽(LQPFPQPELPY)。將外源多肽螢光標記後與DQ2混合，然後進行毛細管電泳檢測，同時檢測蛋白多肽複合物和螢光多肽的出峰時間及螢光強度。該方法還可以同時檢測兩種外源多肽與蛋白相互作用的競爭過程。實驗證明，該方法操作簡單，檢測靈敏度高，所需時間短。該方法是對傳統蛋白多肽相互作用檢測技術進行改進，結合多波長螢光檢測靈敏度高等優點，建立的一種新的高靈敏蛋白多肽相互作用檢測技術。
文檔編號G01N21/64GK102890074SQ20121039008
公開日2013年1月23日 申請日期2012年10月15日 優先權日2012年10月15日
發明者王建浩, 邱琳, 蔣鵬舉, 王車禮, 夏江 申請人:常州大學